Geneticamente codificados Molecular Probes para estudar G receptores acoplados à proteína

O objetivo geral do experimento a seguir é introduzir uma única sonda informativa nos receptores acoplados à proteína G alvo para facilitar estudos estruturais e dinâmicos de complexos de sinalização. Isso é obtido através da transsecção de células com os plasmídeos necessários para expressar a maquinaria translacional necessária para incorporar o aminoácido não natural zeto, fenilalanina ou zeto fee em um GPCR expresso. A variação da taxa de zeto GPCR pode então ser aplicada de três maneiras diferentes para investigar a estrutura e a função do receptor.

Primeiro, a taxa zeto é usada como um reticulador de ativação de foto no GPCR, que permite a identificação do local de ligação de um ligante tritiado. Em seguida, a taxa zeto pode ser usada como uma alça química reativa para anexar uma sonda conjugada peptídica ou fluorescente ao GPCR por meio de resultados químicos de marcação bio ortogonal que mostram o uso da taxa zeto da sonda molecular em reticulação de fotos direcionadas, marcação de epítopos direcionada e marcação fluorescente de GPCRs com base em células vivas e métodos bioquímicos. A principal vantagem desta técnica sobre os métodos existentes, como o uso de ligantes de fotoafinidade ou marcação de cisteína, é a flexibilidade de introduzir especificamente um aminoácido não natural biologicamente inerte e reativo P zeto fenol alanina em uma posição conhecida em um receptor alvo.