Name: Localização e quantificação relativa de nanotubos de carbono em células com citometria de fluxo de imagem multiespectral (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-12-12T13:15:00.000+00:00
Duration: 14 min 9 s
Description: Aprenda a localizar e quantificar nanotubos de carbono em células usando citometria de fluxo de imagem multiespectral. Este método permite analisar a internalização celular de forma estatisticamente relevante para estudos de nanotoxicologia.

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Este trabalho foi apoiado pela ANR P2N (Noutro projeto 2010-NANO-008-04), pela Região Ile de France (contrato nº E539) e pelo CNRS. O Acesso Aberto foi pago pela EMD Millipore.

1. Preparação de Nanotubos de Carbono Dispersíveis em Água (CNTs)
<ol>
	<li>Dispersar os primeiros NTC em água de cultura de células, antes de os sonicar durante 20 minutos num sonicador de água de banho a 20 °C. Se os CNTs forem funcionalizados com uma sonda fluorescente, proteja-os o máximo possível da luz durante todo o experimento.</li>
</ol>
2. Rotulando células com CNTs
<ol>
	<li>Cultivar células endoteliais da veia umbilical humana (HUVEC) (por exemplo) em placas de 25 cm² em meio DMEM, contendo 10% de soro fetal bovino e 1% de estreptomicina de penicilina.</li>
	<li>Preparar soluções de NTC nas concentrações de 0, 10, 20 e 50 μg/ml em meio completo e incubar células a 37 °C durante 20 horas ou a 4 °C durante 20 horas (2 ml de suspensão de NTC para uma placa de 25 cm²).</li>
</ol>
3. Fixação Celular
<ol>
	<li>Remova o meio de incubação depois; lave as células com PBS, tripsinize e ressuspenda as células em meio DMEM completo. Centrifugue por 5 min a 1.200 rpm.</li>
	<li>Substitua o meio primeiro por paraformaldeído a 4% por 1 hora a 4 ° C e, em seguida, por PBS para preservá-los. Se necessário, as células podem ser armazenadas nesta fase do processo a 4 °C durante vários dias até à análise citométrica.</li>
	<li>Cada amostra deve conter cerca de 106 células concentradas em 50 μl de PBS. Suspenda-os corretamente para evitar agregados durante a análise e filtre-os através de um corante de malha de 50 μm. 
	Nota: Cada etapa deve ser executada com muito cuidado para preservar as células.</li>
</ol>
4. Aquisição do ImageStream
Use o citômetro de fluxo de imagem multiespectral ImageStream para adquirir imagens de células. 
Alguns pontos devem ser respeitados:
<ol>
	<li>Selecione uma ampliação adaptada (aqui uma objetiva de 40X é usada).</li>
	<li>Se forem usados fluorocromos: 
	- preparar uma amostra de controle sem fluorocromo. 
	- Prepare as células com um controle positivo de cor única para cada fluorocromo usado em 
	adição às suas amostras.</li>
	<li>Use o laser 488 nm para excitar o FITC e o canal 02 para coletar a emissão de fluorescência (passa-banda 480-560 nm). Além disso, use também os canais 01 e 06 para o campo claro (BF) e campo escuro (DF), respectivamente.</li>
</ol>
5. Pós-processamento - Software de análise IDEAS (versão 4.0)
<ol>
	<li>Entre todos os eventos adquiridos, a análise deve ser restrita primeiro à população de células individuais: use um gráfico de pontos biparamétrico representando 'proporção' (ou seja, largura/altura) versus 'área da célula' (parâmetros aplicados em células em BF) (Figura 1). As células individuais incluídas na região de interesse com uma área padrão e proporção próxima a 1 são então discriminadas de eventos multicelulares (grande área e pequena proporção) e detritos (área extremamente pequena).</li>
	<li>Para selecionar células no plano focado, use um gráfico de pontos biparamétrico adaptado para células marcadas com CNTs altamente contrastadas: plote o 'contraste' versus o 'gradiente RMS' (que mede a qualidade da nitidez de uma imagem) na imagem BF - permite a exclusão de células desfocadas mostrando um gradiente rms baixo e um baixo contraste em suas imagens BF (Figura 1).</li>
	<li>
	<ol>
		<li>Determine o parâmetro que fornece a melhor separação estatística entre células rotuladas e não rotuladas usando o "encontre o melhor recurso". Em nosso estudo, a característica média do objeto de pixel é o parâmetro mais adequado (Figura 2).</li>
		<li>Trace um histograma usando este parâmetro versus a frequência normalizada para comparar a quantidade de CNTs captados para concentrações testadas (Figura 3).</li>
		<li>Traçar o gráfico biparamétrico 'objeto médio de pixel em BF' (Notação: Pixel_Object médio (M01,Ch01,Tight)_Ch01) versus 'intensidade em DF'(Intensity_MC_Ch06), a fim de estudar a correlação entre esses dois parâmetros (Figura 4).</li>
	</ol>
	</li>
	<li>A quantificação também é avaliada por meio de máscaras:
	<ol>
		<li>Como os NTCs aparecem como manchas escuras fortemente absorventes no BF, crie primeiro uma máscara de limiar que se ajuste a eles com precisão, selecionando uma faixa restrita de pixels com baixa intensidade compreendida entre 0-533 neste estudo (Máscara 1, notação: Intensidade (M01, BF, 0-533)) (Figura 5). A escolha da intensidade do limiar é feita nas células marcadas em comparação com as células de controle.</li>
		<li>Por outro lado, crie também um ajuste de máscara com os pixels de alta intensidade (150-4095 neste caso) do DF (Máscara 2, notação: Intensidade (M06, DF, 150-4095)) (Figura 6).</li>
		<li>Plote um gráfico usando a área da máscara (1 ou 2; (notação: Area_Intensity(M01, BF, 0-533)para máscara 1): fornecerá uma quantificação relativa da internalização de NTCs em diferentes concentrações (Figura 7).</li>
		<li>Verifique o grau de correlação entre essas duas máscaras (graças ao gráfico biparamétrico 'área da Máscara 1' versus 'área da Máscara 2') (Figura 7).</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Crie outras máscaras para localizar CNTs em células:
	<ol>
		<li>Uma máscara que se ajusta ao interior da célula: Erodir(M01, 7) - correspondendo à máscara de toda a célula (M01) (Figura 8), que é ainda mais erodida de 7 pixels (Figura 9).</li>
		<li>Uma máscara que se ajusta à membrana apenas usando a equação booleana: M01 e não Erode(M01,7) - máscara de toda a célula (M01) subtraída do interior (Erode(M01,7)) (Figura 10).</li>
		<li>Para considerar os pixels escuros na membrana (correspondentes aos CNTs), crie então a máscara: Intensidade (M01 e não Erosão (M01, 7), BF, 0-533) (Figura 11).</li>
		<li>Visualize as diferentes máscaras aplicadas em uma coleção de células para verificar sua relevância (Figura 12) para células rotuladas e não rotuladas.</li>
		<li>Aplique a área de recurso na máscara selecionando os pixels pretos na membrana 'Area_Intensidade (M01 e não Erodir (M01, 7), BF, 0-533)' chamada área preta. Permitirá a quantificação dos NTCs na membrana. 
		 
		Para discriminar finalmente os CNTs que foram internalizados daqueles adsorvidos apenas na membrana, plote a área preta na membrana versus a área preta em toda a célula (ou seja, 'Intensidade Area_ (M01 e não Erosão (M01, 7), BF, 0-533' versus 'Intensidade Area_ (M01, BF, 0-533)'). 
		 
		nota: O mesmo tipo de procedimento é aplicado com o sinal fluorescente FITC: compare o aumento da intensidade da fluorescência FITC versus a diminuição do sinal médio de pixel no BF, ou a colocalização entre manchas escuras no BF e a intensidade de fluorescência FITC. Em nosso caso, esse tipo de análise não é relevante porque o sinal de fluorescência não coincide corretamente com manchas escuras em BF, por um lado, e com campo claro em DF, por outro, mostrando que as propriedades intrínsecas dos CNTs (absorbância e espalhamento de luz) são mais apropriadas do que o sinal relacionado à sonda de fluorescência.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Depois que todos os gráficos forem criados em uma condição experimental, crie um "modelo de relatório estatístico", salve o modelo como arquivo .ast e agrupe todos os arquivos de dados.</li>
</ol>

<ol><li>Kostarelos, K., Bianco, A., Prato, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Promises%2C+facts+and+challenges+for+carbon+nanotubes+in+imaging+and+therapeutics%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Nano%22%5BJournal%5D)">Promises, facts and challenges for carbon nanotubes in imaging and therapeutics.</a> Nat. Nano. 4, 627-633 (2009).</li>
<li>De La Zerda, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Carbon+nanotubes+as+photoacoustic+molecular+imaging+agents+in+living+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Nano%22%5BJournal%5D)">Carbon nanotubes as photoacoustic molecular imaging agents in living mice.</a> Nat. Nano. 3, 557-562 (2008).</li>
<li>Zavaleta, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Noninvasive+Raman+Spectroscopy+in+Living+Mice+for+Evaluation+of+Tumor+Targeting+with+Carbon+Nanotubes%5BTitle%5D)+AND+%22Nano+Lett%22%5BJournal%5D)">Noninvasive Raman Spectroscopy in Living Mice for Evaluation of Tumor Targeting with Carbon Nanotubes.</a> Nano Lett. 8, 2800-2805 (2008).</li>
<li>Tong, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Label-free+imaging+of+semiconducting+and+metallic+carbon+nanotubes+in+cells+and+mice+using+transient+absorption+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Nano%22%5BJournal%5D)">Label-free imaging of semiconducting and metallic carbon nanotubes in cells and mice using transient absorption microscopy.</a> Nat. Nano. 7, 56-61 (2012).</li>
<li>Welsher, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+route+to+brightly+fluorescent+carbon+nanotubes+for+near-infrared+imaging+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Nano%22%5BJournal%5D)">A route to brightly fluorescent carbon nanotubes for near-infrared imaging in mice.</a> Nat. Nano. 4, 773-780 (2009).</li>
<li>Jin, H., Heller, D. A., Sharma, R., Strano, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Size+dependent+cellular+uptake+and+expusion+of+single-wall+carbon+nanotubes%3A+single+particle+tracking+and+a+generic+uptake+model+for+nanoparticles%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Nano%22%5BJournal%5D)">Size dependent cellular uptake and expusion of single-wall carbon nanotubes: single particle tracking and a generic uptake model for nanoparticles.</a> ACS Nano. 3, 149-158 (2009).</li>
<li>Al-Jamal, K. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cellular+uptake+mechanisms+of+functionalised+multi-walled+carbon+nanotubes+by+3D+electron+tomography+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22Nanoscale%22%5BJournal%5D)">Cellular uptake mechanisms of functionalised multi-walled carbon nanotubes by 3D electron tomography imaging.</a> Nanoscale. 3, 2627-2635 (2011).</li>
<li>Reuel, N. F., Dupont, A., Thouvenin, O., Lamb, D. C., Strano, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Three-Dimensional+Tracking+of+Carbon+Nanotubes+within+Living+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Nano%22%5BJournal%5D)">Three-Dimensional Tracking of Carbon Nanotubes within Living Cells.</a> ACS Nano. 6, 5420-5428 (2012).</li>
<li>Phanse, Y., Ramer-Tait, A. E., Friend, S. L., Carrillo-Conde, B., Lueth, P., Oster, C. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analyzing+Cellular+Internalization+of+Nanoparticles+and+Bacteria+by+Multi-spectral+Imaging+Flow+Cytometry%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Analyzing Cellular Internalization of Nanoparticles and Bacteria by Multi-spectral Imaging Flow Cytometry.</a> J. Vis. Exp. (64), e3884(2012).</li>
<li>Qian, F., Montgomery, R. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+Imaging+of+Lineage-specific+Toll-like+Receptor-mediated+Signaling+in+Monocytes+and+Dendritic+Cells+from+Small+Samples+of+Human+Blood%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Quantitative Imaging of Lineage-specific Toll-like Receptor-mediated Signaling in Monocytes and Dendritic Cells from Small Samples of Human Blood.</a> J. Vis. Exp. (62), e3741(2012).</li>
<li>Marangon, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intercellular+Carbon+Nanotube+Translocation+Assessed+by+Flow+Cytometry+Imaging%5BTitle%5D)+AND+%22Nano+Lett%22%5BJournal%5D)">Intercellular Carbon Nanotube Translocation Assessed by Flow Cytometry Imaging.</a> Nano Lett. 12, 4830-4837 (2012).</li>
<li>Lacerda, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Translocation+mechanisms+of+chemically+functionalised+carbon+nanotubes+across+plasma+membranes%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">Translocation mechanisms of chemically functionalised carbon nanotubes across plasma membranes.</a> Biomaterials. 33, 3334-3343 (2012).</li>
<li>Al-Jamal, K. T., Kostarelos, K. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aAl-Jamal%2C+KT+%22Methods+in+Molecular+Biology%22">Methods in Molecular Biology</a>. Balasubramanian, K., Burghard, M. 625, Humana Press. 123-124 (2010).</li>
<li>Zhou, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((New+Insights+of+Transmembranal+Mechanism+and+Subcellular+Localization+of+Noncovalently+Modified+Single-Walled+Carbon+Nanotubes%5BTitle%5D)+AND+%22Nano+Lett%22%5BJournal%5D)">New Insights of Transmembranal Mechanism and Subcellular Localization of Noncovalently Modified Single-Walled Carbon Nanotubes.</a> Nano Lett. 10, 1677-1681 (2010).</li>
</ol>

Os autores declaram que não têm interesses financeiros concorrentes.

1. Modificação e solução de problemas
Neste estudo, o primeiro objetivo foi avaliar a quantidade e a localização dos NTCs nas células. A microscopia confocal poderia ter sido a priori o método ouro para avaliar a distribuição intracelular dos NTCs funcionalizados com o marcador fluorescente FITC8,14. No entanto, a principal desvantagem é a limitação à imagem de célula única e, portanto, a falta de dados estatisticamente relevantes. O ImageStream permite trabalhar além desses obstáculos: de fato, ao rastrear um grande número de células (5.000-10.000) em um curto espaço de tempo (<min), ele produz resultados estatisticamente robustos, aprimorados também pela imagem de alta resolução que fornece imagens para cada célula com uma resolução subcelular (0,5 μm). Torna possível analisar uma grande quantidade de dados com base na análise de uma única imagem.
Em comparação com a citometria de fluxo convencional, a vantagem exclusiva do ImageStream é fornecer imagens multiespectrais de cada célula e uma comparação pixel a pixel da intensidade do sinal. Assim, o ImageStream combina o poder estatístico da citometria de fluxo de alto rendimento com as vantagens analíticas da imagem confocal para cada célula analisada. É crucial para uma quantificação relativa sem marcação e localização de CNTs nas células.
2. Etapas críticas dentro do protocolo
A etapa crítica consiste na escolha dos parâmetros mais adequados de cada estudo. No nosso caso, a melhor maneira foi basear a análise nas propriedades de absorção e espalhamento dos nanotubos: a boa correlação entre a localização de manchas escuras no BF e manchas brilhantes no DF sustenta que o método desenvolvido é relevante e confiável - e pode não ter sido possível sem imagens celulares.
3. Limitações da técnica
Deve-se enfatizar que a visualização de NTCs nas células só foi possível porque elas tendem a se acumular em vesículas intracelulares endossômicas e, em seguida, aparecem como fortes pontos de absorção e dispersão. Nanotubos individuais não devem ser detectados com base neste método, enquanto podem ser eventualmente detectados em fluorescência, o que constitui uma clara limitação. Em segundo lugar, a quantificação não é 'absoluta', mas relativa para diferentes concentrações de marcação e em comparação com as células de controle não marcadas. Algumas características quantitativas (pixel médio, intensidade, etc.) são parâmetros absolutos, enquanto outras dependem da escolha das máscaras (máscara de limiar, máscaras de localização).
4. Significado em relação aos métodos existentes
Em relação à fluorescência, a análise do ImageStream destaca a má colocalização dos aglomerados CNT entre o sinal brilhante FITC e os pontos nos outros canais. Portanto, parece que a fluorescência não era um indicador confiável para a quantificação e localização de CNTs. No entanto, superando a limitação da citometria de fluxo convencional, que se baseia principalmente na quantificação de fluorescência, o ImageStream multiespectral de alto rendimento abre caminho para uma quantificação estatística sem rótulos , ao mesmo tempo em que fornece localização de nanotubos de carbono dentro das células.
5. Aplicações futuras
Este método de nanometrologia estatística de alto rendimento pode ser generalizado para qualquer nanomaterial, que mostre alta absorção e dispersão de luz ao interagir com as células. Portanto, pode ter aplicações importantes para investigações da nano-bio-interface, nanotoxicologia e nanomedicina.

Durante as últimas décadas, o lugar das nanopartículas ganhou importância em uma ampla gama de aplicações. Em particular, os nanotubos de carbono (CNTs) são cada vez mais explorados como nanoferramentas para diversas aplicações diagnósticas e terapêuticas; graças às suas propriedades elétricas, térmicas e espectroscópicas particulares, os CNTs podem atuar como veículos de entrega para vários medicamentos ou agentes de contraste, ou também podem estar envolvidos na engenharia de tecidos1.
No entanto, as preocupações sobre a toxicidade potencial de tais nanomateriais ainda estão em debate, principalmente porque o destino dos CNTs no organismo permanece muito controverso. De fato, faltam métodos apropriados para detectá-los e quantificá-los em células e tecidos vivos: por exemplo, técnicas como espectroscopia Raman, fotoacústica e fotoluminescência de infravermelho próximo têm sido sugeridas, mas cada método apresenta limitações dependendo do tipo de nanotubos e/ou de seu ambiente2-8.
Aqui, o método proposto pode ser aplicável para a detecção e quantificação de nanopartículas em células. Isso foi possível graças ao uso do ImageStream, um dispositivo que combina citometria de fluxo e imagens de alta resolução. Ele combina as vantagens de adquirir uma grande quantidade de células (até 5000 eventos/seg) - e os benefícios de dados estatísticos e imagens de alta resolução de cada célula ao mesmo tempo (resolução espacial de 0,5 μm). Geralmente, as imagens são coletadas usando uma câmera CCD e são uma representação bidimensional em escala de cinza da célula. A luz é quantificada para cada pixel na imagem e identifica tanto a intensidade quanto a localização da fluorescência ou de componentes com tamanho subcelular (em BF, por exemplo), permitindo assim uma poderosa capacidade de discriminar células com base em sua aparência9,10. 
O objetivo era projetar um método de nanometrologia que permitisse uma avaliação quantitativa da distribuição e comportamento dos NTCs nas células. Em particular, este método foi desenvolvido para estudar a captação celular, processamento e exocitose de NTCs pelas células. Evidenciamos, em primeiro lugar, o complexo tráfego celular de NTCs e, em segundo lugar, a transferência desses nanomateriais entre células: NTCs internalizadas por células escapam de suas células hospedeiras quando estressadas, espalham-se no espaço extracelular e são reinternalizadas por células virgens, sejam elas homotípicas ou heterotípicas11
.
Estudo anterior mostrou que diferentes mecanismos de captação celular, ativos ou passivos, podem ocorrer dependendo da funcionalização da NTC e do estado de agregação12. Aqui, os CNTs de paredes múltiplas foram funcionalizados por meio de cicloadição e amidação de 1,3-dipolar e, em seguida, derivatizados com uma sonda fluorescente, fluorescente em isotiocianato (FITC). Na microscopia eletrônica de transmissão, eles parecem ser internalizados pelas células individualmente com localização citosólica ou como feixes, encontrados principalmente nos compartimentos endossômicos e lisossômicos11. No ImageStream, os CNTs agrupados aparecem com uma alta correlação como manchas escuras no BF e pontos brilhantes no DF, permitindo uma distinção clara entre células marcadas com CNT e células de controle. Por outro lado, a distribuição do sinal fluorescente emitido pelo marcador fluorescente funcionalizado com CNTs não foi tão bem colocalizada: de fato, provavelmente devido a um fenômeno de extinção, as manchas fluorescentes verdes não correspondem necessariamente às manchas em BF e DF. Isso indica que, em primeiro lugar, uma sonda fluorescente não é obrigatória para a detecção de CNTs com o ImageStream e, em segundo lugar - a fortiori - que não é totalmente representativa tanto para quantificação quanto para localização de CNTs.
Além de fornecer uma quantificação relativa estatística de nanopartículas, este método também fornece informações sobre a localização de CNTs em células, o que significa que discrimina, por exemplo, CNTs no interior da célula versus aqueles que estão ligados à membrana plasmática. A capacidade de localizar CNTs em imagens celulares supera claramente a limitação da análise convencional de citometria de fluxo13. O procedimento foi desenvolvido aqui por meio da criação de máscaras ajustadas a regiões específicas da célula e selecionando também os pontos escuros correspondentes aos CNTs carregados.
De um modo geral, este método pode ser aplicado para uma ampla gama de experimentos envolvendo a necessidade de visualização ou quantificação em células, desde que as nanopartículas usadas sejam capazes de absorver fortemente (e/ou espalhar) a luz.

<table><tbody><tr><td>ImageStream</td><td><a href="https://www.amnis.com/imagestream.html" target="_blank"><img src="/img/new_window.png"> Amnis</a></td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

localização e quantificação relativa de nanotubos de carbono em células com citometria de fluxo de imagem multiespectral

Localization and Relative Quantification of Carbon Nanotubes in Cells with Multispectral Imaging Flow Cytometry

Os nanomateriais à base de carbono, como os nanotubos de carbono (CNTs), pertencem a este tipo de nanopartículas que são muito difíceis de discriminar das estruturas celulares ricas em carbono e de facto ainda não existe um método quantitativo para avaliar a sua distribuição a nível celular e tecidual. O que propomos aqui é um método inovador que permite a detecção e quantificação de CNTs em células usando um citômetro de fluxo de imagem multiespectral (ImageStream, Amnis). Este dispositivo recém-desenvolvido integra um alto rendimento de células e imagens de alta resolução, fornecendo imagens para cada célula diretamente no fluxo e, portanto, análise de imagem estatisticamente relevante. Cada imagem celular é adquirida em canais de campo claro (BF), campo escuro (DF) e fluorescente, dando acesso respectivamente ao nível e à distribuição de absorção de luz, luz espalhada e fluorescência para cada célula. A análise consiste então em uma comparação pixel a pixel de cada imagem, das 7.000-10.000 células adquiridas para cada condição do experimento. A localização e quantificação de CNTs é possível graças a algumas propriedades intrínsecas particulares dos CNTs: forte absorção e dispersão de luz; de fato, os CNTs aparecem como manchas escuras fortemente absorvidas em BF e pontos brilhantes em DF com uma colocalização precisa.
Esta metodologia pode ter um impacto considerável nos estudos sobre as interações entre nanomateriais e células, uma vez que este protocolo é aplicável a uma vasta gama de nanomateriais, na medida em que são capazes de absorver (e/ou dispersar) a luz com força suficiente.

Uma visão geral do princípio do dispositivo ImageStream é apresentada na Figura 1. Ele produz múltiplas imagens de alta resolução de cada célula em fluxo, incluindo campo claro (BF), campo escuro (DF ou luz espalhada lateralmente) e canal(is) de fluorescência, conforme exemplificado na Figura 2 com três células diferentes marcadas com CNTs. As sobreposições desses canais também são mostradas, ilustrando à primeira vista a correlação.
Como toda a análise pós-processamento é baseada na imagem celular, a seleção de células focadas é crucial para o estudo (Figura 3). Na verdade, a presença de CNTs induz alterações no contraste e no gradiente em comparação com células não marcadas: células focadas, que internalizaram uma quantidade significativa de CNTs, tendem a apresentar um gradiente rms baixo (parâmetro normalmente utilizado para discriminar células focadas versus desfocadas), mas também um contraste acentuado, o que explica a necessidade de um gráfico biparamétrico. Na Figura 3 é mostrada a discriminação entre células desfocadas (área amarela) versus células focadas (área azul).
Os CNTs internalizados pelas células são claramente distinguíveis — especialmente em BF, aparecendo como pontos escuros fortemente absorventes (veja o efeito de diversas concentrações de marcação, Figura 4). Além disso, o sinal médio dos pixels em BF foi analisado, fornecendo uma quantificação relativa da captação: os gráficos na Figura 5 mostram seu aumento significativo com a concentração de marcação dos CNTs (resultados para cerca de 7.000 células por condição experimental).
Em segundo lugar, a quantificação de CNTs também é possível por meio do uso de máscaras, aplicadas em uma faixa restrita de pixels escuros do BF ou nos pixels de alta intensidade do DF (ver exemplos na Figura 6), correspondentes aos pontos resultantes da presença de CNTs. Assim, o cálculo da área dessas máscaras permite evidenciar, bem como o aumento da captação (exemplificado na Figura 7 com a área da máscara no BF, selecionando pixels variando de 0-533).
Além disso, a correlação entre pontos em BF e DF pode ser avaliada plotando-se a intensidade em DF versus o sinal médio de pixels em BF (como na Figura 8) (análise independente de máscara) ou a área da máscara em BF (Máscara 1) versus a área em DF (Máscara 2).
No que diz respeito ao procedimento criado para a localização de CNTs no interior das células, Figura 9A exibe as diferentes máscaras que foram criadas. Observe que a robustez das máscaras de localização (baseadas na erosão da máscara celular padrão) deve ser verificada visualmente em um conjunto de células marcadas e não marcadas. As mesmas máscaras são utilizadas para todas as amostras.
A representação da área total das manchas escuras na membrana celular versus a área total na célula inteira fornece um índice de internalização para células incubadas por 20 horas a 37 °C em comparação com a incubação de 2 horas a 4 °C (ver Figura 9B); isso indica que os CNTs estão principalmente localizados na membrana a 4 °C, enquanto a 37 °C os CNTs são internalizados em mais de 90% das células.
Finalmente, em relação à fluorescência, este parâmetro não foi utilizado como indicador para a quantificação de CNTs devido à baixa correlação entre os pontos fluorescentes e os pontos em campo claro (e campo escuro). De fato, a correlação entre a intensidade de FITC e o valor médio de pixels em campo claro indica um coeficiente de correlação de Pearson de -0,2. Na Figura 10, são ilustrados dois casos nos quais o sinal de fluorescência corresponde ou não adequadamente à mancha escura em campo claro.
<img alt="Layout óptico do ImageStream: diagrama mostrando a configuração da citometria de fluxo com excitação a laser e detecção." fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/50566/50566fig1highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50566/50566fig1.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Figure 1"> 
Figura 1. Visão geral do ImageStream – funcionamento geral. O sistema de imagem multiespectral adquire até 12 imagens/célula em três modos diferentes: campo claro, campo escuro e fluorescência. A configuração consiste em 5 lasers de excitação, incluindo 405, 488, 560 e 658 nm. A luz é coletada das células em fluxo na cubeta com diferentes objetivas (neste estudo, foi utilizada a objetiva de 40X) e direcionada ao elemento de decomposição espectral, que consiste em um conjunto de filtros de passagem longa dispostos em arranjo angular. A câmera CCD que coleta as imagens das células opera com uma técnica chamada integração com atraso temporal, a fim de evitar borrões nas imagens. A profundidade estendida de campo (EDF) é uma opção.
<img alt="Imagem celular, microscopia de fluorescência, marcação com FITC, campo claro, campo escuro, escala de 2 μm, análise." fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/50566/50566fig2highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50566/50566fig2.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Figura 2"> 
Figura 2. Galeria de imagens de células marcadas com nanotubos de carbono (50 μg/mL) capturadas pelo ImageStream por meio de diversos canais (Campo Claro (BF), Campo Escuro (DF), fluorescência (FITC) e suas sobreposições). Os nanotubos de carbono confinados nos lisossomos intracelulares aparecem como grandes pontos pretos nas imagens de campo claro. Por outro lado, criam pontos brilhantes nas imagens de campo escuro e de fluorescência.
<img alt="Análise de imagem celular; gráficos de dispersão do gradiente RMS versus contraste; diagrama com dados de morfologia celular." fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/50566/50566fig3highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50566/50566fig3.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Figure 3"> 
Figura 3. Seleção de células em foco. O gráfico de pontos bivariado que representa o gradiente da raiz média quadrática (rms) versus contraste em imagens de campo claro permite a exclusão de células desfocadas. Aqui, a área amarela representa células desfocadas, enquanto as células em foco são representadas em azul. As células desfocadas são caracterizadas por baixo contraste e baixo gradiente rms na imagem de campo claro. Além do gradiente rms, a característica de contraste é necessária para discriminar células em foco após sua marcação com nanotubos de carbono (CNTs).
<img alt="Resposta celular a concentrações crescentes; imagem de microscópio; estudo das alterações na morfologia celular." fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/50566/50566fig4highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50566/50566fig4.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Figure 4"> 
Figura 4. Absorção dependente da dose de CNTs visualizada por ImageStream. O número e a área de pontos pretos nas imagens de campo claro aumentam com a dose de CNTs durante a incubação com as células (variando de 0-50 µg/ml). Observe que as células controle não apresentam pontos pretos.
<img alt="Gráfico da intensidade média de pixel em equilíbrio estático; frequência normalizada; resposta à dose; análise de dados." fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/50566/50566fig5highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50566/50566fig5.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Figure 5"> 
Figura 5. Quantificação relativa da captação de CNT com base nas imagens de campo claro. Os histogramas da característica média de pixel aplicada à máscara "objeto", que representa a célula inteira, mostram claramente um comportamento dependente da dose, o qual pode ser utilizado para quantificação. O intervalo R9 engloba as células positivas para CNT.
<img alt="Imagens de microscopia em campo claro e escuro, análise de intensidade de máscara, diferenciação de estruturas celulares." fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/50566/50566fig6highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50566/50566fig6.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Figura 6"> 
Figura 6. Criação de máscaras para selecionar pontos escuros em imagens de campo claro (BF) e pontos claros em imagens de campo escuro (DF). Como os nanotubos de carbono (CNTs) aparecem como pontos escuros fortemente absorventes na imagem de campo claro (BF), cria-se uma máscara de limiar para selecionar uma faixa restrita de pixels com baixa intensidade, compreendida entre 0-533 neste estudo (Máscara 1, notação: Intensity(M01, BF, 0-533)). Por outro lado, utiliza-se uma máscara ajustada aos pixels de alta intensidade (150-4095 neste caso) na imagem de campo escuro (DF) (Máscara 2, notação: Intensity(M06, DF, 150-4095)) para selecionar pontos claros no campo escuro, correspondentes às áreas de alta dispersão.
<img alt="Gráfico de distribuição de frequência da intensidade da área em concentrações variadas; controle até 50 μg/mL." fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/50566/50566fig7highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50566/50566fig7.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Figura 7"> 
Figura 7. A absorção dose-dependente de CNTs é demonstrada pela quantificação da área de pontos escuros em imagens BF. Utilizando uma máscara de limiar (máscara 1) aplicada em BF, a área dos pontos escuros pode ser quantificada para cada célula, mostrando uma distribuição dependente da dose.
<img alt="Scatter plot showing pixel intensity and object area analysis for image data comparison." fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/50566/50566fig8highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50566/50566fig8.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Figure 8"> 
Figura 8. Métodos de quantificação de CNT baseados em imagens BF (absorção) e DF (espalhamento) são correlacionados. À esquerda, pixel médio na imagem de contraste de fase versus intensidade na imagem de DF, mostram uma boa correlação para células marcadas com CNTs (50 µg/ml) (coeficiente de correlação de Pearson r = -0,68). À direita, área da máscara ajustada aos pontos escuros em BF versus área do ajuste da máscara em pontos brilhantes no campo escuro para células marcadas com CNTs (50 µg/ml). O coeficiente de correlação de Pearson é r = -0,83. Os valores de 7.000 células foram plotados.
<img alt="Diagrama de análise celular com efeitos de temperatura, gráficos de dispersão, avaliação da área da membrana em diferentes condições." fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/50566/50566fig9highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50566/50566fig9.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Figure 9"> 
Figura 9. Localização de CNTs em células utilizando máscaras específicas. (A) São criadas máscaras para ajustar-se a uma localização específica da célula, da esquerda para a direita: toda a célula, somente a membrana e o interior da célula. Outra máscara ajusta-se aos pontos pretos graças a um limiar de intensidade (Máscara 1, notação: Intensity(M01, BF, 0-533). (B) A avaliação da localização de CNTs pode ser obtida pela medição da área de pontos pretos em diferentes localizações das células, utilizando as máscaras de localização descritas em A. A incubação com CNTs (50 µg/mL) foi realizada tanto a 37 °C quanto a 4 °C para inibir a via de internalização. O gráfico que representa a área preta na membrana versus a área preta em toda a célula mostra uma absorção dose-dependente de CNTs na membrana a 4 °C, enquanto a internalização completa de CNTs é eficaz a 37 °C.
<img alt="Microscopia fluorescente, análise de células, coloração com FITC, sobreposição de campo claro e fluorescência." fo:content-width="3in" fo:src="/files/ftp_upload/50566/50566fig10highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50566/50566fig10.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Figura 10"> 
Figura 10. Colocalização de pontos pretos induzidos por CNT no campo claro (BF) com pontos brilhantes fluorescentes na imagem de FITC. Os pontos brilhantes fluorescentes nem sempre estão colocalizados com os pontos pretos no campo claro. Eles coincidem adequadamente nas duas primeiras células exibidas, mas não nas duas últimas células.

Neste estudo, o objetivo principal foi monitorar a captação celular e eventual exocitose de nanotubos de carbono (NTCs). Nessa perspectiva, propusemos aqui um método único usando citometria de fluxo de imagem multiespectral permitindo uma quantificação e localização de CNTs em um número estatisticamente relevante de células.

Localização e quantificação relativa de nanotubos de carbono em células com citometria de fluxo de imagem multiespectral

Carbon-based nanomaterials, like carbon nanotubes (CNTs), belong to this type of nanoparticles which are very difficult to discriminate from carbon-rich ...

O objetivo geral do experimento a seguir é fornecer um método nanometrológico para monitorar e quantificar a captação celular de nanotubos de carbono em um número estatisticamente relevante de células. Isso é alcançado primeiramente tratando as células com nanotubos de carbono dispersáveis em água, que entram nas células de maneira dependente da concentração. Esses nanotubos de carbono são eventualmente marcados com um marcador fluorescente.Em seguida, após a fixação, cada célula é imageada em campo claro, campo escuro e canais fluorescentes de um citômetro de fluxo com imagem multiespectral. Para visualizar a distribuição dos nanotubos de carbono e o nível de absorção de luz, luz dispersa e fluorescência que a marcação com nanotubos induz em cada célula, pixel por pixel. Em última análise, a absorção intrínseca de luz e o espalhamento dentro das células permitem a localização e quantificação dos nanotubos de carbono.Assim, este método pode ajudar a responder novas questões nas áreas de nanotoxicologia e nanomedicina, como o impacto e o destino de materiais à base de carbono em células vivas, bem como o potencial dos nanotubos de carbono como sistema de entrega de fármacos. Comece dispersando os nanotubos de carbono, eventualmente conjugados a um marcador fluorescente, em água para cultura celular. Em seguida, sonique os nanotubos em banho ultrassônico a 20 graus Celsius por 20 minutos. A seguir, dilua os nanotubos nas concentrações de 0, 10, 20 e 50 microgramas por mililitro em meio completo e, então, incube dois mililitros de cada diluição com as células de interesse em uma placa de 25 centímetros quadrados por diluição a 37 graus Celsius. Após 20 horas, remova o meio de incubação de cada placa e lave as células marcadas com nanotubos de carbono com PBS.Após a lavagem, a tripsina age sobre as células em cada placa e, em seguida, as ressuspende em meio DMEM completo. Em seguida, transfira cada amostra para tubos cónicos individuais de 15 mililitros, e centrifugue as células por cinco minutos a 200 ×g e temperatura ambiente. Ressuspenda cada pellet em paraformaldeído 4% a quatro graus Celsius por uma hora.Após a fixação, centrifugue as células novamente e reconstitua cada amostra em pellet em 150 microlitros de PBS com 15 vezes 10 à quinta células. Em seguida, filtre as amostras individualmente através de peneiras de malha de 50 mícrons para adquirir imagens das células com um fluxo de imagens. Citômetro de fluxo com imagem multiespectral.Primeiro, selecione uma ampliação adequada e, em seguida, image os amostras de interesse. Utilize um laser de 685 nanômetros para imagear o campo escuro e configure o citômetro de fluxo. Defina o canal seis para coletar a emissão do campo escuro em uma faixa de passagem de 745 a 800 nanômetros.Image os amostras nos canais de campo claro número um e de campo escuro número seis para análise de imagem. Primeiro, crie um gráfico de dispersão paramétrico com razão de aspecto largura por altura versus área celular. Isso permite discriminar as células individuais, que possuem uma área padrão e razão de aspecto próxima a um, dos eventos multicelulares, que têm uma área grande e uma razão de aspecto pequena, e dos detritos, que exibem uma área extremamente pequena.Após utilizar as imagens das células para verificar se as células individuais foram corretamente selecionadas, configure um gráfico de pontos biparamétrico para células marcadas com nanotubos de carbono altamente contrastadas, plotando o contraste contra o gradiente quadrático médio, permitindo assim a exclusão de células desfocadas com baixo gradiente quadrático médio e baixo contraste, e a seleção das células no plano focalizado. Em seguida, utilize a ferramenta "encontrar melhor característica" para determinar o parâmetro que fornece a melhor separação estatística entre as células marcadas e não marcadas. Por exemplo, para este experimento representativo, a característica média de intensidade dos pixels do objeto é a mais adequada.Em seguida, plote este parâmetro em função da frequência normalizada para traçar um histograma para a quantificação dos nanotubos absorvidos pelas células em cada concentração experimental. Agora, plote um gráfico biparamétrico do objeto médio de pixel em campo claro versus a intensidade em campo escuro. Para verificar a correlação entre esses dois parâmetros, a quantificação dos nanotubos também é avaliada mediante a criação em imagens celulares, já que os nanotubos de carbono aparecem como pontos escuros intensos. No canal de campo claro, selecione uma faixa restrita de pixels com baixa intensidade, por exemplo, entre zero e 533, para criar a máscara de limiar, uma que se ajuste precisamente aos nanotubos escuros, a fim de criar uma segunda máscara denominada máscara dois para visualizar os nanotubos que aparecem brilhantes no canal de campo escuro.Selecione uma faixa de pixels com alta intensidade. Por exemplo, uma faixa de 150 a 4.095 foi escolhida para este experimento. Em seguida, utilizando a área da máscara de campo claro um ou da máscara de campo escuro dois, configure um gráfico de pontos para quantificar a internalização relativa dos nanotubos.Por exemplo, plote a área no canal seis correspondente ao campo escuro com a máscara dois contra a área no canal um, correspondente ao campo claro com a máscara um. Após determinar a correlação linear entre a máscara um e a máscara dois, visualize os nanotubos dentro do citoplasma criando primeiro uma máscara de toda a célula e depois erodindo a máscara. Denote agora erode M 0 1 7 por sete pixels para visualizar o interior da célula.Para visualizar os nanotubos de carbono dentro da membrana celular, utilize a equação booleana M zero um e não erosione M 0 1 7. Essa é a máscara de toda a célula, subtraída do interior da célula para criar uma máscara apenas da membrana, a fim de avaliar os pixels escuros na membrana. Aplique a máscara de campo claro um à máscara da membrana.Aplicar todas essas máscaras a múltiplas células simultaneamente para confirmar uma distinção entre as amostras marcadas e não marcadas. Em seguida, selecionar os pixels pretos na membrana com a ferramenta de área de característica para quantificar os nanotubos de carbono na membrana celular. Por fim, discriminar os nanotubos de carbono que foram internalizados daqueles que se adsorveram na membrana.Plote a área preta da membrana em relação à área preta de toda a célula. Após a criação de todos os gráficos para uma condição experimental, crie um modelo de relatório estatístico. Salve o modelo como um arquivo A ST e processe em lote todos os arquivos de dados.O dispositivo de fluxo de imagens produz múltiplas imagens de alta resolução de cada célula no citômetro de fluxo, incluindo canais de campo claro, campo escuro e fluorescência, conforme demonstrado aqui com três tipos diferentes de células marcadas com nanotubos. As sobreposições desses canais também são mostradas. A presença de nanotubos de carbono induz alterações no contraste e no gradiente das células marcadas em comparação com células não marcadas.Assim, a criação de um gráfico de dispersão biparamétrico é importante para selecionar as células focadas. Células desfocadas em amarelo podem ser discriminadas por seu baixo contraste e baixo gradiente quadrático médio, independentemente da presença ou ausência de marcação com nanotubos. Células focadas não marcadas também exibem baixo contraste, mas demonstram uma alta raiz do gradiente quadrático médio; quando as células focadas são marcadas com nanotubos, no entanto, as células demonstram um alto contraste e um perfil de gradiente quadrático médio baixo.Os nanotubos de carbono internalizados são facilmente distinguíveis, particularmente no canal de campo claro, onde aparecem como pontos escuros intensos, cujas áreas aumentam com a concentração de nanotubos. Quando os sinais médios dos pixels das imagens de campo claro são analisados, pode-se determinar uma quantificação relativa da captação de nanotubos. Por exemplo, esses histogramas demonstram o aumento significativo na captação de nanotubos que ocorre com cada incremento na concentração de marcação dos nanotubos, conforme demonstrado. A quantificação de nanotubos de carbono também é possível por meio do uso de máscaras aplicadas em uma faixa restrita de pixels escuros dentro de uma imagem de campo claro, ou nos pixels de alta intensidade dentro do campo escuro, correspondentes às áreas onde os nanotubos estão presentes.O mapeamento da área dessas máscaras permite então uma quantificação adicional da captação de nanotubos de carbono. Além disso, a correlação entre os pontos nas imagens de campo claro e escuro pode ser avaliada por meio do gráfico da intensidade de campo escuro versus o sinal médio dos pixels em campo claro, ou pelo mapeamento da área da máscara dentro do campo claro versus a área dentro do campo escuro. Nas próximas duas figuras, são apresentadas análises dos nanotubos de carbono localizados no interior da célula.Essas primeiras imagens demonstram as diferentes máscaras que foram criadas. Observe que a robustez das máscaras de localização baseadas na erosão da máscara celular padrão deve ser verificada visualmente na coleção de células marcadas e não marcadas. Como acabou de ser demonstrado nestes gráficos de pontos, a área total das manchas pretas na membrana celular em relação à área de toda a célula foi plotada para determinar o escore de internalização.Para células que foram incubadas por 20 horas a 37 graus Celsius em comparação com células incubadas por duas horas a quatro graus Celsius, os nanotubos de carbono são encontrados principalmente localizados na membrana, enquanto a 37 graus Celsius, os nanotubos de carbono são internalizados em mais de 90% das células. A fluorescência do nanotubo de carbono não é um bom indicador da internalização do nanotubo de carbono devido à baixa correlação entre os pontos fluorescentes e os pontos nos canais de campo claro e escuro. De fato, a correlação entre a intensidade do fitzy e o valor médio de pixel no campo claro indica um coeficiente de correlação de Pearson de menos 0,2.Como demonstrado nestas imagens, o sinal fluorescente não corresponde de forma confiável às manchas escuras em campo claro, nanotubos de carbono, confinamento e agregação dentro de lisossomos intracelulares, que parcialmente atenuaram o sinal fluorescente. Em contraste, nanotubos dispersos podem gerar um sinal fluorescente mais confiável após seu desenvolvimento. Esta técnica abre caminho para pesquisadores na área de nanotecnologia e nanomedicina explorarem a interação de células vivas com nanomateriais à base de carbono ou qualquer nanomaterial com alta capacidade de absorção e dispersão da luz, utilizando um método estatístico de citometria de alto rendimento.

localization-relative-quantification-carbon-nanotubes-cells-with

Research

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