Name: Isolamento, purificação e Rotulagem de neutrófilos da medula óssea do rato de Estudos funcionais e Experimentos de transferência adotiva (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-07-10T13:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 28 s
Description: Aprenda a isolar e rotular neutrófilos da medula óssea de camundongos usando centrifugação em gradiente de densidade e corantes CellTracker. Este método econômico e reprodutível permite estudos funcionais e experimentos de transferência adotiva.

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Este trabalho foi apoiado pela Divisão de Investigação intramuros do Instituto Nacional de Alergia e Doenças Infecciosas (NIAID), Instituto Nacional de Saúde (NIH), EUA. Todos os animais foram mantidos em uma associação americana para a Acreditação de Laboratório Animal Care credenciados biotério do Instituto Nacional de Alergia e Doenças Infecciosas (NIAID) e alojados em conformidade com os procedimentos descritos no Guia para o Cuidado e Uso de Animais de Laboratório sob os auspícios de um protocolo aprovado pelo Animal Care e do Comitê de Uso do NIAID.

1. Isolamento de rato Células da Medula Óssea <ol><li> Eutanásia camundongos usando o protocolo cuidados com os animais da instituição comitê-aprovado e pulverizar a superfície animal com etanol 70%. </li><li> Realizar uma incisão da pele, em meados dos abdómen e remover a pele a partir da parte distal do rato, incluindo a pele que cobre as extremidades inferiores. </li><li> Cortar os músculos dos membros inferiores usando tesoura e deslocar cuidadosamente o acetábulo do quadril, evitando quebrar a cabeça do fêmur. </li><li> Remova os músculos remanescentes do fêmur e da tíbia utilizando um bisturi e tesoura e separar o fêmur da tíbia no joelho cuidado exercitar para não quebrar as extremidades ósseas. Colocar os ossos numa placa de Petri contendo gelada 1X RPMI 1640 suplementado com 10% FBS e 1% de penicilina / estreptomicina. </li><li> Prossiga com as seguintes etapas sob uma capa de cultura de tecidos. Tome precauções extras para manter técnicas estéreis rigorosas para evitar neutrophiativação l. </li><li> Lavar cada osso com etanol a 70% (dentro de uma placa de Petri), seguido de três lavagens subsequentes em PBS gelado (estéril dentro de placas de Petri) para enxaguar o etanol a partir da superfície dos ossos. </li><li> Dentro de uma placa de Petri estéril limpo, cortar as epífises dos ossos e mantê-los de lado. </li><li> Utilize uma agulha de calibre 25 e uma seringa de 12 cc cheio com meio RPMI suplementado com 10% de FBS e 2 mM de EDTA, e lave as células da medula óssea a partir de ambas as extremidades dos veios de osso em um ml de tampa de rosca tubo Falcon de 50 equipado com um 100 um filtrar. De modo a remover de forma eficiente todas as células, raspar a superfície interior dos ossos utilizando a agulha de calibre 25. </li></ol> NOTA: O branqueamento dos ossos indica que as células tenham sido suficientemente raspada. NOTA: Use aproximadamente 10 ml de mídia para liberar um fêmur / par tíbia. Adição de EDTA para o meio é essencial para prevenir a aglutinação das células. <ol start="9"><li> Corte as epífises ósseasem pequenos 0,5-1 mm 3 peças com um bisturi e esmagá-los através do filtro 100 mM utilizando o back-end de um 2,5 ml Eppendorf Combitip Além disso Biopur ponteira. </li><li> Centrifugar a 1400 rpm durante 7 minutos a 4 ° C. </li><li> Lisar as células vermelhas do sangue por ressuspensão do sedimento celular em 20 ml de 0,2% de NaCl por aproximadamente 20 seg, seguido pela adição de 20 ml de 1,6% de NaCl. (Crítica: Não exceda 20-30 seg de lise hipotônica para evitar a morte de células de medula óssea O uso de NaCl para a lise hipotônica é recomendado em tampão de lise ACK porque este último tem o potencial de ativar os neutrófilos.). </li><li> Centrifugar durante 7 min a 1400 rpm a 4 ° C para recolher as células. </li><li> Lavar as células com meio RPMI 1640 suplementado com 1X SBF a 10% e EDTA 2 mM e centrifugar tal como no passo 1.12. </li><li> O rendimento de células da medula óssea, utilizando este método é cerca de 60-80 milhões por não infectado 8-12 semanas de idade C57BL / 6 mouse. </li></ol> 2. Separação de Neutrófilospor Gradiente de Densidade Centrifugação <ol><li> Contar as células da medula óssea e ressuspender em 1 ml de PBS gelado estéril. </li><li> Adiciona-se 3 ml de Histopaque 1119 (densidade 1,119 g / ml) num tubo cónico de 15 ml. </li><li> Sobreposição de 3 ml de Histopaque 1077 (densidade 1,077 g / ml), em 3 ml de Histopaque 1119. </li></ol> NOTA: Histopaque Histopaque 1119 e 1077 deve ser aquecida até 18-26 ° C antes da utilização. Passo Crítica: Preparar gradientes imediatamente antes da utilização como preparação do gradiente com antecedência irá resultar em difusão entre as duas camadas e de pureza e recuperação de neutrófilos subóptima. Passo Crítica: Sobreposição sobre Histopaque 1077 1119 precisa ser feito lentamente, a fim de evitar a mistura dos dois densidades, que não permita a separação de células, durante a centrifugação. <ol start="4"><li> Sobrepor a suspensão de células de medula óssea no topo do Histopaque 1077. </li></ol> Passo Crítico: Sobrecargaaying a suspensão de células de medula óssea sobre Histopaque 1077 precisa ser feito lentamente, a fim de evitar perturbar a interface entre as células e Histopaque 1077. NOTA: Ressuspender as células da medula óssea de um rato infectado em 1 ml de PBS produz pureza dos neutrófilos de&gt; 90%. No entanto, reunindo muitas amostras de medula óssea compromete a pureza dos neutrófilos, por exemplo, ressuspensão 300 x 10 6 células em 3 ml de PBS, reduz a pureza dos neutrófilos a partir de&gt; 90% para ~ 80%. Portanto, os investigadores devem realizar experiências-piloto para identificar a contagem / volume condições celulares ideais para seus experimentos específicos <ol start="5"><li> Centrifugar durante 30 minutos a 2000 rpm a 25 ° C sem travagem. </li></ol> NOTA: A centrifugação do gradiente à temperatura ambiente é fundamental e essencial para uma separação efectiva das neutrófilos. <ol start="6"><li> Recolher os neutrófilos na interface do Histopaque 1119 e 1077 Histopaque camadas. </li&gt; <li> Lavar os neutrófilos colhidos duas vezes com RPMI 1640 suplementado com 1X SBF a 10% e 1% de penicilina / estreptomicina e centrifugar a 1400 rpm durante 7 minutos a 4 ° C. </li><li> Conte os neutrófilos e determinar sua viabilidade. </li></ol> NOTA: Os neutrófilos são tipicamente&gt; 95% viáveis ​​e&gt; 90% de pureza tal como determinado por análise FACS. O rendimento típico de neutrófilos na medula óssea (isto é, 2 fémur e os ossos da tíbia 2) de uma não infectada 8-12 semanas de idade C57BL / 6 de rato é de ~ 6-12 milhões de células. Este número é substancialmente maior quando os neutrófilos são colhidas a partir da medula óssea de animais infectados. Assim, ~ 30-40000000 neutrófilos / mouse foram recuperados quando os ratos Candida infectados foram utilizados para a colheita de 6 células. 3. Rotulagem de neutrófilos utilizando corantes CellTracker <ol><li> Ressuspender as neutrófilos a 5 x 10 6 células / ml em PBS pré-aquecido a 37 ° C. </li><li> Adicionar um corante CellTracker numa concent definitivoração de 5 mM. </li></ol> NOTA: CellTracker Verde (CMFDA (diacetato de 5-Chloromethylfluorescein) e CellTracker laranja (CMTMR (5 - (e-6)-4-clorometil tetrametilrodamina Amino benzoíla) foi utilizado neste protocolo para rotular diferencialmente os neutrófilos a partir de tipo selvagem e o gene deficiente ratinhos. NOTA: Prepare uma solução estoque de 10 mM de Green CellTracker e CellTracker Orange, alíquotas e armazenar a -80 ° C até o dia do experimento. <ol start="3"><li> Incubar neutrófilos com 5 uM do corante CellTracker correspondente durante 10 min a 37 ° C num banho de água com agitação no escuro. </li><li> Lave as células duas vezes com meio RPMI gelado 1X 1640 suplementado com 10% FBS e 1% de penicilina / estreptomicina. </li></ol> NOTA: lavagem eficiente das células após o passo de marcação com o corante CellTracker é essencial para evitar a contaminação cruzada de corante antes de misturar populações de neutrófilos diferencialmente etiquetadas para Downstream estudos repovoamento competitivos. 4. Transferência adotiva de neutrófilos em camundongos e análise de neutrófilos transferidos por citometria de fluxo <ol><li> Neutrófilos Ressuspender em PBS arrefecido com gelo, a uma concentração de 25 x 10 6 células / ml e injectar 200 ul da suspensão para dentro da veia lateral da cauda de modo que 5 x 10 6 neutrófilos são transferidos por ratinho. Para os estudos de neutrófilos de repovoamento competitivo, mistura neutrófilos de tipo selvagem e o gene deficiente em uma proporção de 1:1 e injectar um total de 5 x 10 6 por ratinho neutrófilos como acima. </li></ol> NOTA: pelo menos até 10 x 10 6 de neutrófilos podem ser adoptivamente transferidos por ratinho sem toxicidade imediatamente óbvio para os animais. <ol start="2"><li> Em diferentes momentos após a transferência adoptiva (por exemplo, 1, 2, 3 ou 4 horas após a transferência), eutanásia ratos e colheita de sangue e / ou medula óssea e / ou outros órgãos alvo (s) de interesse. </li><li> Prepare siAs suspensões de células ngle destes tecidos para análise quantitativa e qualitativa dos neutrófilos marcados adoptivamente transferidos utilizando protocolos publicados 6,15. </li><li> Após vivo / morto a coloração de viabilidade e bloqueio Fc, as células de etiqueta com CD45 (clone 30-F11), Ly6G (clone 1A8) e CD11b (clone M1/70) e portão vivo na CD45 + + CD11b + Ly6G neutrófilos. Os neutrófilos neste portão incluem neutrófilos nativas do ratinho receptor, bem como os neutrófilos marcados transferidas adoptivamente, que são + FITC (se marcado com CellTracker verde) ou PE + (se marcado com células Rastreio de laranja). </li></ol> NOTA: Os neutrófilos podem ser rastreadas no sangue, medula óssea e do rim de ratinhos infectados com Cândida por pelo menos 4 horas após a transferência. NOTA: A fixação com paraformaldeído a 2% em PBS, não afecta negativamente a intensidade de fluorescência média dos neutrófilos marcados com Gr CellTrackereen ou CellTracker laranja por pelo menos 48 horas.

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Os autores declaram que não têm interesses conflitantes.

Apresentamos aqui um protocolo seguro, simples, rápido e económico para o isolamento de grandes números de neutrófilos na medula óssea de ratinhos com elevado grau de pureza e viabilidade usando uma abordagem de centrifugação em gradiente de densidade. Quando este protocolo é realizado correctamente, ~ 6-12 x 10 6 neutrófilos pode ser recuperado a partir de um rato não infectado e tantos como ~ 30-40 x 10 6 neutrófilos podem ser isolados a partir de um rato após a infecção, 6. Os neutróf...

Os neutrófilos são os leucócitos mais abundantes nos seres humanos. Eles são o principal componente celular do sistema imune inato e agir como uma primeira linha de defesa contra microorganismos invasores. Pacientes com neutropenia adquirida e imunodeficiências primárias que afetam os números de neutrófilos e / ou função desenvolver infecções bacterianas e fúngicas invasoras que ameaçam a vida, destacando a importância dessas células na defesa do hospedeiro 1. O reconhecimento imunológico dos patogénios invasores no local da infecção pelo seu padrão de reconhecimento de receptores de cognato resulta na indução de uma resposta imune inata orquestrada, o que leva à secreção de quimioatractivos que geram um gradiente quimiotáctica capaz de recrutamento de neutrófilos a partir da corrente sanguínea para o tecido inflamado 2 . Depois de introduzir os neutrófilos no local da infecção, eles tornam-se activados, que conduz à produção de citocinas e quimiocinas, absorção de agente patogénico, e me matar através oxidativo e não-oxidativochanisms 3. Além de seu papel bem reconhecida na imunidade inata, os neutrófilos têm também sido mostrado recentemente a desempenhar papéis importantes como iniciadores da resposta imune adaptativa eficaz 4. Por outro lado, para além do seu papel na imunidade de protecção, os neutrófilos podem também mediar lesão tecidual e imunopatologia devido à acumulação excessiva e / ou activação em locais de inflamação, como se mostra em uma variedade de doenças infecciosas e auto-imunes 5-7. Apesar de o papel indispensável de neutrófilos em montagem respostas imune inata eficazes e suas funções efetoras pleiotrópicos em várias doenças infecciosas e inflamatórias, dificuldades técnicas com a manipulação dessas células ea falta de protocolos experimentais de confiança tem dificultado a pesquisa com neutrófilos nas últimas décadas. Portanto, a utilização de ensaios reprodutíveis para o isolamento dos neutrófilos devem facilitar a investigação sobre neutrófilos mediada imunológicasfunções gica ex vivo e in vivo. Até à data, vários métodos têm sido descritos para o isolamento de neutrófilos, tais como a centrifugação do gradiente de densidade de sangue humano e de rato, ou medula óssea 8,9, enriquecimento imunomagnética positiva ou negativa dos neutrófilos do sangue ou da medula óssea do rato 10,11, e colhendo de neutrófilos da cavidade peritoneal de ratinhos a seguir à injecção intraperitoneal de tioglicolato ou outros agentes inflamatórios 12. Apesar de neutrófilos pode ser facilmente isolado em grande número a partir do sangue humano, este método é de qualidade inferior em ratos devido ao volume limitado de sangue de rato que impede o isolamento de neutrófilos suficientes para estudos funcionais ou experimentos de transferência adotivos 13. Além disso, embora o rendimento de tioglicolato-induziu as células da cavidade peritoneal é maior comparada com a de rato no sangue, a pureza dos neutrófilos na lavagem peritoneal inflamatória varia entre60-90%, e os neutrófilos isolados apresentam um fenótipo activado. Assim, as células recolhidas utilizando este método só pode ser utilizado para a realização de estudos funcionais activados, mas não de neutrófilos não estimulados, como a cavidade peritoneal do rato tem alguns neutrófilos no estado estacionário 12. Em vez disso, a medula óssea é um reservatório conveniente para colheita de grandes números de neutrófilos, quer não estimuladas ou ativadas 11,14, que podem então ser utilizadas para estudos funcionais a jusante, tais como fagocitose, matando e desgranulação, ou por transferência adoptiva em ratinhos receptores. Aqui nós descrevemos um método simples e rápido (~ 2 horas) protocolo, o que proporciona um alto rendimento (~ 6-12 × 10 6 neutrófilos / mouse não infectado, ou até 30-40 × 10 6 neutrófilos / mouse infectados) de puro (80 -95%) neutrófilos com&gt; 95% de viabilidade a partir da medula óssea. Este método utiliza Histopaque disponíveis comercialmente, que são a densidade de célula separada gradientemeios ração consistindo de Ficoll e diatrizoato de sódio, para separar os neutrófilos a partir da medula óssea de ratinhos. Este método produz números significativamente maiores de neutrófilos por ratinho em comparação com o sangue ou da cavidade abdominal, que pode ser utilizado para recolher os neutrófilos a partir de ratos, tanto no estado estacionário, ou após a infecção, e que é mais fácil a camada de comparação com o método de centrifugação em gradiente de densidade descontínuo que utiliza gradientes de Percoll consistem em 55% / 65% / 75% de Percoll em PBS 9. Além disso, o tempo e os recursos necessários para recolher neutrófilos puras são significativamente diminuída comparada com o isolamento dos neutrófilos utilizando separação de células activada por fluorescência. Além disso, porque este método não envolve uma etapa de enriquecimento imunomagnética, é mais rentável, e evita a exposição das células à coluna magnética e anticorpos, diminuindo assim a probabilidade de activação de neutrófilos. Além de realizar estudos funcionais de neutroph isoladoils ex vivo e transferência adoptiva de células em ratinhos receptores, este protocolo também descreve um método para a marcação de neutrófilos isolados, utilizando diferentes corantes CellTracker. Rotulagem diferencial de neutrófilos de ratos de diferentes origens genéticas pode ser adaptado em estudos de repovoamento competitivos para acompanhar os neutrófilos transferidos em tecidos de camundongos destinatário usando citometria de fluxo, o que pode fornecer uma visão mecanicista sobre o papel direto de genes específicos no tráfico de neutrófilos do sangue em órgãos-alvo inflamadas 6.

<table><tbody><tr><td>&nbsp;</td><td></td><td></td><td>Reagents</td></tr><tr><td>RPMI 1640 1X com L-glutamina e HEPES 25 mM</td><td>Cellgro</td><td>10-041-CV&</td><td>nbsp;</td></tr><tr><td>Soro Fetal Bovino (Inativado pelo Calor)</td><td>GemCell</td><td>100500</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Penicilina/Estreptomicina (10.000 unidades de penicilina / 10.000 mg/ml de estreptococos)</td><td>GIBCO</td><td>15140</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>0.5 M EDTA</td><td>Quality Biological Inc</td><td>351-027-101</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Cloreto de sódio a 0,2% e 1,6%</td><td>JT Baker</td><td>3624</td><td>Soluções de cloreto de sódio preparadas com água destilada e filtrada estéril</td></tr><tr><td>Filtrado estéril Histopaque 1077</td><td>Sigma</td><td>10771</td><td>Histopaque 1077 precisa ser levado a 18-26 &graus; C antes</td></tr><tr><td>do uso Histopaque 1119</td><td>Sigma</td><td>11191</td> filtrado estéril <td>Histopaque 1119 precisa ser levado a 18-26 &deg; C antes de usar</td></tr><tr><td>Solução salina tamponada com fosfato (PBS) sem cálcio e magnésio</td><td>Cellgro</td><td>210-40-CV&</td><td>nbsp;</td></tr><tr><td>Álcool Etílico (200 provas)</td><td>The Warner Graham Company</td><td>64-17-5</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>CellTracker Green (CMFDA, diacetato de 5-clorometilfluoresceína)</td> <td>Invitrogen</td><td>C-7025</td><td>Faça soluções de estoque de 10 mM em DMSO, alíquota e armazene a -80 &graus; C</td></tr><tr><td>CellTracker Laranja (CMTMR, 5-(e 6)-4-Clorometilbenzoil Amino Tetrametilrodamina)</td><td>Invitrogen</td><td>C-2927</td><td>Faça soluções de estoque de 10 mM em DMSO, alíquota e armazene a -80 &graus; C</td></tr><tr><td>Anti-mouse CD45 (Clone 30-F11)</td><td>eBioscience</td><td>170451-82</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Anti-mouse Ly6G (Clone 1A8)</td><td>BD Pharmingen</td><td>551461</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Anti-mouse Ly6G (Clone 1A8)</td><td>BD Pharmingen</td><td>560599</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Anti-mouse CD11b (Clone M1/70)</td><td>eBioscience</td><td>47-0112-82</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Anti-mouse CD16/CD32 (Mouse BD Fc Block)</td><td>BD Pharmingen</td><td>553141</td><td>Use na diluição de 1:100</td></tr><tr><td>LIVE/DEAD Kit de Coloração de Células Mortas Azuis Fixável</td><td>Sondas Moleculares</td><td>L-23105</td><td>Use na diluição 1:1000</td></tr><tr><td>Dimetilsulfóxido (DMSO)</td><td>Sigma</td><td>67-68-5</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Solução de Paraformaldeído, 4% em PBS</td><td>USB Corporation</td><td>19943</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>&nbsp;</td><td></td><td></td><td><forte>Tabela 1. Reagentes para isolamento, marcação e rastreamento de neutrófilos transferidos adotivamente.</td></tr><tr><td>&nbsp;</td><td></td><td></td><td><forte>Materiais</forte></td></tr><tr><td>C57BL/6 camundongos</td><td>Taconic</td><td></td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Tubos de centrífuga de 15 ml</td><td>Corning</td><td>430053</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Tubos de centrífuga de 50 ml</td><td>BD Falcon</td><td>352070</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Pipetas sorológicas de 25 ml</td><td>Celltreat</td><td>229225B</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Pipetas sorológicas de 10 ml</td><td>Celltreat</td><td>229210B</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Pipetas sorológicas de 5 ml</td><td>Celltreat</td><td>229205B</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Pipetas Pasteur (3 ml)</td><td>BD Falcon</td><td>357575</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Seringas de 12 ml</td><td>Kendall monoject</td><td>512878</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>25 G x 5/8 pol. Agulhas (agulhas de deslizamento de precisão)</td><td>BD</td><td>305122</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Filtros de células de 100 mm</td><td>BD Falcon</td><td>352360</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Placas de Petri bactericidas</td><td>BD Falcon</td><td>351029</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Combitips Plus Biopur</td><td>Eppendorf</td><td>2249608-5</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Instrumentos de dissecação de ratos (Tesoura, fórceps, bisturi)</td> <td>Instrumentos de Pesquisa Biomédica</td><td>10-2300, 10-2165, 25-1200, 26-1000</td><td>Instrumentos esterilizados antes do uso</td></tr><tr><td>&nbsp;</td><td></td><td></td><td><forte>Equipamento</forte></td></tr><tr><td>Capuz de cultura de tecidos</td><td>The Baker Company</td><td>SG403</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Centrífuga refrigerada</td><td>Thermo Fischer Scientific</td><td>75004521</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>37 &graus; C banho-maria agitado</td><td>Thermo Fischer Scientific</td><td>3166721</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>&nbsp;</td><td></td><td></td><td><forte>Tabela 2. Lista de Materiais e Equipamentos utilizados neste protocolo.</td></tr></tbody></table>

isolamento, purificação e rotulagem de neutrófilos da medula óssea do rato de estudos funcionais e experimentos de transferência adotiva

Isolation, Purification and Labeling of Mouse Bone Marrow Neutrophils for Functional Studies and Adoptive Transfer Experiments

Os neutrófilos são células efetoras críticos do sistema imune inato. Eles são rapidamente recrutados em locais de inflamação aguda e exercem efeitos protectores ou patogénicos, dependendo do meio inflamatório. No entanto, apesar de o papel indispensável dos neutrófilos na imunidade, a compreensão detalhada dos fatores moleculares que medeiam efeitos efetoras e imunopatogênico &#39;neutrófilos em diferentes doenças infecciosas e inflamatórias ainda está faltando, em parte por causa de sua meia-vida curta, as dificuldades com a manipulação destes células ea falta de protocolos experimentais confiáveis ​​para a obtenção de um número suficiente de neutrófilos para estudos funcionais jusante e experimentos de transferência adotiva. Portanto, os métodos simples, rápido, econômico e confiável são altamente desejáveis ​​para a colheita de um número suficiente de neutrófilos de rato para avaliar funções, tais como fagocitose, morte, produção de citocinas, degranulação e tráfico. Para esse fim,apresentamos um protocolo de gradiente de densidade reprodutíveis baseado centrifugação, que pode ser adaptada em qualquer laboratório para isolar um grande número de neutrófilos na medula óssea de ratinhos com elevado grau de pureza e viabilidade. Além disso, apresenta-se um protocolo simples, que utiliza tintas, CellTracker para rotular os neutrófilos isolados, que podem então ser transferidos adoptivamente para ratinhos receptores e rastreadas em vários tecidos, pelo menos, quatro horas após a transferência usando citometria de fluxo. Utilizando esta abordagem, a rotulagem diferencial de neutrófilos de ratinhos de tipo selvagem e o gene deficiente, com diferentes corantes CellTracker pode ser empregue com sucesso para realizar estudos de repovoamento competitivo para avaliar o papel directo de genes específicos no tráfico de neutrófilos do sangue para os tecidos alvo in vivo .

Este protocolo é otimizado para a colheita de células da medula óssea de camundongos e posterior separação de neutrófilos a partir dessas células por centrifugação em gradiente de densidade, utilizando meios de separação Histopaque celulares disponíveis no mercado. Os neutrófilos isolados utilizando este método pode ser usado para uma variedade de estudos funcionais a jusante ex vivo e para experiências de transferência adoptiva em ratinhos receptores. O rendimento típico da recolha...

Descreve-se um protocolo para o isolamento e purificação de neutrófilos de medula óssea do rato por centrifugação de gradiente de densidade e de neutrófilos para rotulagem com corantes CellTracker. Isso representa um método simples, rápido, reprodutível e econômica para a obtenção de um grande número de neutrófilos para estudos funcionais a jusante ou de transferência e controle de experimentos adotivos.

Isolamento, purificação e Rotulagem de neutrófilos da medula óssea do rato de Estudos funcionais e Experimentos de transferência adotiva

Neutrophils are critical effector cells of the innate immune system. They are rapidly recruited at sites of acute inflammation and exert protective or ...

O objetivo geral deste procedimento é isolar e rotular neutrófilos da medula óssea de camundongo para estudos funcionais subsequentes e experimentos de transferência adotiva. Isso é realizado primeiramente coletando as células da medula óssea dos fêmures e tíbias de camundongos. Na segunda etapa, as hemácias são lisadas osmoticamente mediante suspensão sequencial em soluções de cloreto de sódio a 0,2% e 1,6%, respectivamente.Em seguida, os neutrófilos são isolados por centrifugação em gradiente de densidade. Na etapa final, os neutrófilos são marcados com corantes rastreadores de células. Por fim, a citometria de fluxo pode ser utilizada para determinar o número de neutrófilos transferidos adotivamente recrutados para diversos tecidos de camundongos.A principal vantagem do isolamento de neutrófilos de camundongo a partir da medula óssea, em vez do sangue ou do peritônio, é que um grande número de células suficiente para estudos funcionais e experimentos de transferência adotiva pode ser obtido da medula óssea tanto em estado de equilíbrio quanto após infecção. A vantagem do uso da técnica de centrifugação em gradiente para o isolamento de neutrófilos de camundongo, em comparação com a seleção imunomagnética ou a triagem de células ativada por fluorescência, é que ela é rápida, econômica e evita a marcação dos neutrófilos com anticorpos, o que pode induzir a ativação dos neutrófilos. Demonstrando o procedimento estará Muca Swami Us, um técnico do meu laboratório, após pulverizar um camundongo eutanasiado com etanol a 70%.Realize uma incisão na região abdominal média da pele do animal e, em seguida, remova o tecido da pele da parte distal do animal, incluindo as extremidades inferiores. A seguir, use uma tesoura para cortar os músculos das patas traseiras do animal e, com cuidado, desloque o osso do acetábulo da articulação do quadril, evitando quebrar a cabeça do fêmur. Em seguida, use a tesoura como um bisturi para remover o músculo remanescente do fêmur e da tíbia.Se pare os ossos das pernas na articulação do joelho, tomando cuidado para não quebrar as extremidades dos ossos, e depois coloque os ossos em uma placa de Petri contendo RPMI 1640 gelado. Suplemente com FBS e antibióticos. Transfira a placa para uma cabine de cultura de tecidos e, em seguida, esterilize a superfície externa de cada osso com etanol 70% em uma nova placa de Petri.Após cerca de 10 a 15 segundos, enxágue o etanol da superfície de cada osso com três lavagens subsequentes em PBS estéril e frio com gelo. Em seguida, corte e coloque a epífise de cada osso em uma nova placa de Petri estéril. A seguir, acople uma agulha de 25 gauge a uma seringa de 12 cc contendo 10 mililitros de RPMI.Suplemente com FBS e EDTA. Em seguida, lave as células da medula óssea de ambas as extremidades do eixo de cada par fêmur-tíbia para um tubo cônico de 50 mililitros com tampa de rosca, passando por um filtro de 100 micrômetros para remover todas as células. Raspe as superfícies internas dos ossos com a ponta da agulha.Quando os ossos aparecerem esbranquiçados, as células terão sido removidas adequadamente. Agora, use um bisturi para cortar as epífises ósseas em pequenos fragmentos Q de 0,5 a um milímetro e, em seguida, use a extremidade traseira de uma ponteira de pipeta de 2,5 mililitros einor comb mais ponteira BioPure para esmagá-los através do filtro de 100 micrômetros. Após centrifugar as células colhidas por sete minutos a 427 vezes G e quatro graus Celsius, lise as células vermelhas do sangue em 20 mililitros de cloreto de sódio 0,2% por aproximadamente 20 segundos.Em seguida, interrompa a lise com 20 mililitros de cloreto de sódio 1,6%, centrifugue as células e, então, ressuspenda o pellet em RPMI 1640 suplementado com FBS e EDTA. Conte as células e, após centrifugá-las novamente, ressuspenda o pellet lavado em no máximo 100 vezes 10 à sexta células por um mililitro de PBS estéril gelado. Agora distribua três mililitros de solução opaca his 1 1 1 9 a 18 a 26 graus Celsius em um tubo cônico de 15 mililitros e, então, sobreponha lentamente três mililitros da mesma solução a 18 a 26 graus Celsius.Sua opaco 1 0 7 7. Evite misturar as duas densidades imediatamente após preparar o seu opaco; cuidadosamente, sobreponha a suspensão de células da medula óssea sobre o seu opaco 1 0 7 7 e centrifugue o gradiente de densidade por 30 minutos a 834 ×g e 25 °C sem frear, e então colete os neutrófilos na interface das camadas do seu opaco 1 1 1 9 e 1 0 7 7. Após lavar os neutrófilos coletados duas vezes em RPMI 1 6 4 0 FBS e antibióticos, ressuspenda as células a cinco vezes 10⁶ células por mililitro em PBS pré-aquecido a 37 °C.Após a contagem das células, reserve uma pequena alíquota de cada amostra experimental para determinar a pureza e a viabilidade por citometria de fluxo e, em seguida, marque os neutrófilos remanescentes com um corante rastreador celular em uma concentração final de cinco micromolar durante 10 minutos a 37 graus Celsius em banho-maria agitado e no escuro. Por fim, lave as células duas vezes com RPMI 1640 gelado suplementado com FBS e antibióticos para evitar contaminação cruzada do corante antes de misturar as populações de neutrófilos diferencialmente marcados para estudos competitivos de repovoamento subsequente. Neste painel, são mostrados gráficos representativos de citometria de fluxo de neutrófilos isolados por gradiente de densidade da medula óssea de um camundongo C57BL/6 não infectado. O primeiro gate utilizado para as células da medula óssea coletadas na interface de Histopaque 1119 e Histopaque 1077.Utilizando dispersão direta e lateral, demonstra-se que os neutrófilos separados por gradiente de densidade apresentam pureza superior a 90% e viabilidade maior que 95% por pelo menos quatro horas após a transferência adotiva com marcador celular. Neutrófilos marcados com DIA podem ser rastreados por citometria de fluxo em diversos tecidos do camundongo. Por exemplo, no sangue, medula óssea e rins do camundongo receptor infectado com Candida, C57BL/6, mostrado neste experimento por seleção nas células vivas CD45 LY6G CD11B, esses neutrófilos representativos transferidos adotivamente, marcados com CMTMR, podem ser diferenciados dos neutrófilos nativos, negativos para CMTMR e PE, do camundongo receptor pela sua expressão de PE.Uma vez dominado, o isolamento e rotulagem dos neutrófilos da medula óssea de camundongo pode ser concluído em três horas.

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Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Imunologia e Infecção

O transplante de medula óssea oferece uma maneira de alterar o genótipo de células derivadas de medula óssea. Se o gene de interesse é expresso em ambas as células de medula óssea e células derivadas de medula óssea não derivados, transplante de medula óssea pode mudar as células de medula óssea derivadas de um genótipo diferente sem alterar a non-bone marrow genótipo celular derivada.

Diferenciando papéis funcionais da expressão do gene de células imunes e não-imunes na colite Rato por Transplante de Medula Óssea

Aqui apresentamos um protocolo que gera grandes quantidades de monócitos murinos a partir de medula óssea heterogênea para aplicações translacionais. Em comparação com outros, esse novo método ajuda a reduzir o número de animais sacrificados e reduz os custos, evitando métodos caros, como a separação de células magnéticas de alto gradiente (MACS).

Isolamento e injecção intravenosa de Murino de Medula Óssea Derivado monócitos

Este manuscrito fornece um processo técnico que pode ser utilizado para caracterizar culturas de células C1498 in vitro e a leucemia aguda induzida em ratos após a sua injecção. análises fenotípicas e funcionais são realizadas utilizando citometria de fluxo, microscopia de imunofluorescência, citoquímica e coloração May-Grünwald Giemsa.

Um protocolo detalhado para caracterizar a linhagem celular murina C1498 e seu Modelo Associated leucemia mouse

Novos protocolos são descritos aqui para isolar e caracterizar micropartículas derivadas de humanos e neutrófilos de rato. Estes protocolos utilizam ultracentrifugação, citometria de fluxo e immunoblotting técnicas para analisar o conteúdo de micropartículas, e eles podem ser usados para estudar o papel das micropartículas derivados de vários tipos de células na função celular.

Isolamento e caracterização de micropartículas de neutrófilos-derivado para estudos funcionais

Demonstramos como identificar e isolar 6 subconjuntos de progenitores mieloides de murino medula óssea usando uma combinação de magnética e fluorescência classificação (MACS e FACS). Este protocolo pode ser usado para ensaios em vitro cultura (culturas metilcelulose ou líquido), na vivo experiências de transferência adotiva e análises de RNA/proteína.

Identificação e isolamento de oligopotentes e confirmada por linhagem mieloides progenitores da medula óssea de rato

Aqui, apresentamos um protocolo para a determinação na vivo da ativação de células (células T) de T CD4 naïve, proliferação e diferenciação de células Th1 induzida pela medula óssea de GM-CSF (BM)-derivado de células dendríticas (DCs). Além disso, este protocolo descreve isolamento BM e células T, geração de DC e DC e células T transferência adotiva.

Um modelo de rato In Vivo para ativação de células T Naïve CD4 medida, proliferação e diferenciação de células Th1 induzida pelas células dendríticas derivadas de medula óssea

Este método descreve a purificação por citometria de fluxo de MEP e MKp de fêmures, tíbias e ossos pélvicos.

Isolamento de Progenitores de Megacaiócitos de Rato

Esta pesquisa descreve duas técnicas para isolar abundantes armadilhas extracelulares de neutrófilos (NETs) da medula óssea de ratos. Um método combina um kit comercial de isolamento de neutrófilos com centrifugação por gradiente de densidade, enquanto o outro emprega apenas centrifugação por gradiente de densidade. Ambas as abordagens produzem NETs funcionais superando as dos neutrófilos do sangue periférico.

Abordagem única para isolar neutrófilos de medula óssea de rato com capacidade comparável

Este protocolo descreve um método não enzimático e direto para isolar células da medula óssea de camundongos neonatais de 7 a 9 dias de idade e gerar macrófagos diferenciados usando um sobrenadante de células L929 como fonte de fator estimulador de colônias de granulócitos (M-CSF). Os macrófagos derivados da medula óssea foram posteriormente analisados quanto aos antígenos de superfície F4/80, CD206, CD11b e competência funcional.

Isolamento da medula óssea de camundongos neonatais e preparação de macrófagos derivados da medula óssea

Este manuscrito descreve um protocolo para preparar uma biblioteca ATAC-seq de neutrófilos da medula óssea murina, com o objetivo de garantir a viabilidade ideal dos neutrófilos e a alta qualidade da biblioteca. Ele oferece instruções passo a passo sobre a preparação do BMC, classificação imunomagnética e construção de bibliotecas, servindo como um guia valioso, especialmente para iniciantes no estudo de neutrófilos.

Biblioteca ATAC-Seq Preparação de neutrófilos derivados da medula óssea murina

Aprenda a isolar e rotular neutrófilos da medula óssea de camundongos usando centrifugação em gradiente de densidade e corantes CellTracker. Este método econômico e reprodutível permite estudos funcionais e experimentos de transferência adotiva.

Isolamento, purificação e Rotulagem de neutrófilos da medula óssea do rato de Estudos funcionais e Experimentos de transferência adotiva (Vídeo) | JoVE Journal

Isolamento, purificação e Rotulagem de neutrófilos da medula óssea do rato de Estudos funcionais e Experimentos de transferência adotiva

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