A morte celular associada com mitose anormal observado por imagem confocal em células vivas Câncer

O objetivo geral do experimento a seguir é observar o efeito citotóxico do derivado de philanthotoxin PJ 34 durante a mitose em células cancerígenas somáticas humanas com múltiplos centros. Isso é alcançado por meio da marcação de centríolos com GFP-γ-tubulina e cromossomos com H2B vermelha por transfeção. O objetivo da transfeção é permitir o rastreamento da migração e agrupamento dos centríolos, bem como da disposição dos cromossomos durante a mitose em células cancerígenas somáticas com múltiplos centros vivas.

Como segundo passo, algumas das células transfectadas são expostas ao PJ 34, uma molécula que atua como agente desagregador de centríolos extras. Em seguida, células cancerígenas vivas transfectadas são analisadas por microscopia confocal para capturar eventos durante a mitose associados à migração de centríolos e cromossomos. A reorganização ou agrupamento de imagens sequenciais obtidas mostra os efeitos desagregadores e citotóxicos do tratamento com PJ 34 em células cancerígenas durante a mitose, com base na imagem confocal de células vivas.

As implicações dessa técnica estendem-se a uma terapia direcionada contra o câncer, eliminando exclusivamente células cancerosas autossômicas durante a mitose. A demonstração dessa técnica será realizada por nosso colaborador, Dr. Asher Castillo, do Centro de Pesquisa em Câncer do Centro Médico Sheba, e pelo Dr. Leonid Middleman, da unidade de imagem da Escola de Medicina Sacko da Universidade Telaviv. Para preparar células de câncer de mama M-D-A-M-B 231 para imagem confocal em tempo real, semeie duas vezes 10 à quinta potência células em placas de cultura com fundo de vidro revestido com polilisina, com diâmetro de 35 milímetros, em dois litros de meio completo, e incube em 5% de dióxido de carbono a 37 graus Celsius.

O cultivo celular está pronto para transfeção quando atinge uma confluência de 60 a 70%. As células serão transfectadas com dois plasmídeos, um codificando a tubulina gama, GFP para detecção fluorescente de centríolos e outro codificando histona vermelha para detecção fluorescente de cromossomos. A transfeção é realizada utilizando o reagente de transfeção lipossomal jetPI, seguindo o protocolo do fabricante. Lave as células uma vez com PBS e, em seguida, substitua o meio celular por dois mililitros de DMEM quente sem suplementos. Adicione suavemente a mistura de transfeção às células no DMEM e, então, retorne as células ao incubador por oito horas. Após oito horas.

Substitua o DMEM por dois mililitros de meio completo e incube as células no incubador por 24 horas. Após a transfeção, substitua o meio por dois mililitros de meio completo contendo 20 micromolares de PGA 34.

Incube as células por mais 18 horas antes da imagem confocal em tempo real. A seguir estão os parâmetros técnicos das configurações do scanner de imagem confocal em tempo real. Modo de varredura XYZT, pinhole airy 1,00, zoom 3,5, resolução oito bits, laser DPSS 561 nanômetros, laser visível de argônio 488 nanômetros, laser visível de hélio-neônio 633 nanômetros.

Objetivo H-C-X-P-L-A-P-O-C-S 63 vezes 1,40 Óleo UV abertura numérica 1,4. Velocidade de varredura, 700 hertz e índice de refração 1,52. Submeta as células à microscopia confocal em tempo real por pelo menos 16 horas em uma câmara de imagem, mantendo as células a 5% de dióxido de carbono e 37 graus Celsius.

A eficácia da transfeção será examinada por microscopia de fluorescência. Inicie este procedimento semeando duas vezes 10 à quinta células MDA MB 231 em uma placa de seis poços contendo um lamínula por poço em dois mililitros de meio completo. Transfete as células da mesma maneira que antes, utilizando o reagente de transfeção lipossomal jet PI, seguindo o protocolo do fabricante.

36 horas após a transfeção. Remova o meio de cada poço após lavar as células transfectadas montadas em um lamínula com PBS. Fixe as células pela incubação em uma solução fria de metanol e acetona na proporção de um para um durante sete minutos a 20 graus Celsius negativos.

Após sete minutos, aspire a solução de fixação e deixe a lamínula com as células montadas secar em uma capela química por 30 minutos. Em seguida, aplique o reagente antidesbotamento dourado prolongado com DPI e deixe a lamínula secar no escuro por seis horas. Examine a lâmina em um microscópio de fluorescência e calcule a porcentagem de células transfectadas com sinais vermelhos e verdes.

Da população total de células, a porcentagem desejada de transfeção é de cerca de 20 a 40% quando são contadas de 100 a 200 células. Para iniciar este procedimento, semeie duas vezes 10 à quinta células de câncer de mama M-D-A-M-B 231 em lamínulas de vidro em uma placa de seis poços com dois mililitros de meio completo. Adicione PJ 34 ao meio e incube as células pelo período necessário.

Após a conclusão do período de incubação, lave as lamínulas uma vez com PBS e fixe as células por meio de incubação em uma solução de metanol e acetona gelados na proporção de um para um, durante sete minutos a 20 graus Celsius negativos. Em seguida, aspire a solução de fixação e deixe as lamínulas secarem em uma capela química por 30 minutos. Lave as lamínulas uma vez com PBST para permeabilizar as membranas celulares e, então, bloquee as células com soro normal de jumento a 10% em PBST por uma hora à temperatura ambiente.

Crie a primeira mistura de anticorpos adicionando os anticorpos primários antifa tubulina e anti-gama tubulina à solução bloqueadora e vortexando. Em seguida, aplique 100 microlitros da mistura de anticorpos para cada lamínula em uma tampa de placa de seis poços. Vire a lamínula com a face voltada para baixo e coloque-a suavemente sobre a gota de anticorpo, incubando por duas horas.

Adicione à temperatura ambiente. Isso corará os fusos e os centríolos. Devolva as lamínulas aos poços e lave as células três vezes com PBST.

Em seguida, adicione os anticorpos secundários, LOR 488 e LOR 568, 1 gota por lamínula em uma tampa de placa de seis poços. Depois, posicione as lamínulas com a face voltada para baixo sobre as gotas de anticorpos, incube por uma hora à temperatura ambiente, no escuro. Ao final da incubação com os anticorpos secundários, devolva as lamínulas aos poços e lave as células três vezes com PBST.

Por fim, monte as lamínulas usando o reagente prolongado anti desvanecimento dourado com incubação de dappy durante a noite à temperatura ambiente no escuro para secar antes de imaginar as células fixadas por microscopia confocal. PJ 34 é um fantorodina estável e solúvel em água que anteriormente foi observado exclusivamente erradicar células cancerosas com múltiplos centríolos sem prejudicar células normais em mitose com dois centríolos e fusos bifocais. Neste estudo, a atividade citotóxica do PJ 34 foi examinada utilizando células vivas de câncer de mama humano M-D-A-M-B 231, que apresentam alta ocorrência de centríolos extras.

As células foram transfectadas com GFP da tubulina gama para marcar os focos de tubulina gama e com histona H dois B vermelha para marcar os cromossomos. A análise de células M-D-A-M-B 231 por pelo menos 16 horas por meio de microscopia confocal revelou agrupamento bifocal de centríolos, representando agrupamento bifocal de centríolos extras na maioria das células em mitose, conforme ilustrado nos seguintes clipes de vídeo. Este primeiro vídeo mostra uma célula viva selecionada aleatoriamente durante a mitose, com os centríolos marcados em verde pela tubulina gama.

GFP na segunda vídeo é possível visualizar a rearranjo cromossômico durante a mitose em uma célula M-D-A-M-B 231 selecionada aleatoriamente, transfetada com histona H two B vermelha. Este terceiro vídeo mostra uma célula MDA MB 231 em mitose, na qual focos verdes de centrôsomas agrupados bifocais e centríolos extras são marcados em verde e os cromossomos são marcados em vermelho. Em contraste, centrôsomas não agrupados e arranjo aberrante dos cromossomos foram detectados em células M-D-A-M-B 231 vivas transfetadas e incubadas com 20 micromolar de PJ 34, e a mitose nessas células terminou em morte celular, conforme mostrado neste filme.

Esta documentação em tempo real da morte celular durante a mitose apoia fortemente uma correlação positiva previamente definida entre o número de células malignas humanas com fusos multipolares em mitose e a porcentagem de morte celular em células incubadas com PJ 34. Como o PJ 34 atua como um potente inibidor da PARP uma, investigou-se a possibilidade de a inibição da PARP uma causar morte celular associada à falha mitótica. A atividade citotóxica de concentrações crescentes de PJ 34 foi testada em fibroblastos embrionários de camundongo normais e deficientes em PARP uma, e os resultados são apresentados aqui.

O gráfico à esquerda mostra a porcentagem de fusos multifocais calculada em fibroblastos embrionários normais de camundongo, representados pela linha preta, e fibroblastos deficientes em PARP um, representados pela linha cinza, incubados por 48 horas com PJ 34 nas concentrações indicadas. Essas porcentagens foram calculadas a partir de 20 fusos no total detectados em três experimentos diferentes. O gráfico à direita mostra a sobrevivência de fibroblastos embrionários de camundongo normais e deficientes em PARP um incubados por 72 horas com 20 micromolar.

A sobrevivência celular de PJ 34 foi avaliada pela produção de ATP nas células. São apresentados os valores médios de quatro medições para cada linhagem celular em três experimentos diferentes. Esses resultados mostram que doses de PJ 34 causaram, de maneira dependente da dose, fusos distorcidos e morte celular em fibroblastos embrionários de camundongo deficientes em PARP1, mas não em fibroblastos normais.

O fato de que o PJ 34 eliminou fibroblastos embrionários de camundongo deficientes em PARP1, apesar de sua deficiência em PARP1, e a correlação entre a formação de fusos multifocais e a eliminação celular em fibroblastos embrionários de camundongo deficientes em PARP1 incubados com PJ 34 em concentrações superiores às necessárias para inibição de PARP1 não é compatível com uma ligação causal entre a desaglomeração de centríolos em fibroblastos embrionários de camundongo deficientes em PARP1 e a inibição de PARP1. Essas imagens de microscopia confocal mostram fibroblastos embrionários de camundongo normais e deficientes em PARP1 em mitose, fixados, permeabilizados e imunomarcados para alfa e gama tubulina, que marcaram seus fusos de verde e centríolos de vermelho, respectivamente. Os cromossomos foram marcados de azul com o reagente DPI.

As células foram deixadas sem tratamento ou incubadas com PJ 34 por 48 horas nas concentrações indicadas. Focos de tubulina gama não agrupados, fusos distorcidos e morte celular foram observados em fibroblastos embrionários de camundongo deficientes em PARP um tratados com PJ 34, mas não em fibroblastos embrionários de camundongo normais tratados com PJ 34. Alguns dos cultivos celulares analisados foram tratados com dois potentes inibidores não arianos de PARP um, A BT 8 88 e a G 0 1 4 6 9, que inibem a atividade enzimática de PARP um.

Nenhum dos inibidores de PARP1 testados prejudicou fibroblastos embrionários normais de camundongo em concentrações que inibiam a atividade de PARP1. Esses inibidores de PARP1 também não afetaram o agrupamento de centríolos em fibroblastos embrionários de camundongo deficientes em PARP1. Esses resultados indicam que a atividade citotóxica do PJ 34 em células com múltiplos centríolos não foi compartilhada por outros inibidores potentes de PARP1 após dominado.

Essa técnica pode ser utilizada em outros tipos de células vivas para uma variedade de propostas.