Isolamento, purificação e Rotulagem de neutrófilos da medula óssea do rato de Estudos funcionais e Experimentos de transferência adotiva

O objetivo geral deste procedimento é isolar e rotular neutrófilos da medula óssea de camundongo para estudos funcionais subsequentes e experimentos de transferência adotiva. Isso é realizado primeiramente coletando as células da medula óssea dos fêmures e tíbias de camundongos. Na segunda etapa, as hemácias são lisadas osmoticamente mediante suspensão sequencial em soluções de cloreto de sódio a 0,2% e 1,6%, respectivamente.

Em seguida, os neutrófilos são isolados por centrifugação em gradiente de densidade. Na etapa final, os neutrófilos são marcados com corantes rastreadores de células. Por fim, a citometria de fluxo pode ser utilizada para determinar o número de neutrófilos transferidos adotivamente recrutados para diversos tecidos de camundongos.

A principal vantagem do isolamento de neutrófilos de camundongo a partir da medula óssea, em vez do sangue ou do peritônio, é que um grande número de células suficiente para estudos funcionais e experimentos de transferência adotiva pode ser obtido da medula óssea tanto em estado de equilíbrio quanto após infecção. A vantagem do uso da técnica de centrifugação em gradiente para o isolamento de neutrófilos de camundongo, em comparação com a seleção imunomagnética ou a triagem de células ativada por fluorescência, é que ela é rápida, econômica e evita a marcação dos neutrófilos com anticorpos, o que pode induzir a ativação dos neutrófilos. Demonstrando o procedimento estará Muca Swami Us, um técnico do meu laboratório, após pulverizar um camundongo eutanasiado com etanol a 70%.

Realize uma incisão na região abdominal média da pele do animal e, em seguida, remova o tecido da pele da parte distal do animal, incluindo as extremidades inferiores. A seguir, use uma tesoura para cortar os músculos das patas traseiras do animal e, com cuidado, desloque o osso do acetábulo da articulação do quadril, evitando quebrar a cabeça do fêmur. Em seguida, use a tesoura como um bisturi para remover o músculo remanescente do fêmur e da tíbia.

Se pare os ossos das pernas na articulação do joelho, tomando cuidado para não quebrar as extremidades dos ossos, e depois coloque os ossos em uma placa de Petri contendo RPMI 1640 gelado. Suplemente com FBS e antibióticos. Transfira a placa para uma cabine de cultura de tecidos e, em seguida, esterilize a superfície externa de cada osso com etanol 70% em uma nova placa de Petri.

Após cerca de 10 a 15 segundos, enxágue o etanol da superfície de cada osso com três lavagens subsequentes em PBS estéril e frio com gelo. Em seguida, corte e coloque a epífise de cada osso em uma nova placa de Petri estéril. A seguir, acople uma agulha de 25 gauge a uma seringa de 12 cc contendo 10 mililitros de RPMI.

Suplemente com FBS e EDTA. Em seguida, lave as células da medula óssea de ambas as extremidades do eixo de cada par fêmur-tíbia para um tubo cônico de 50 mililitros com tampa de rosca, passando por um filtro de 100 micrômetros para remover todas as células. Raspe as superfícies internas dos ossos com a ponta da agulha.

Quando os ossos aparecerem esbranquiçados, as células terão sido removidas adequadamente. Agora, use um bisturi para cortar as epífises ósseas em pequenos fragmentos Q de 0,5 a um milímetro e, em seguida, use a extremidade traseira de uma ponteira de pipeta de 2,5 mililitros einor comb mais ponteira BioPure para esmagá-los através do filtro de 100 micrômetros. Após centrifugar as células colhidas por sete minutos a 427 vezes G e quatro graus Celsius, lise as células vermelhas do sangue em 20 mililitros de cloreto de sódio 0,2% por aproximadamente 20 segundos.

Em seguida, interrompa a lise com 20 mililitros de cloreto de sódio 1,6%, centrifugue as células e, então, ressuspenda o pellet em RPMI 1640 suplementado com FBS e EDTA. Conte as células e, após centrifugá-las novamente, ressuspenda o pellet lavado em no máximo 100 vezes 10 à sexta células por um mililitro de PBS estéril gelado. Agora distribua três mililitros de solução opaca his 1 1 1 9 a 18 a 26 graus Celsius em um tubo cônico de 15 mililitros e, então, sobreponha lentamente três mililitros da mesma solução a 18 a 26 graus Celsius.

Sua opaco 1 0 7 7. Evite misturar as duas densidades imediatamente após preparar o seu opaco; cuidadosamente, sobreponha a suspensão de células da medula óssea sobre o seu opaco 1 0 7 7 e centrifugue o gradiente de densidade por 30 minutos a 834 ×g e 25 °C sem frear, e então colete os neutrófilos na interface das camadas do seu opaco 1 1 1 9 e 1 0 7 7. Após lavar os neutrófilos coletados duas vezes em RPMI 1 6 4 0 FBS e antibióticos, ressuspenda as células a cinco vezes 10⁶ células por mililitro em PBS pré-aquecido a 37 °C.

Após a contagem das células, reserve uma pequena alíquota de cada amostra experimental para determinar a pureza e a viabilidade por citometria de fluxo e, em seguida, marque os neutrófilos remanescentes com um corante rastreador celular em uma concentração final de cinco micromolar durante 10 minutos a 37 graus Celsius em banho-maria agitado e no escuro. Por fim, lave as células duas vezes com RPMI 1640 gelado suplementado com FBS e antibióticos para evitar contaminação cruzada do corante antes de misturar as populações de neutrófilos diferencialmente marcados para estudos competitivos de repovoamento subsequente. Neste painel, são mostrados gráficos representativos de citometria de fluxo de neutrófilos isolados por gradiente de densidade da medula óssea de um camundongo C57BL/6 não infectado. O primeiro gate utilizado para as células da medula óssea coletadas na interface de Histopaque 1119 e Histopaque 1077.

Utilizando dispersão direta e lateral, demonstra-se que os neutrófilos separados por gradiente de densidade apresentam pureza superior a 90% e viabilidade maior que 95% por pelo menos quatro horas após a transferência adotiva com marcador celular. Neutrófilos marcados com DIA podem ser rastreados por citometria de fluxo em diversos tecidos do camundongo. Por exemplo, no sangue, medula óssea e rins do camundongo receptor infectado com Candida, C57BL/6, mostrado neste experimento por seleção nas células vivas CD45 LY6G CD11B, esses neutrófilos representativos transferidos adotivamente, marcados com CMTMR, podem ser diferenciados dos neutrófilos nativos, negativos para CMTMR e PE, do camundongo receptor pela sua expressão de PE.

Uma vez dominado, o isolamento e rotulagem dos neutrófilos da medula óssea de camundongo pode ser concluído em três horas.