Geneticamente codificados Molecular Probes para estudar G receptores acoplados à proteína

O objetivo geral do experimento a seguir é introduzir uma única sonda informativa em receptores acoplados à proteína G-alvo para facilitar estudos estruturais e dinâmicos de complexos de sinalização. Isso é alcançado mediante a transfecção de células com os plasmídeos necessários para expressar a maquinaria traducional requerida para incorporar o aminoácido não natural zeto, fenilalanina ou zeto fee em um GPCR expresso. A variante de GPCR com zeto fee pode então ser aplicada de três maneiras diferentes para investigar a estrutura e a função do receptor.

Primeiro, o zeto fee é utilizado como um crosslinker ativado por luz no GPCR, o que permite a identificação do sítio de ligação de um ligante tritiado. Em seguida, o zeto fee pode ser usado como uma alça química reativa para acoplar um peptídeo conjugado ou uma sonda fluorescente ao GPCR por meio de químicas de marcação bioortogonal. Os resultados obtidos demonstram o uso da sonda molecular zeto fee em cross-linking fotossensível direcionado, marcação de epítopos direcionada e marcação fluorescente de GPCRs com base em métodos bioquímicos e em células vivas. A principal vantagem dessa técnica em relação a métodos existentes, como o uso de ligantes de afinidade fotossensível ou marcação de cisteína, é a flexibilidade para introduzir de forma específica em um sítio conhecido do receptor-alvo um aminoácido não natural, biologicamente inerte e reativo, denominado P-zeto fenilalanina.

Este método pode ajudar a responder perguntas-chave na área de sinalização de receptores acoplados à proteína G, incluindo o mapeamento dos sítios de interação em um complexo receptor LIG no ambiente nativo da membrana, e facilitar estudos fluorescentes de molécula única ao identificar posições em A-G-P-C-R adequadas para marcação bioortogonal. Terceiro, este método pode fornecer informações sobre o mecanismo molecular dos receptores acoplados à proteína G e também pode ser aplicado a outros sistemas, como diversas proteínas celulares e de membrana. Antes de iniciar este experimento, mantenha as células HEC 2 9 3 T em meio mínimo essencial modificado por Eagle, suplementado com 10% de soro bovino fetal a 37 graus Celsius em uma atmosfera de 5% CO2.

Transfecte as células com 60 a 80% de confluência em uma placa de 10 centímetros com G pcr, r CD, NA utilizando o reagente lipectomy plus conforme descrito no protocolo do texto. No dia seguinte, substitua o meio de crescimento por DMEM contendo 10% de FBS e 0,5 milimolar de fee. Analise a expressão 48 horas após a transfeção conforme descrito no texto.

Prossiga para os procedimentos de foto, reticulação ou marcação conforme descrito no restante deste vídeo. Quarenta e oito horas após a transfeção, aspire o meio das células e substitua por quatro mililitros de solução salina tamponada com fosfato 1 x ou PBS, e retorne à temperatura de 37 graus Celsius por 15 minutos para que as células se desprendam da placa. Em seguida, re-suspenda as células em PBS 1 x e transfira para um tubo Falcon. Centrifugue a 1500 RPM por dois minutos.

Para obter o pellet celular, aspire o sobrenadante antes de ressuspender o pellet celular em uma solução salina tamponada com Hanks 1x contendo o ligante tritiado na concentração de ligação saturante, preparada conforme descrito no protocolo do texto. Incube o pellet a 37 graus Celsius pelo tempo necessário para garantir a formação do complexo receptor-ligante, o qual depende do receptor e ligante específicos. Em seguida, transfira a suspensão celular para uma placa de 24 poços ou 96 poços.

Em seguida, fotossative o zeto fee usando uma lâmpada de ultravioleta a 365 nanômetros por 15 minutos a quatro graus Celsius, mantendo a placa em gelo para evitar o aquecimento da amostra e a lise celular. Após a ativação fotossensível, transfira as células para um tubo einor e centrifugue para formar o pellet celular após a centrifugação. Remova o sobrenadante e prossiga para a análise.

Resuspenda o pellet celular em tampão de lise e incube as células por uma hora a quatro graus Celsius. Em seguida, centrifugue o lisado celular por 10 minutos a 16.000 ×g. Antes de transferir o sobrenadante para um novo tubo, adicione anticorpo monoclonal 1D quatro ligado à resina SROs dois B ao sobrenadante e incube durante a noite a quatro graus Celsius para imunopurificar o RCPG utilizando o epítopo de anticorpo monoclonal 1D quatro na extremidade C modificada. No dia seguinte, lave as microesferas várias vezes com tampão de lise. Elua as amostras com SDS 1% a 37 graus Celsius por uma hora com agitação.

Transfira uma porção do EENT para um frasco de 15 mililitros contendo fluido de cintilação e conte em um contador de cintilação beta para quantificar a quantidade de ligação específica do ligante tritiado ao receptor. Resolva o EENT purificado restante por eletroforese em gel padrão utilizando um gel de SDS de 4 a 12% com marcador padrão de proteínas. Em seguida, faça a transferência semisseca para membrana A-P-V-D-F para imunodetecção.

Bloqueie a membrana de PVDF com leite a 5% em tampão TBS contendo Tween 20 a 0,05%. Prove a membrana para confirmar a expressão do receptor de comprimento completo com o anticorpo monoclonal 1D four, seguido pelo anticorpo secundário anti-US IgG conjugado à HRP. Em seguida, trate a membrana com reagente de quimioluminescência amplificada.

Exponha a membrana a um filme de auto-radiografia para visualizar as bandas. Em seguida, corte a membrana com uma lâmina de barbear para separar cada poço de amostra e depois corte nos marcadores específicos de peso molecular. Transfira os segmentos da membrana para frascos contendo líquido cintilador e, então, quantifique a quantidade de trítio em cada segmento da membrana por contagem em um contador cintilador de radiação beta.

Identifique a ligação cruzada fotopositiva pela detecção de trítio na massa molecular aparente igual à soma do RCPG e do ligante. Após lavagem e contagem de células, pré-trate uma placa de 96 poços com fundo transparente de alta ligação com 100 microlitros de 10 microgramas por mililitro de poli-D-lisina por poço e incube por 30 minutos à temperatura ambiente.

Em seguida, lave repetidamente com um XPBS antes de deixar secar ao ar e plaque as células transfectadas em 200 microlitros a uma densidade de 60 a 80.000 células por poço em uma placa de 96 poços e retorne a 37 graus Celsius em uma atmosfera com 5% de CO2. No dia seguinte.

Prepare as células para marcação. Lave suavemente as células três vezes com 100 microlitros por poço usando um XPBS para remover qualquer meio de crescimento contendo zeto fee. Prepare um tampão contendo 50 a 200 micromolares do reagente de marcação flag Tri AAL PHOSPHINE conforme descrito no protocolo do texto.

Adicione 60 microlitros a cada poço. Mantenha um conjunto de poços sem tratamento com marcador e com tampão. Inclua também um controle de GPCR do tipo selvagem para comparar com a variância de GPCR de alimento zeto.

Retorne a placa a 37 graus Celsius entre 30 minutos e quatro horas após a incubação. Lave as células três vezes com 100 microlitros por poço de tampão bloqueador para remover completamente o marcador não reativo. Em seguida, adicione 100 microlitros por poço de paraformaldeído 4% às células após incubação por 20 minutos em temperatura ambiente.

Lave as células três vezes com o tampão de bloqueio. Realize um protocolo padrão de EISA de superfície celular para detectar o receptor marcado e a expressão do receptor, primeiro incubando com o anticorpo primário por 1,5 horas no gelo. Em seguida, faça uma incubação com o anticorpo secundário à temperatura ambiente por uma hora.

Em seguida, adicione 100 microlitros do anticorpo secundário Anti-Flag M diluído para detectar o epítopo do peptídeo Flag do reagente de marcação com fosfina Tri AAL. Também analise poços não marcados como controle negativo.

Em seguida, adicione o anticorpo anti-CCR5 2D7 diluído a conjuntos separados de poços para determinar o tipo selvagem ou zeto fee. Expressão da superfície celular de GPCR. Lave as células três vezes com tampão bloqueador e incube com 100 microlitros do anticorpo anti-IgG de cabra conjugado à HRP diluído.

Após lavar cuidadosamente as células cinco vezes com o tampão de bloqueio, adicione 50 microlitros de tampão de detecção e incube por 15 minutos à temperatura ambiente. Por fim, colete os dados espectrais em um leitor de placas multipoços com fluorescência com comprimento de onda de excitação de 530 nanômetros e comprimento de onda de emissão de 590 nanômetros. Inicie o procedimento de marcação lisando 10 milhões de células colhidas que expressem o tipo selvagem ou zeto fee.

Variação da opsina de bastonetes em um mililitro de tampão de solubilização durante uma hora a quatro graus Celsius. Colete a fração sobrenadante após a centrifugação do lisado celular a 15.000 ×g por 10 minutos. Em seguida, adicione 100 microlitros de anticorpo monoclonal 1D quatro ligado à resina Spheros dois B para capturar o receptor utilizando o epítopo 1D quatro no extremo C terminal modificado.

Após incubação por 12 horas a quatro graus Celsius, lave a resina três vezes conforme descrito no protocolo no texto. Em seguida, marque o receptor imobilizado na matriz de imunoafinidade adicionando 0,1 milimolar de fosfina fluorescente a um volume total de 0,3 a 0,5 mililitros, incube por 12 horas à temperatura ambiente antes de centrifugar após a remoção do sobrenadante. Lave a resina para remover qualquer marcador não reagido e elua o receptor marcado com 100 microlitros de tampão Elian mediante incubação no gelo por uma hora.

Realize a separação das amostras marcadas por SDS-PAGE em condições redutoras. Lave brevemente os géis em PBS antes da marcação de um zeto fee. GPCR por fluorescência Ingel utilizando um scanner de fluorescência confocal com laser de comprimento de onda de 488 nanômetros para detectar o receptor modificado com fluoresceína.

A metodologia de mutagênese com aminoácidos não naturais foi utilizada para introduzir especificamente sondas moleculares no sítio C da A-G-P-C-R, empregando a tecnologia de supressão do códon âmbar. A técnica de reticulação fotoinduzida pode então ser usada para investigar os aspectos estruturais de complexos entre ligantes e receptores acoplados a proteínas G em células vivas, utilizando um ligante de pequena molécula marcado com radiação, o tritiado. Ravi Rock foi utilizado para identificar seu sítio de ligação no G-P-C-R-C-C-R cinco.

Neste exemplo, a irradiação UV em células que expressam zeto fee. CCR cinco variante pré-incubadas com Ravi tritiado. Rock resulta em complexos ligados covalentemente que podem ser identificados utilizando a marcação radioativa sensível no ligante.

Entre as várias posições no CCR5, a lucina 28 zeto fee e o triptofano 86 zeto fee demonstraram capacidade de fotoconexão cruzada com o Ravi Rock tritiado, conforme representado por contagens de cintilação significativamente mais altas. O receptor selvagem não apresentou conexão cruzada com o ligante radioativo. As químicas de marcação bioortogonal podem ser usadas para modificar especificamente um zeto fee no sítio C.

A variância do RCPG envolve uma estratégia que consiste na marcação direcionada de epítopos de A-G-P-C-R em células vivas, utilizando um marcador conjugado a um peptídeo flag. O reagente de marcação TRIS-FOSFINA é usado para modificar de forma específica e seletiva um zeto fee. A variância do CCR5 mostrada aqui representa dados obtidos a partir de uma estratégia de detecção EISA sensível e de múltiplas etapas, utilizada para identificar posições marcadas com o peptídeo flag.

Entre as posições investigadas no CCR5, todas as variantes zeto exibiram sinal. As variantes do CCR5 foram expressas na superfície celular e aproximadamente metade delas sofreu com sucesso marcação direcionada do epítopo; o CCR5 selvagem serviu como controle negativo para a marcação do epítopo, demonstrado pela ausência de sinal anti-Flag. Em uma estratégia alternativa, zeto feed GPCRs solubilizados com detergente e imobilizados em uma matriz de imunoafinidade, tal como o anticorpo monoclonal anti-1D4 conjugado à resina Spheros 2B, foram marcados com um rótulo conjugado ao fluoro 4.

A imagem de fluorescência Ingel demonstra a marcação fluorescente bem-sucedida da opsina GPCR em três posições diferentes, conforme esperado; a opsina do tipo selvagem não apresentou marcação de fundo, como evidenciado pela ausência de uma banda fluorescente no peso molecular esperado para o receptor. Ao realizar este procedimento, é importante lembrar-se de confirmar a expressão completa da GPCR alvo com um conjunto específico de ácido introduzido AOL Alanina. Após o seu desenvolvimento.

Essa técnica abrirá caminho para pesquisadores na área da biologia de receptores explorarem qualquer complexo receptor-ligante ou rotularem um receptor-alvo. Utilizando o aminoácido não natural introduzido especificamente no sítio, a p-zeto-fenol-alanina, como sonda reativa. Após assistir a este vídeo, você deverá ter uma boa compreensão de como usar a neogênese de aminoácidos não naturais para introduzir uma sonda molecular em um GPCR a fim de facilitar estudos estruturais e dinâmicos de complexos de sinalização de GPCR por meio de técnicas de fotoconexão direcionada e rotulagem bioortogonal.