Isolamento manual de células-tronco adiposo-derivadas de Lipoaspirates Humanos
26 de setembro de 2013
Em 2001, pesquisadores da UCLA descreveu o isolamento de uma população de células-tronco adultas, chamadas células-tronco derivadas de tecido adiposo ou ASC, a partir de tecido adiposo. Este artigo descreve o isolamento de ASC de lipoaspirates usando, um protocolo de digestão enzimática manual utilizando colagenase.
O objetivo geral deste procedimento é isolar células-tronco derivadas do tecido adiposo da gordura obtida na forma de um lipoaspirado. Isso é feito removendo primeiro a solução cirúrgica e lavando o aspirado de glóbulos vermelhos contaminantes. O segundo passo é liberar as células-tronco por meio da digestão enzimática do lipoaspirado lavado com colagenase.
Em seguida, as células liberadas na forma de uma fração vascular estromal ou SVF são coletadas por centrifugação. A etapa final é remover o sobrenadante e a placa, as células SVF para seleção e cultura dos ASCs aderentes. Em última análise, indução in vitro desses ASCs cultivados em direção ao osso, gordura e cartilagem.
As linhagens podem ser usadas para confirmar a presença dessas células dentro da cultura, além de confirmar sua multipotencialidade. Geralmente, os indivíduos novos neste método terão dificuldades devido à logística de trabalhar com grandes volumes de lipoaspirina antes da colheita de células. Prepare a colagenase estéril Tipo um e o meio de controle estéril.
Colete o lippo aspirado em um recipiente de aspiração. Transvase cuidadosamente o aspirado lippo em um alto-falante de vidro estéril de um litro. Quando as camadas de lippo aspirado estiverem separadas por gravidade, aspire a camada superior de óleo, se houver.
Além disso, remova o inato inferior. Avalie o volume da camada de tecido adiposo resultante. Adicione um volume igual de XPBS estéril e mexa com a pipeta usada para aspiração.
Quando as duas camadas estiverem assentadas, aspirar o inato com uma pipeta serológica de 10 ml. Continue a lavar a fração de tecido adiposo com PBS até que a camada adiposa fique com uma cor ouro amarelo. Aspire o inato uma última vez, deixando a fração de tecido adiposo.
No alto-falante de vidro. Deixe as camadas de lippo aspirado assentarem por cinco minutos após a última lavagem e antes da aspiração final. Em uma unidade de filtro, prepare colagenase estéril uma solução.
Adicione um volume igual ao da fração adiposa e do filtro estéril. Em seguida, despeje cuidadosamente a fração adiposa lavada na solução de colagenase e feche bem o frasco. Em seguida, incube a mistura adiposa de colagenase em banho-maria a 37 graus Celsius por 30 minutos com giros suaves a cada cinco a 10 minutos, avalie a camada de tecido adiposo para uma aparência mais suave à medida que a digestão prossegue e, se necessário, aumente o tempo de reação para dissolver quaisquer pedaços sólidos de gordura.
Esterilize a unidade de filtro que contém a mistura adiposa de colagenase digerida com etanol a 70% e coloque-a de volta no gabinete de biossegurança. Agora pipete alíquotas de 25 mililitros do inato contendo a fração vascular estromal em tubos de centrífuga estéreis de 50 mililitros. Adicione 25 mililitros de meio de controle a cada tubo e incubado em temperatura ambiente por cinco minutos para inativar a colagenase.
Em seguida, centrifugue por 10 minutos a 1.200 vezes G para coletar a fração vascular estromal como um pellet no gabinete de biossegurança. Aspirar o sobrenadante de cada tubo. Certifique-se de que a camada superior de óleo e quaisquer adipócitos flutuantes sejam aspirados com este sobrenadante.
Em seguida, combine os pellets SVF em um tubo de centrífuga usando 30 mililitros de meio condicionado e divida igualmente em dois novos tubos de centrífuga de 50 mililitros após a centrifugação aspirar os sobrenadantes dos dois pellets. Se a lise de hemácias for desejada, esses dois pellets podem ser ressuspensos em 10 mililitros de um tampão de lise de hemácias e incubados em temperatura ambiente por 10 minutos. Após centrifugação, aspirar os sobrenadantes para produzir pellets da fração vascular estromal.
Combine esses dois pellets em um novo tubo de centrífuga. Usando de cinco a 10 mililitros de meio de controle, grandes partículas de tecido podem ser filtradas usando um filtro de malha de 100 mícrons colocado em cima de um novo tubo de centrífuga de 50 mililitros. Agora alicote a fração filtrada contendo as células-tronco adiposas em placas de cultura de tecidos.
Em seguida, complemente cada prato com um volume de controle apropriado. Cultura da mídia. As células por três a quatro dias sem alteração do meio aspiram a cultura, o meio e lavam as células uma vez com PBS estéril para remover quaisquer glóbulos vermelhos contaminantes, depois reabastecem o meio e continuam a cultura ao usar este enzimático manual para o isolamento de uma fração vascular estromal de uma amostra de lippo aspirado de grande volume.
A população A SC cultivada resultante é relativamente homogênea na aparência e composta de fibroblastos como células como o meio mais popular de validação. A indução in vitro da população A SC usando condições de cultura definidas resulta em sua diferenciação em linhagens mesodérmicas, ectodérmicas e endodérmicas. Enquanto in vitro o potencial da camada trigerminativa resultou no uso de ASCs para uma ampla variedade de sistemas modelo regenerativos.
A diferenciação em células adipogênicas, osteogênicas e congênitas é geralmente suficiente para identificar o A SC e confirmar sua multipotência. Além disso, as ASCs também podem ser diferenciadas em células miogênicas esqueléticas e miogênicas lisas da linhagem ectodérmica ou linhagem de células hepáticas endodérmicas. Depois de assistir a este vídeo, você deve ter uma boa compreensão de como isolar uma fração vascular estromal de Lipos.
Para o propósito de Turing, é um componente SC.
Veja a transcrição completa e aceda a milhares de vídeos científicos
Visão Geral
Este artigo descreve o isolamento de células-tronco derivadas de adipócitos (ASCs) de lipoaspirados utilizando um protocolo manual de digestão enzimática com colagenase. O processo envolve a lavagem do aspirado, digestão enzimática e cultivo das células para estudos posteriores.
Componentes Principais do Estudo
Área da Ciência
- Biologia de Células-Tronco
- Medicina Regenerativa
- Engenharia de Tecidos
Contexto
- As células-tronco derivadas de tecido adiposo (ASCs) são uma fonte promissora para terapias regenerativas.
- As ASCs podem se diferenciar em diversos tipos celulares, incluindo osso, gordura e cartilagem.
- O isolamento das ASCs a partir do tecido adiposo é fundamental para sua aplicação em pesquisa e terapia.
- Estudos anteriores estabeleceram métodos para o isolamento de ASCs, mas a otimização está em andamento.
Objetivo do Estudo
- Fornecer um protocolo detalhado para o isolamento de ASCs a partir de lipoaspirados.
- Aumentar a eficiência do isolamento de ASCs para fins de pesquisa.
- Facilitar o estudo da diferenciação de ASCs e suas potenciais aplicações terapêuticas.
Métodos Utilizados
- Remoção da solução cirúrgica e lavagem do lipoaspirado.
- Digestão enzimática do lipoaspirado lavado utilizando colagenase.
- Coleta da fração vascular estromal (FVE) por centrifugação.
- Plaqueamento das células da FVE para seleção e cultivo de ASCs aderentes.
Resultados Principais
- Isolamento bem-sucedido de CMA a partir de lipoaspirados utilizando o protocolo descrito.
- Foram obtidas CMA viáveis e cultivadas para estudos posteriores de diferenciação.
- O método demonstrou eficiência na remoção de contaminantes e na maximização do rendimento celular.
- As CMA mostraram potencial para diferenciação em múltiplas linhagens celulares in vitro.
Conclusões
- O protocolo de digestão enzimática descrito é eficaz para o isolamento de ASCs.
- As ASCs isoladas podem ser utilizadas em diversas aplicações na medicina regenerativa.
- São necessários estudos adicionais para explorar o potencial completo das ASCs em contextos terapêuticos.
Perguntas Frequentes
Relevância Executiva para a Indústria
O isolamento de células-tronco derivadas de adipócitos (ASCs) de lipoaspirados fornece uma fonte escalonável de células multpotentes para pesquisas iniciais em medicina regenerativa. Este protocolo permite a validação de alvos e triagem fenotípica em sistemas relevantes para doenças, gerando populações aderentes de ASCs capazes de diferenciação multilinial. O método apoia a redução de riscos mecanicistas e confiança preditiva em modelos pré-clínicos, fornecendo células homogêneas derivadas da fração vascular estromal para aplicações posteriores.
Aplicações Estratégicas em P&D de Biotecnologia e Farmacêuticos
Descoberta Inicial e Validação de Alvos
- Valor Científico: Permite a investigação da heterogeneidade das células estromais mesenquimais e a validação funcional da multipotência das ASCs por meio de ensaios de diferenciação definidos.
- Valor Operacional: Fornece um método reprodutível para o isolamento de ASCs a partir de tecido adiposo humano, reduzindo a variabilidade no fornecimento de células primárias para estudos de validação de alvos.
Desenvolvimento de Triagem e Ensaios
- Valor Científico: Gera populações aderentes de ASCs adequadas para triagem de alto conteúdo de compostos que modulam vias adipogênicas, osteogênicas ou condrogênicas.
- Valor Operacional: Produz pellets da fração vascular estromal (FVE) que podem ser padronizados entre diferentes volumes de lipoaspirado, favorecendo a escalabilidade de ensaios e a reprodutibilidade entre laboratórios.
Pesquisa Translacional e Pré-clínica
- Valor Científico: A diferenciação em linhagens adipogênicas, osteogênicas e condrogênicas confirma a potência funcional, permitindo o uso em modelos pré-clínicos de regeneração tecidual.
- Valor Operacional: O isolamento escalonável a partir de lipoaspirados de grande volume sustenta um fornecimento consistente de células para estudos pré-clínicos longitudinais e trabalhos para viabilização de IND.
Integração de Pipeline e Fluxo de Trabalho
O fluxo de trabalho de isolamento de ASCs insere-se no continuum de descoberta, desde a identificação do alvo até a otimização do composto líder, fornecendo uma fonte renovável de células para ensaios mecanicistas e triagem fenotípica antes da validação pré-clínica.
- Biologia de Descoberta: Apoia a verificação de hipóteses sobre a função de células estromais e modulação de vias em populações mesenquimais derivadas de humanos.
- Triagem: Fornece monocamadas aderentes de ASC com morfologia consistente para triagem de bibliotecas de compostos e análise de resposta à dose.
- Análises: Permite a quantificação da eficiência de diferenciação por meio de colorações específicas de linhagem (por exemplo, Red Oil O, Alizarina Vermelho) como leitura quantitativa dos efeitos de compostos.
- Pesquisa Translacional: A capacidade de diferenciação em linhagens mesodérmicas favorece a continuidade em modelos pré-clínicos de reparo ósseo, adiposo e cartilaginoso.
- Reutilização Empresarial: A adaptabilidade do protocolo a diferentes volumes de lipoaspirado permite reutilização em múltiplos projetos e áreas terapêuticas sem necessidade de reotimização.
Impacto Operacional e Empresarial
- Valor Científico: Redução da ambiguidade mecanicista por meio da avaliação validada da multipotência de ASCs isoladas.
- Valor Operacional: Padronização das etapas de digestão enzimática e lavagem minimiza a variabilidade entre lotes no rendimento da SVF.
- Valor Estratégico: Decisões informadas de prosseguir ou não com base no potencial de diferenciação reduzem a desistência em estágios avançados de programas regenerativos.
- Impacto no Portfólio: Priorização ajustada ao risco de terapias derivadas de ASCs viabilizada por métricas confiáveis de potência a partir da diferenciação in vitro.
Considerações sobre a Implementação
- Requer experiência em cultura de células primárias e técnica estéril para manter a viabilidade das ASCs durante o isolamento.
- Depende do acesso à colagenase Tipo I estéril, cabines de segurança biológica e centrífugas refrigeradas para o processamento da FSV.
- Necessita padronização dos protocolos de lavagem para obter coloração consistente do tecido adiposo e remoção de hemácias.
- As considerações para adaptação incluem o ajuste da concentração de colagenase e do tempo de incubação com base na densidade do lipoaspirado e na variabilidade entre doadores.
- As limitações práticas incluem a variabilidade no rendimento celular associada à idade do doador, IMC e técnica de lipoaspiração, conforme observado no material de origem.
