Eletroforese em gel de DNA

DNA Gel Electrophoresis é uma técnica usada para separar e identificar fragmentos de DNA com base no tamanho.

Fragmentos de DNA de vários tamanhos são carregados em um gel poroso feito de agarose – um carboidrato encontrado em algas vermelhas.

Quando um campo elétrico é aplicado, os fragmentos migrarão através do gel, graças aos grupos de fosfato carregados negativamente em nucleotídeos de DNA.

Pedaços menores de DNA migrarão mais facilmente através do gel do que fragmentos maiores, que têm mais dificuldade em se mover através da matriz de gel.

Quando a corrida de gel é completa, a localização de suas amostras de DNA pode ser comparada a uma série de fragmentos ou faixas de tamanhos conhecidos, chamada escada de DNA.

A presença do seu fragmento de interesse pode então ser confirmada com base em seu tamanho, que é determinado comparando a localização relativa da sua amostra de teste com os fragmentos da escada.

Os géis de agarose são preparados usando uma solução percentual de peso sobre volume. Assim, 1 grama de agarose em 100 ml de tampão vai fazer um gel de 1%. Géis de porcentagem mais baixos resolverão fragmentos maiores e géis de porcentagem mais altos tornarão fragmentos menores mais fáceis de identificar. Para iniciar o procedimento de fabricação de gel, pese a massa apropriada de agarose em um frasco de Erlenmeyer.

Adicione o buffer de execução ao frasco, de modo que o volume do buffer não seja superior a 1/3 da capacidade do frasco. Em seguida, redemoinho para misturar.

Derreta a mistura agarose/tampão aquecendo em um micro-ondas com potência máxima. A cada trinta segundos, remova o frasco e gire o conteúdo para misturar bem. Repita até que a agarose tenha se dissolvido completamente.

Em seguida, adicione brometo de etídio a uma concentração de 0,5 mg/ml. O brometo de ethidium é um composto aromático que se encaixa entre pares de base individuais de DNA, ou intercalados, e faz com que o DNA emita gaorescência laranja intensa sob luz UV. É importante notar que o brometo de etídio é um cancerígeno, por isso as luvas devem ser sempre usadas ao manusear géis contendo este composto.

Para evitar que a bandeja de gel deforme, deixe a agarose esfriar colocando-a em um banho de água de 65ºC.

Como a agarose está esfriando, prepare o molde de gel colocando a bandeja de gel no aparelho de fundição. Como alternativa, você pode usar fita para selar as bordas abertas da bandeja de gel para criar o molde. Colocar um pente no gel cria os poços onde o DNA é carregado. Certifique-se de que o pente criará um poço que é o tamanho apropriado para sua amostra de DNA.

Despeje a agarose derretida no molde de gel e deixe-o endurecer à temperatura ambiente.

Depois que a agarose endurecer, tire o pente. Se o gel não for usado imediatamente, enrole-o em plástico e armazene a 4ºC até o uso.

Se o gel for usado imediatamente, coloque-o na caixa de gel.

Para iniciar este procedimento, adicione corante de carregamento de gel às amostras de DNA a serem separadas. O carregamento de corante é tipicamente feito em uma concentração de 6X. O carregamento de corante ajuda a visualizar e carregar amostras nos poços e ajuda a determinar até onde as amostras migraram durante a corrida.

Defina a fonte de alimentação à tensão desejada.

Agora adicione o suficiente de tampão de corrida na caixa de gel para cobrir a superfície do gel. Certifique-se de usar o mesmo buffer de corrida que o usado para preparar o gel.

Conecte os cabos da caixa de gel à fonte de alimentação e ligue-as. Lembre-se que o DNA é carregado negativamente e se moverá em direção ao ânodo, que é positivo, e geralmente de cor vermelha. Certifique-se de não conectar o chumbo preto, ou cátodo, ao fundo da caixa de gel. Então você não se esquece, tenha em mente que gatos negros são má sorte, ou negativos, e o CAThode preto é, portanto, negativo. Corra seu gel para vermelho, ou o ânodo. Verificar se tanto a caixa de gel quanto a fonte de alimentação estão funcionando; o aparecimento de bolhas nos eletrodos indica que a corrente está passando.

Remova a tampa da caixa de gel. Devagar e cuidadosamente carregar as amostras de DNA no gel. Novamente, o corante de carregamento na amostra permite que a amostra afunde no gel e ajudará a rastrear até onde a amostra viajou. Um marcador de tamanho de DNA, ou escada, deve ser sempre carregado junto com as amostras experimentais.

Substitua a tampa. Verifique duas vezes se os eletrodos estão conectados nos slots corretos na fonte de alimentação.

Ligue a energia. Execute o gel até que o corante tenha migrado para uma distância apropriada.

Quando a eletroforese estiver completa, desligue a fonte de alimentação e remova a tampa da caixa de gel.

Retire o gel da caixa de gel e escorra o excesso de tampão na superfície do gel. Coloque a bandeja de gel em toalhas de papel para absorver qualquer tampão de corrida restante.

Para visualizar os fragmentos de DNA, remova o gel da bandeja de gel e exponha o gel à luz ultra violeta.

Fragmento de DNA deve aparecer como bandas fluorescentes laranjas. Tire uma foto do gel.

No final do experimento, elimine corretamente o gel e executando o buffer por regulamentação da instituição. Mais uma vez, lembre-se de sempre manusear o gel e executar tampões com luvas para evitar a exposição ao brometo de ethidium.

Agora que você viu como realizar eletroforese de gel de DNA. Vamos dar uma olhada em algumas aplicações a jusante e variações deste método altamente útil.

Aqui você vê um resultado de eletroforese de gel agarose depois de separar os produtos PCR. Os fragmentos de DNA carregados no gel são visíveis como bandas claramente definidas. O padrão de DNA ou escada deve ser separado a um grau que permita a determinação útil dos tamanhos das bandas amostrais. Neste exemplo, fragmentos de DNA de 765 pares de base, 880 pares de base e 1022 pares de base são separados em um gel de 1,5% de agarose com uma escada de DNA de 2 log.

Além de confirmar a presença de um fragmento de DNA de interesse, a eletroforese do gel de DNA pode ser combinada com procedimentos de purificação de gel. Normalmente, uma lâmina de barbear é usada para cortar o fragmento de DNA de interesse, para que possa ser coletado e a amostra de DNA dentro dela recuperada.

A eletrofese de gel de Agarose também pode ser combinada com a transferência de manchas, que envolve permitir que o DNA, ou RNA, seja transferido para uma membrana de celulose onde sondas radioativas podem ser usadas para identificar sequências específicas de DNA ou RNA em sua amostra eletroforeticamente separada.

A eletroforese padrão do gel de DNA não é ideal para a separação de DNA de alto peso molecular maior que 15-20 kb de tamanho, como DNA genômico. Para separar grandes amostras de DNA, é usada eletroforese de gel de campo de pulso, que envolve submeter o gel a um campo elétrico em diferentes direções. Esta técnica envolve um aparelho de corrida de gel especializado, que tem pares de eletrodos dispostos em diferentes orientações ao redor do gel. Isso pode ser usado para detectar diferenças no tamanho do genoma entre populações de organismos, como as amostras de DNA agrupadas de diferentes comunidades microbianas, você vê aqui que são tiradas de diferentes ambientes do lago.

Você acabou de ver uma introdução à eletroforese de gel de DNA. Mostramos o conceito por trás do método, como preparar o gel de agarose, como carregar suas amostras, como executar o gel, analisá-lo e algumas aplicações comuns de eletroforese de gel agarose. Obrigado por assistir e boa sorte com a execução do seu gel.