Localização e quantificação relativa de nanotubos de carbono em células com citometria de fluxo de imagem multiespectral

O objetivo geral do experimento a seguir é fornecer um método nanometrológico para monitorar e quantificar a absorção celular de nanotubos de carbono em um número estatisticamente relevante de células. Isso é conseguido primeiro tratando as células com nanotubos de carbono dispersíveis em água, que entram nas células de maneira dependente da concentração. Esses nanotubos de carbono são eventualmente marcados com um marcador fluorescente.

Então, após a fixação, cada célula é fotografada no campo claro, campo escuro e canais fluorescentes de um fluxo de imagem multiespectral. Citômetro. Para visualizar a distribuição dos nanotubos de carbono e o nível de absorção de luz, luz espalhada e fluorescência, a marcação do nanotubo induz em cada célula pixel por pixel. Em última análise, a absorção e dispersão intrínseca de luz dentro das células permite a localização e quantificação dos nanotubos de carbono.

Portanto, este método pode ajudar a responder a novas questões nos campos da nanotoxicologia e da nanomedicina, como o impacto e o destino dos materiais à base de carbono em células vivas, e também o potencial dos nanotubos de carbono como um sistema de entrega de medicamentos. Em seguida, sonicar os nanotubos em um sonicado de água de banho a 20 graus Celsius por 20 minutos. Em seguida, dilua os nanotubos em concentrações de 0, 10, 20 e 50 microgramas por mililitro em meio completo e, em seguida, incube dois mililitros de cada diluição com as células de interesse em 1 placa de 25 centímetros quadrados por diluição a 37 graus Celsius após 20 horas, remova o meio de incubação de cada placa e enxágue as células marcadas com nanotubo de carbono com PBS.

Após a lavagem, a tripsina olha as células em cada placa e depois as ressuspende em meio DMEM completo. Em seguida, transfira cada amostra para tubos de falcão individuais de 15 mililitros e, em seguida, gire as células por cinco minutos a 200 vezes G e temperatura ambiente. Ressuspenda cada pellet em 4% de formaldeído a quatro graus Celsius por uma hora.

Após a fixação, gire as células para baixo novamente e ressuspenda cada amostra peletizada em 15 vezes 10 para as quintas células em 150 microlitros de PBS. Em seguida, filtre as amostras através de filtros de malha individuais de 50 mícrons para adquirir imagens das células com um fluxo de imagem. Citômetro de fluxo de imagem multiespectral.

Primeiro, selecione uma ampliação adaptada e, em seguida, amostras de imagem de interesse. Use um laser de 685 nanômetros para obter imagens do campo escuro e definir o citômetro de fluxo. Canal número seis para coletar a emissão de campo escuro em uma passagem de banda de 745 a 800 nanômetros.

Visualize as amostras nos canais de campo claro número um e campo escuro número seis para análise de imagem. Primeiro, crie um gráfico de pontos paramétrico com uma proporção de largura por altura versus a área da célula. Isso permite a discriminação das células individuais que têm uma área padrão e proporção próxima a uma dos eventos multicelulares, que têm uma grande área e uma pequena proporção, e os detritos que exibem uma área extremamente pequena.

Depois de usar as imagens de células para verificar se as células individuais foram selecionadas corretamente, configure um gráfico de pontos biparamétrico para células marcadas com nanotubos de carbono altamente contrastados, plotando o contraste em relação ao gradiente quadrático médio da raiz para permitir a exclusão da raiz baixa, gradiente quadrado médio, células desfocadas de baixo contraste e a seleção das células no plano focado. Em seguida, use a ferramenta localizar o melhor recurso para determinar o parâmetro que fornece a melhor separação estatística entre as células rotuladas e não rotuladas. Por exemplo, para este experimento representativo, o recurso de objeto de pixel médio é o mais adequado.

Em seguida, plote esse parâmetro em relação à frequência normalizada para traçar um histograma para quantificação dos nanotubos absorvidos pelas células em cada concentração experimental. Agora plote um gráfico biparamétrico para o objeto de pixel médio no campo claro versus a intensidade no campo escuro. Para verificar a correlação entre esses dois parâmetros, a quantificação do nanotubo também é avaliada por meio da criação de imagens nas células, pois os nanotubos de carbono aparecem como manchas escuras intensas No canal Brightfield, selecione uma faixa restrita de pixels com baixa intensidade, por exemplo, entre zero e 533 para criar a máscara de limiar, um que se encaixa nos nanotubos escuros precisamente para criar uma segunda máscara denotada máscara dois para visualizar os nanotubos que aparecem brilhantes no canal de campo escuro.

Selecione um intervalo de pixels com alta intensidade. Por exemplo, um intervalo de 150 a 4.095 foi escolhido para este experimento. Em seguida, usando a área da máscara de campo claro um ou da máscara de campo escuro dois, configure um gráfico de pontos para quantificar a internalização relativa dos nanotubos.

Por exemplo, plote a área no canal seis correspondente ao campo escuro com a máscara dois contra a área no canal um, correspondente ao campo claro com máscara um. Depois de determinar a correlação linear entre a máscara um e a máscara dois, visualize os nanotubos dentro do citoplasma criando primeiro uma máscara de toda a célula e, em seguida, corroendo a máscara. Agora denotado erodir M 0 1 7 por sete pixels para ver o interior da célula.

Para visualizar os nanotubos de carbono dentro da membrana celular, use a equação booleana M zero um e não corroa M 0 1 7. Essa é a máscara de toda a célula, subtraída do interior da célula para criar uma máscara da membrana apenas para avaliar os pixels escuros na membrana. Aplique a máscara de campo claro na máscara de membrana.

Aplique todas essas máscaras a várias células ao mesmo tempo para confirmar a distinção entre as amostras rotuladas e não rotuladas. Em seguida, selecione os pixels pretos na membrana com a ferramenta de área de recurso para quantificar os nanotubos de carbono na membrana celular. Finalmente, discriminar os nanotubos de carbono que foram internalizados daqueles que foram absorvidos pela membrana.

Plotagem, a área preta da membrana contra a área preta de toda a célula. Depois que todos os gráficos tiverem sido criados para uma condição experimental, crie um modelo de relatório estatístico. Salve o modelo como um arquivo A ST e agrupe todos os arquivos de dados.

O dispositivo de fluxo de imagem produz várias imagens de alta resolução de cada célula no citômetro de fluxo, incluindo canais de campo claro, campo escuro e fluorescência, conforme demonstrado aqui com três células marcadas com nanotubos diferentes. As sobreposições desses canais também são mostradas. A presença de nanotubos de carbono induz mudanças tanto no contraste quanto no gradiente das células marcadas em comparação com as células não marcadas.

Assim, a criação de um gráfico de pontos biparamétrico é importante para selecionar as células de foco. As células desfocadas em amarelo podem ser discriminadas por seu baixo contraste e baixo gradiente quadrático médio, independentemente da presença ou ausência de marcação de nanotubos. As células focais não marcadas também exibem um baixo contraste, mas demonstram uma raiz alta, gradiente quadrado médio quando as células focais são marcadas com nanotubos, no entanto, as células demonstram um perfil de gradiente quadrado médio de alto contraste, raiz baixa.

Os nanotubos de carbono internalizados são facilmente distinguidos, particularmente no canal Brightfield, onde aparecem como manchas escuras intensas, cujas áreas aumentam com a concentração de nanotubos. Quando os sinais médios de pixel das imagens de campo claro são analisados, uma quantificação relativa da captação do nanotubo pode ser determinada. Por exemplo, esses histogramas demonstram o aumento significativo na absorção de nanotubos que ocorre a cada aumento na concentração de marcação de nanotubos, pois a quantificação de nanotubos de carbono demonstrada também é possível através do uso de máscaras aplicadas em uma faixa restrita de pixels escuros dentro de uma imagem de campo claro ou dentro dos pixels de alta intensidade dentro do campo escuro, correspondendo às áreas onde os nanotubos estão presentes.

Traçar a área dessas máscaras permite uma maior quantificação da absorção de nanotubos de carbono. Além disso, a correlação entre os pontos nas imagens de campo claro e escuro pode ser avaliada plotando a intensidade do campo escuro versus o sinal médio de pixel do campo claro, ou plotando a área da máscara dentro do campo claro versus a área dentro do campo escuro. Nas próximas duas figuras, são mostradas análises dos nanotubos de carbono localizados no interior da célula.

Essas primeiras imagens demonstram as diferentes máscaras que foram criadas. Observe que a robustez das máscaras de localização com base na erosão da máscara de célula padrão deve ser verificada visualmente na coleção das células rotuladas e não rotuladas. Como acabamos de demonstrar nesses gráficos de pontos, a área total dos pontos pretos na membrana celular versus a de toda a célula foi plotada para determinar a pontuação de internalização.

Para células que foram incubadas por 20 horas a 37 graus Celsius em comparação com células que foram incubadas por duas horas a quatro graus Celsius a quatro graus Celsius, os nanotubos de carbono são encontrados principalmente localizados na membrana, enquanto a 37 graus Celsius, os nanotubos de carbono são internalizados em mais de 90% das células. A fluorescência do nanotubo de carbono não é um bom indicador da internalização do nanotubo de carbono devido a uma correlação muito baixa entre os pontos fluorescentes e os pontos dentro dos canais de campo claro e escuro. De fato, a correlação entre a intensidade de Fitzy e o pixel médio do campo claro indica um coeficiente de correlação de Pearson de menos 0,2.

Conforme demonstrado nessas imagens, o sinal fluorescente não corresponde de forma confiável aos pontos pretos de campo claro, nanotubos de carbono, confinamento e agregação dentro dos lisossomos intracelulares parcialmente extinguíveis do sinal fluorescente. Em contraste, nanotubos dispersos podem fornecer um sinal fluorescente mais confiável após seu desenvolvimento. Esta técnica abre caminho para pesquisadores no campo da nanotecnologia e nanomedicina explorarem a interação de células vivas com nanomateriais à base de carbono ou quaisquer nanomateriais com alta capacidade de absorção e espalhamento de vida usando um método estatístico de citometria de alto rendimento.