Name: Geneticamente codificados Molecular Probes para estudar G receptores acoplados à proteína (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-09-13T16:30:00.000+00:00
Duration: 16 min 16 s
Description: Aprenda a introduzir sondas moleculares geneticamente codificadas em receptores acoplados à proteína G usando p-azido-L-fenilalanina. Este método permite fotocruzamento direcionado e marcação bioortogonal para estudos estruturais.

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Agradecemos o generoso apoio de diversas fundações e doadores filantrópicos (ver SakmarLab.org).

1. Site-specific Constituição genética de Unnatural Aminoácidos em GPCRs <ol><li> Manter células HEK293T em DMEM (4,5 g / L de glicose, glutamina 2 mM) suplementado com 10% de soro fetal bovino (FBS) a 37 ° C numa atmosfera de CO2 a 5%. </li><li> Transfectar as células cultivadas a 60-80% de confluência numa placa de 10 cm usando o reagente Lipofectamine Plus. <ol><li> Para 750 mL de DMEM, adicionar 10 ul de reagente Bonés, 3,5 ug de cDNA de GPCR (pMT4. Rho ou pcDNA 3.1. CCR5) contendo o codão de terminação âmbar, numa posição desejada, 3,5 ug de ARNt supressor de cDNA (pSVB.Yam) e 0,35 ug de mutante cDNA ARNt sintetase amino-acilo para o p-azido-L-fenilalanina (pcDNA.RS). Incubar à temperatura ambiente durante 15 min. Também realizar uma transfecção semelhante utilizando o peso de GPCR de cDNA (que não contém um codão de terminação âmbar) para servir como um controlo. Adicionar esta mistura de 750 ul de DMEM com 17 ul de Lipofectamina. Depois de equilibrar 15 min à temperatura ambiente, levar avolume total de 4 ml. </li><li> Aspirar media em 10 cm de placa, aplica mistura de transfecção às células, e regresso a 37 ° C em 5% de CO2. Após 4-6 hr, complementar células com 4 ml de DMEM contendo 20% de FBS e AZF 1 mM. </li></ol></li><li> No dia seguinte, substituir o meio de crescimento por DMEM contendo 10% de FBS e AZF 0,5 mM. </li><li> Células colheita de 48 horas após a transfecção, para analisar a expressão ou prosseguir com os procedimentos fotoreticulação ou rotulagem descritos nas seções seguintes. <ol><li> Confirmar a expressão do mutante de âmbar de GPCR, na presença de SAU nos meios de crescimento. Fazemos isso através da detecção immunoblot ocidental. Lise do sedimento celular em 1% (w / v) de dodecil-β-D-maltósido (DDM) em 20 mM Tris-HCl, pH 7,5, NaCl 100 mM durante 1 hora a 4 ° C. Centrifuga-se o lisado a 16.000 x g e resolver o sobrenadante em condições redutoras, por SDS-PAGE. Transfira para uma membrana de PVDF e realizar análise immunoblot para detectar a expressão do receptor de corpo inteiro usando ªe 1D4 mAb (Cell National Culture Center), que reconhece um epitopo de engenharia na extremidade C-terminal do receptor 31. </li></ol></li></ol> 2. Traçando um local de ligação do ligando Usando alvejado fotoreticulação <ol><li> 48 horas após a transfecção, a mídia aspirado a partir de células e substituir com 4 ml 1x tampão fosfato (PBS). E volta a 37 ° C durante 15 min. </li><li> Ressuspender as células com PBS 1x e transferir para um tubo Falcon. Centrifugar a 1500 rpm durante 2 min para sedimentar as células e aspiração do sobrenadante. </li><li> Ressuspender o sedimento celular em Solução Salina Tamponada de Hank 1x contendo 20 mM de HEPES, pH 7,5, BSA a 0,2% e do ligando tritiado a concentração de saturação de ligação para o comprimento necessário de tempo e temperatura, para assegurar a formação do complexo receptor-ligando. </li><li> Transferência da suspensão de células para uma de 24 poços ou 96 poços por placa de fotoactivação da AZF a 365 nm (por exemplo, utilizar uma lâmpada de UV-A) durante 15 min a 4 ° C. Manutenn a placa em gelo para evitar o aquecimento da amostra e lise celular. </li><li> Transferência das células para um tubo de Eppendorf, centrífuga para sedimentar as células, remove-se o sobrenadante e proceder à análise. Os peletes podem ser armazenadas a -20 ° C para uso futuro. </li><li> Ressuspender as pelotas de células em tampão de lise contendo 1% (w / v) de DDM, 20 mM Tris-HCl, pH 7,5 e os inibidores da protease. Após a incubação de 1 hora a 4 ° C, centrifugar o lisado celular durante 10 min a 16.000 x g, e transferir o sobrenadante para um novo tubo. </li><li> Adicionar resina 2B mAb 1D4-sefarose para o sobrenadante e incubar durante a noite a 4 ° C para o GPCR immunopurify utilizando o terminal C de mAb 1D4 epitopo engenharia. No dia seguinte, lavar as esferas várias vezes com tampão de lise. Amostras eluir com 1% de SDS a 37 ° C durante 1 hora com agitação. </li><li> Transfira uma porção do eluente a um frasco contendo 15 ml de fluido de cintilação e contar num contador de cintilação beta para quantificar a quantidade de ligação específica do ligando titulado para poe do receptor. </li><li> Resolver o restante 1D4 mAb eluente purificado por eletroforese em gel padrão. Usamos um gel de 4-12% SDS-PAGE e depois transferência semi-seca para uma membrana de PVDF para imunoblotting. Nós também incluímos uma pista com escada proteína padrão para orientar aproximação visual de peso molecular. <ol><li> Bloquear a membrana PVDF com leite a 5% em tampão TBS contendo 0,05% de Tween-20. Sondar a membrana para confirmar a expressão do receptor de comprimento completo com o mAb 1D4, seguido por anticorpo secundário anti-IgG de ratinho conjugado com HRP. </li><li> Tratou-se com reagente de quimioluminescência aumentada (ECL) e expor a membrana a película de auto-radiografia para visualizar as bandas. </li></ol></li><li> Cortar a membrana com uma lâmina de barbear para separar cada pista de amostra, seguindo-se o corte em marcadores com pesos moleculares específicos. Transferir os segmentos de membrana para frascos contendo líquido de cintilação. Quantificar a quantidade de trítio em cada segmento de membrana por contagem num contador de beta-cintilação. </li><li> Identificar o positivophotocrosslink com a detecção de trítio na massa molecular aparente igual à soma do que do GPCR e o ligando. </li></ol> 3. Alvejado Epitope Tagging e Superfície Celular ligada ao ensaio imunoenzimático (ELISA) <ol><li> 24 horas pós-transfecção, lavar as células com 1 ml de PBS 1x e trypsinize com 1 ml de tripsina a 0,25% durante 3 min. Suplemento com 9 ml de DMEM contendo 10% de FBS e AZF 0,5 mM. Ressuspender as células e contar a densidade celular. Usamos um hemocitômetro padrão. </li><li> Pré-tratar uma chapa de fundo claro, de ligação de alta, de 96 poços com 100 ml de 0,01 mg / ml de poli-D-lisina por poço. Incubar durante 30 minutos à temperatura ambiente, lavar várias vezes com PBS 1x e ar seco. </li><li> Placa de 200 ul das células transfectadas a uma densidade de 6 x 4-8 outubro 4 x 10 células / poço para a placa de 96 poços e regresso a 37 ° C em 5% de CO2. </li><li> No dia seguinte, preparar células para a rotulagem. Lavar suavemente três vezes com 100 ul / poço de PBS 1x to remover qualquer AZF contendo meio de cultura. Assegurar que as células permanecem aderidas, por exemplo, através da utilização de PBS contendo Ca 2 + e Mg 2 +. </li><li> Prepare 50-200 mM FLAG-triarilfosfína reagente rotulagem em 1x HBSS / PBS a partir de um estoque mantido em 5-20 mM em PBS. Aplicar 60 ml a cada poço (em triplicado para cada mutante âmbar) e regresso a 37 ° C durante 30 minutos a 4 horas. Manter um conjunto de poços sem tratamento rótulo em 1x HBSS / PBS. Também incluem um controle de peso GPCR para comparar com variantes AZF-GPCR. </li><li> Lavar as células 3 vezes com 100 ul / poço de tampão de bloqueio, BB (1x PBS, BSA a 0,5%), para remover marcador que não reagiu completamente. </li><li> Aplicar 100 l / poço de paraformaldeído a 4% (preparada a partir de um estoque de 16% em PBS 1x) para as células. Incubar durante 20 minutos à temperatura ambiente. Lavar três vezes com BB. </li><li> Realizar protocolo ELISA superfície celular padrão para detectar receptor marcado e expressão do receptor. Incubar com anticorpo primário durante 1,5 horas em gelo, seguido de um derivadotibody incubação à temperatura ambiente durante 1 hora. <ol><li> Adicionar 100 ul de anticorpo anti-FLAG M2 (por exemplo, diluição de 1:2.000 de anticorpos feitas no BB) para detectar o péptido FLAG epitopo do reagente de marcação FLAG-triarilfosfina. Sonda também não rótulo poços tratados como controle negativo. Adicionar anti-CCR5 2D7 (usamos uma diluição de 1:500) do anticorpo a um conjunto separado de poços para determinar em peso ou AZF-GPCR expressão na superfície celular. </li><li> Lave as células três vezes com BB, e incubar com 100 uL de anticorpo secundário anti-IgG de ratinho conjugado com HRP (1:2000 diluição). </li><li> Lavar cuidadosamente as células cinco vezes com o BB. Adicionar 50 ul de tampão de detecção: Amplex Red, 20 mM H 2 O 2, 1x PBS (proporção 1:10:90) e incubar 15 min a temperatura ambiente. Coletar dados espectrais em um multi-leitor de placas bem fluorescência em λ ex = 530 e λ em = 590. </li></ol></li></ol> 4. Bioorthogonal Labeling fluorescentes de um GPCR <ol><li> Lyse10 7 células colhidas que expressam em peso ou AZF-rodopsina variantes em 1 ml de tampão de solubilização, contendo 1% (w / v), MS, HEPES 50 mM ou Tris-HCl, pH 6,8, NaCl 100 mM, CaCl2 1 mM e inibidores de protease para uma hr a 4 ° C. Centrifuga-se o lisado celular a 15000 x g durante 10 minutos e recolher a fracção sobrenadante. </li><li> Adicionar 100 uL de mAb 1D4-resina de Sepharose 2B para capturar o receptor utilizando o terminal C 1D4 epitopo engenharia. Incubar durante 12 horas a 4 ° C. Lava-se a resina três vezes com 0,1% (w / v) DDM em tampão fosfato de sódio 0,1 M, pH 7,3. </li><li> Adicionar 0,1 mM de fluoresceína-fosfina em um volume total de 0,3-0,5 mL de rotular receptor imobilizado na matriz de imunoafinidade (1D4-mAb Sepharose 2B). Incubar durante 12 horas à temperatura ambiente. Centrífuga e remover o sobrenadante. Lava-se a resina para remover marcador que não reagiu. </li><li> Eluir o receptor marcado com 100 ml de tampão de eluição contendo 0,1% (w / v) de DDM e 0,33 mg / ml de nonapéptido (C9 péptido contra o epitopo de 1D4)em tampão de fosfato 2 mM, pH 6,0, por incubação em gelo durante 1 hr. </li><li> Resolve amostras marcadas por SDS-PAGE sob condições redutoras. Lavar géis brevemente em PBS e, em seguida, visualizar rotulagem de AZF-GPCR por fluorescência em gel. Por exemplo, uso de um scanner de fluorescência confocal a laser com um comprimento de onda de 488 nm para a detecção do receptor modificado com fluoresceína. </li></ol>

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<li>Hubbell, W. L., Altenbach, C., Hubbell, C. M., Khorana, H. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rhodopsin+structure%2C+dynamics%2C+and+activation%3A+A+perspective+from+crystallography%2C+site-directed+spin+labeling%2C+sulfhydryl+reactivity%2C+and+disulfide+cross-linking%5BTitle%5D)+AND+%22Advances+in+Protein+Chemistry%3B+Membrane+Proteins%22%5BJournal%5D)">Rhodopsin structure, dynamics, and activation: A perspective from crystallography, site-directed spin labeling, sulfhydryl reactivity, and disulfide cross-linking.</a> Advances in Protein Chemistry; Membrane Proteins. 63, 243-290 (2003).</li>
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</ol>

Autores têm nada a revelar.

Descrevemos aqui uma metodologia robusta para incorporação site-specific de uma sonda reativa, AZF, em GPCRs e demonstrar três aplicações úteis deste instrumento para estudar a estrutura ea dinâmica de GPCRs. Nosso método para o site especificamente incorporar UAAs contorna um problema fundamental com uma estratégia alternativa baseada na rotulagem quimicamente 32, 33 ou anexar photocrosslinkers 34 para um único mutante cisteína acessível. Embora, químicos que têm como alvo grupos tiol de cisteína ...

Heptahelical receptores acoplados à proteína (GPCRs) compreendem uma superfamília de proteínas de membrana altamente dinâmicos que medeiam sinais extracelulares importantes e diversas. No paradigma clássico, a activação do receptor é acoplada com alterações conformacionais induzidas pelo ligando. 1, 2 avanços recentes em biologia estrutural dos GPCRs têm fornecido uma visão significativa sobre os mecanismos moleculares da sinalização transmembrana. 3-5 No entanto, para compreender com maior precisão o químico mecanismo funcional e dinâmica estrutural de sinalização GPCR, um kit de ferramentas de abordagens é necessária para incorporar sondas moleculares e químicas informativos para interrogar complexos de sinalização ativos. Para este fim, nós adaptamos um método para o site especificamente introduzir não ou minimamente sondas perturbadores em receptores expressos com base no aminoácido não natural mutagênese (SAU), utilizando tecnologia de supressão de âmbar códon anteriormente iniciada por Schultz e coworkers. 6 Nós optimizado a metodologia mutagénese UAA para alcançar uma expressão de alto rendimento e um sistema de mutagénese de proteínas, tais como os GPCRs, que são difíceis de expressar em células de mamífero do que outros sistemas mais heterólogos. Usando um supressor de engenharia ortogonal tRNA e evoluiu aminoacil-tRNA sintetase par para uma SAU específica, local especificamente introduzido UAAs em GPCRs alvo expressas. A incorporação bem sucedida de UAAs, p-acetil-L-fenilalanina (AcF), p-benzoil-L-fenilalanina (BZF), e p-azido-L-fenilalanina (AZF) foi demonstrada no nosso modelo GPCRs - rodopsina e humano receptor de quimiocina CC, CCR5. 7, 8 Em princípio, um UAA podem ser geneticamente codificado em qualquer posição dentro da seqüência de proteínas e esta propriedade é uma ferramenta bioquímica inestimável, pois permite que um único códon de varredura de um GPCR alvo. Nós nos focamos especificamente sobre a versatilidade da UAA, AZF, que tem um azi reativafazer metade. Além de servir como um (IR) da sonda original de infravermelhos, 8, 9 AZF pode também servir como um agente de ligação cruzada por fotoactivável reagir com aminas primárias ou hidrogénios alifáticos vizinhos. Além disso, o grupo azido biologicamente inertes podem participar como pega química seletiva em reações de rotulagem bioorthogonal. Aqui apresenta-se exemplos que ilustram as aplicações úteis de incorporação específica do local de AZF em GPCRs, tais como o fotocruzamento alvo para interceptar um complexo receptor-ligando, e a modificação dos GPCRs por marcação de epitopo bioorthogonal e estratégias de marcação fluorescente. Fotoactiváveis ​​reagentes foram utilizados para estudar sistemas biológicos desde os anos 1960. 10 Neste período, uma abundância de experiências de reticulação ligando-receptor foram relatados para estudar os complexos de GPCR, a maioria dos quais envolve a utilização de ligantes de fotoafinidade 11, 12 No entanto, estes. aplicações são tecnicamente limitados, uma vez que require a síntese de ligandos que possuem um grupo de reticulação 13-15. Além disso, com a porção de agente de ligação cruzada no ligando, isto é difícil de identificar a localização da ligação transversal na GPCR. Site-especificamente a introdução de grupos de fotorreticulação como UAAs em proteínas utilizando o codão âmbar tecnologia de supressão é um avanço valioso 16, 17. Desenvolvemos uma técnica de foto-reticulação para identificar a interface de ligação a um receptor que está envolvida na formação de um complexo receptor-ligando em vivo através da introdução de grupos de células em fotolábeis GPCRs. 18, 19 Aqui, descrevemos o protocolo experimental e método de análise de dados para aplicar esta tecnologia fotorreticulação alvo para identificar o local de ligação de um ligando de molécula pequena, maraviroc tritiada, em CCR5. Este método aproveita a quantificação exacta do identificador radioactivo no ligando, para além de manter a estrutura química nativa do ligando. Técnicas baseadas em fluorescência apoiar a compreensão precisa da base estrutural da activação do receptor por sondando directamente o estado conformacional do receptor. 20, 21 No entanto, as técnicas que possuem a flexibilidade de introduzir marcadores fluorescentes em GPCRs local especificamente são limitados. Estamos interessados ​​em empregar estratégias de modificação química bioorthogonal para facilitar a detecção de moléculas individuais (SMD) de GPCR complexos de sinalização. 22 O grupo azido podem participar químicas bioorthogonal como Staudinger-Bertozzi ligadura, 23, 24 azida-promovido-deformação sem cobre cicloadição alcino (SpAAC) 25 e azida-alcino cicloadição catalisada por cobre (CuAAC). 26 Nós nos focamos na reação ligadura Staudinger-Bertozzi, que envolve a reação específica entre uma azida e uma fosfina. Nós demonstramos a utilização de dois derivados diferentes de fosfina, conjugados com um péptido epitopo (péptido FLAG) ou uma etiqueta fluorescente(F luoresceína) para conseguir a modificação específica do local de GPCRs. Nós já otimizada as condições para a rotulagem específica do site da rodopsina AZF variantes usando a estrutura de cristal de raio-X e simulações dinâmicas para escolher os locais alvo que são expostos solvente. 27, 28 Também ilustrou a viabilidade de alcançar rotulagem sem fundo por Staudinger- bertozzi ligadura. 29 Demonstramos aqui o procedimento geral empregue para alcançar marcação fluorescente de um receptor de detergente solubilizado que é imobilizado sobre uma matriz de imunoafinidade e posteriormente visualizados por fluorescência em gel. Além disso, nós demonstramos uma extensão útil sobre esta estratégia de rotulagem para identificar posições passíveis de rotulagem em um receptor de estrutura desconhecida, CCR5. Esta é levada a cabo usando uma estratégia de marcação péptido epitopo específico, que se baseia na modificação bioorthogonal de AZF-GPCR variantes em um formato semi-alto rendimento com base em células. 30 Estemétodo explora as propriedades de detecção multi-passo de um ELISA da superfície celular para monitorar eventos de rotulagem. As metodologias que discutimos aqui são gerais e, em princípio, pode ser aplicado a qualquer GPCR incorporado com AZF usando o âmbar códon tecnologia de supressão. Nos protocolos apresentados aqui pormenorizadamente as etapas envolvidas na expressão das células de mamíferos de receptores incorporados com UAAs como AZF utilizando o método de mutagénese de aminoácido não natural e seus pedidos subsequentes para facilitar os estudos estruturais e dinâmicas de GPCRs.

<table><tbody><tr><td>Plasmídeo pSVB. Yam</td><td></td><td></td><td>(Ye et al., 2008)</td></tr><tr><td>pcDNA.RS plasmídico para azF</td><td></td><td></td><td>(Ye et al., 2009)</td></tr><tr><td>Plasmídeos pMT4.Rho e pcDNA 3.1.CCR5</td><td></td><td></td><td>Opcionalmente contêm o códon de parada âmbar (TAG) em uma posição desejada</td></tr><tr><td>Células</td><td></td><td></td> HEK 293T <td>Células aderentes</td></tr><tr><td>Meio de Eagle Modificado de Dulbecco (DMEM)</td><td>Gibco</td><td>10566</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Tampão com Fosfato Salino</td><td>Gibco</td><td>14200</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Soro Fetal Bovino</td><td>Gemini Bio-products</td><td>100-106</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Lipofectamina Plus</td><td>Invitrogen</td><td>Lipofectamina: 18324-012 Plus: 11514-015</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>p-azido-L-fenilalanina</td><td>Chem-Impex International</td><td>6162</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>&nbsp;</td><td></td><td></td><td><forte>Tabela 1.</forte> Incorporação genética específica do local de aminoácidos não naturais em materiais GPCRs</td></tr><tr><td>Lâmpada UV-A Maxima ML-3500S</td><td>Spectronics Corporation</td><td></td><td>azF é ativada por luz de 365 nm</td></tr><tr><td>Solução de Sal Tamponada de Hank (HBSS)</td><td>Gibco</td><td>14065</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Irvine Scientific</td><td>9319</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Albumina de soro bovino</td><td>Roche</td><td>3117405001</td><td>&nbsp;</td></tr><tr>Ligante <td></td><td></td><td>marcado com trítio</td><td>Do colaborador (Grunbeck et al., 2012)</td></tr><tr><td>1% (p/v) n-dodecil-&beta;-D-maltosídeo</td><td>Anatrace</td><td>D310LA</td><td>&nbsp;</td></tr><tr>Resina <td></td><td></td><td>1D4-sepharose</td><td>1D4 mAb imobilizada em resina sepharose 2B ativada por CNBr</td></tr><tr><td>1% (p/v) dodecil sulfato de sódio (SDS)</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP166</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>NuPAGE Novex 4 - 12% de géis SDS</td><td>Invitrogen</td><td>NP0322BOX</td><td>SDS-PAGE realizado em aparelho NuPAGE</td></tr><tr><td>Aparelho Trans-Blot SD Aparelho</td><td>Biorad</td><td></td><td>para transferência semi-seca</td></tr><tr><td>Membrana de difluoreto de polivinilideno (PVDF) Immobilon</td><td></td><td>IPVH00010</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Leite sem gordura</td><td>Fisher Scientific</td><td>NC9934262</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Tween-20</td><td>Aldrich</td><td>274348</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Ecoscint A</td><td>National Diagnostics</td><td>LS-273</td><td>Fluido de cintilação</td></tr><tr><td>Frascos de cintilação</td><td>Fisher Scientific</td><td>333726</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>LKB Wallac 1209 Rackbeta Contador de Cintilação Líquida</td><td>Perkin Elmer</td><td></td><td>Contador de Cintilação</td></tr><tr><td>Beta Anti-rodopsina 1D4 mAb</td> Centro <td>Nacional de Cultura de Células</td><td>personalizado</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>IgG anti-camundongo conjugada com peroxidase de rábano (HRP) KPL</td><td>, Inc.</td><td>474-1806</td><td></td></tr><tr><td>Substrato Quimioluminescente SuperSignal West Pico</td><td>Thermo Scientific</td><td>34080</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Filme Hyblot CL AR</td><td>Denville</td><td>E3018</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>&nbsp;</td><td></td><td></td><td><forte>Tabela 2.</forte> Materiais de fotoreticulação direcionados</td></tr><tr><td>0,25% Tripsina</td><td>Invitrogen</td><td>15050065</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>BANDEIRA-triarilfosfina</td><td>Sigma</td><td>GPHOS1</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>M2 FLAG mAb</td><td>Sigma</td><td>F1804</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>anti-CCR5 2D7 mAb</td><td>BD Biosciences</td><td>555990</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Poli-D-lisina</td><td>Sigma</td><td>P6407</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Placa de 96 poços</td><td>Costar</td><td>3601</td><td>Fundo transparente, alta ligação EIA/RIA</td></tr><tr><td>Phosphate Buffered Saline (Cálcio, Magnésio)</td> <td>Gibco</td><td>14040</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>16% Paraformaldeído</td><td>EMS</td><td>28908</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>KPL, Inc.</td> <td>conjugada com HRP</td>.<td>474-1516</td><td></td></tr><tr><td>IgG anti-coelho</td><td>KPL, Inc.</td><td>474-1516</td><td></td></tr><tr><td>Amplex Red</td><td>Invitrogen</td><td>A12222</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Peróxido de hidrogênio</td><td>DE Healthcare Products</td><td>97-93399</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Leitor de placas multipoços de fluorescência CytoFluor II</td><td>Perseptive Biosystems</td><td></td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>&nbsp;</td><td></td><td></td><td><forte>Tabela 3.</forte> Marcação direcionada de peptídeo-epítopo e materiais ELISA de superfície celular</td></tr><tr><td>Fluoresceína-fosfina</td><td></td><td></td> <td>(Huber et al., submetido em 2012)</td></tr><tr><td>Nonapeptídeo (peptídeo C9)</td><td>AnaSpec</td><td>62190</td><td>Peptídeo imitando o epítopo 1D4 NH2-TETSQVAPA-COOH</td></tr><tr><td>1% (p/v) n-dodecil-&beta;-D-maltosídeo</td><td>Anatrace</td><td>D310LA</td><td>&nbsp;</td></tr><tr>Resina <td></td><td></td><td>1D4-sepharose</td><td>1D4 mAb imobilizada em resina sepharose 2B ativada por CNBr</td></tr><tr><td>NuPAGE Novex 4 - 12% de géis SDS</td><td>Invitrogen</td><td>NP0322BOX</td><td>SDS-PAGE realizado em aparelho NuPAGE</td></tr><tr><td>Scanner de fluorescência Confocal Typhoon 9400</td><td>GE Healthcare</td><td>descontinuado</td><td>Scanner com laser de comprimento de onda de 488 nm</td></tr><tr><td>&nbsp;</td><td></td><td></td><td><forte>Tabela 4. </forte>Materiais de rotulagem fluorescentes</td></tr></tbody></table>

geneticamente codificados molecular probes para estudar g receptores acoplados à proteína

Genetically-encoded Molecular Probes to Study G Protein-coupled Receptors

Para facilitar os estudos estruturais e dinâmicas de G do receptor acoplado à proteína (GPCR) de sinalização complexos, novas abordagens são necessários para introduzir sondas informativas ou etiquetas em receptores expressos que não perturbam a função do receptor. Usamos âmbar tecnologia de supressão de codões para codificar geneticamente o aminoácido não natural, p-azido-L-fenilalanina (AZF) em várias posições orientadas nos GPCRs heterologamente expressos em células de mamíferos. A versatilidade do grupo azido é aqui ilustrado em diferentes aplicações para estudar GPCRs no seu ambiente celular nativo, ou sob condições de detergentes solubilizadas. Em primeiro lugar, nós demonstramos uma tecnologia de foto-reticulação com base nas células-alvo para identificar os resíduos no bolso de ligação ao ligando de GPCR em que um marcado com trítio pequena molécula ligante é reticulado com um ácido azido-amino geneticamente codificado. Nós, então, demonstrar a modificação específica do site de GPCRs pelo bioorthogonal Staudinger-Bertozzi ligadura reaçãoção que tem como alvo o grupo azido utilização de derivados de fosfina. Discute-se uma estratégia geral para o alvo de marcação de péptidos com epitopo das proteínas de membrana expressos em cultura e a sua detecção usando uma abordagem baseada em ELISA de célula inteira. Finalmente, mostra-se que AZF-GPCRs pode ser marcado selectivamente com sondas fluorescentes. As metodologias são discutidos em geral, na medida em que podem, em princípio, ser aplicada a qualquer posição do aminoácido em qualquer expressa GPCR para interrogar os complexos de sinalização activas.

Utilizamos a metodologia de mutagênese aminoácido não natural para o site especificamente introduzir sondas moleculares em um GPCR usando o âmbar códon tecnologia de supressão. O esquema da Figura 1 esboça os passos salientes da metodologia e os vários pedidos de incorporar o versátil UAA, p-azido-L-fenilalanina (AZF), para GPCRs. Expressão da AZF-GPCRs em células de mamíferos permite fotoreticulação alvejado a ligantes, e marcação peptídeo epítopo ou modificações fluorescentes de um GPCR alvo ...

Nós geneticamente codificam o aminoácido não natural, p-azido-L-fenilalanina em várias posições orientadas nos GPCRs e mostram a versatilidade do grupo azido em diferentes aplicações. Estes incluem uma tecnologia de fotorreticulação alvo para identificar resíduos na bolsa de ligação ao ligando de um GPCR, e específica do local de modificação bioorthogonal de GPCRs com uma etiqueta de péptido epitopo ou sonda fluorescente.

Geneticamente codificados Molecular Probes para estudar G receptores acoplados à proteína

To facilitate structural and dynamic studies of G protein-coupled receptor (GPCR) signaling complexes, new approaches are required to introduce ...

O objetivo geral do experimento a seguir é introduzir uma única sonda informativa em receptores acoplados à proteína G-alvo para facilitar estudos estruturais e dinâmicos de complexos de sinalização. Isso é alcançado mediante a transfecção de células com os plasmídeos necessários para expressar a maquinaria traducional requerida para incorporar o aminoácido não natural zeto, fenilalanina ou zeto fee em um GPCR expresso. A variante de GPCR com zeto fee pode então ser aplicada de três maneiras diferentes para investigar a estrutura e a função do receptor.Primeiro, o zeto fee é utilizado como um crosslinker ativado por luz no GPCR, o que permite a identificação do sítio de ligação de um ligante tritiado. Em seguida, o zeto fee pode ser usado como uma alça química reativa para acoplar um peptídeo conjugado ou uma sonda fluorescente ao GPCR por meio de químicas de marcação bioortogonal. Os resultados obtidos demonstram o uso da sonda molecular zeto fee em cross-linking fotossensível direcionado, marcação de epítopos direcionada e marcação fluorescente de GPCRs com base em métodos bioquímicos e em células vivas. A principal vantagem dessa técnica em relação a métodos existentes, como o u

genetically-encoded-molecular-probes-to-study-g-protein-coupled

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

O ensaio de mobilização de cálcio e de fluorescência baseada aqui descrito é um sistema de rastreio inverso farmacologia de médio rendimento para a identificação de ligandos funcionalmente activação (s) de órfãos receptores acoplados à proteína (GPCRs).

Caracterização dos receptores acoplados à proteína por uma mobilização de cálcio Ensaio baseado em fluorescência

Métodos simples para detectar a ativação seletiva de proteínas G por receptores acoplados à proteína G continuam sendo um grande desafio na sinalização celular. Aqui, os biossensores de transferência de energia de ressonância Fӧrster (FRET) foram desenvolvidos amarrando um GPCR a peptídeos de proteína G para sondar mudanças conformacionais em concentrações controladas em células vivas.

Conformações GPCR G Protein selectivos medida usando FRET Sensores em um Fluorometer Ensaio de células vivas de suspensão

A ligação de trifosfato de guanosina (GTP) é um dos primeiros eventos na ativação do receptor acoplado com proteína G (GPCR). Este protocolo descreve como caracterizar farmacologicamente as interacções específicas de GPCR-ligando, monitorizando a ligação do análogo de GTP radio-marcado, [ 35 S] guanosina-5'-O- (3-tio) trifosfato ([35S] GTPγS), em Resposta a um ligando de interesse.

Medição da sinalização do receptor acoplado à proteína G via ligação GTP marcada com rádio

O ensaio de celular descrito destina-se a identificação do receptor do chemokine do CXC 4 (CXCR4)-interação agentes que inibem ou estimulam, competitivos ou qual alostericamente, o intracelular Ca2 + lançamento iniciado pela ativação de CXCR4.

Um cinética baseada em fluorescência Ca2 + mobilização ensaio para identificar agonistas do Receptor acoplado à proteína G, antagonistas e moduladores alostéricos

Um ensaio de fluorescência facile é apresentado para avaliar a eficiência de amino-acil-tRNA-sintetase/tRNA pares incorporando proteínas expressadas em células de mamíferos não-canônicos amino-ácidos (ncAAs). A aplicação de ncAAs estudar receptors G-proteína acoplada (GPCRs) é descrita, incluindo mapeamento de foto-reticulação de binding sites e opaco GPCR rotulagem em células vivas.

Otimizando a incorporação genética do produto químico sondas em GPCRs para mapeamento de foto-reticulação e opaco química em células de mamíferos vivas

Aqui, apresentamos os protocolos para descobrir compostos ativos nos receptores GABAA , partir de ligação para a fisiologia e farmacologia.

Métodos para a descoberta de novos compostos modulando um Receptor do ácido gama - aminobutírico tipo uma neurotransmissão

Dado que os GPCRs são alvos atraentes para drogados, a triagem de ligantes GPCR é, portanto, indispensável para a identificação de compostos de chumbo e para estudos de desordeiro. Para esses esforços, descrevemos o PRESTO-Tango, uma plataforma de recursos de código aberto usada para o perfil simultâneo de recrutamento transitório β-arrestin2 em aproximadamente 300 GPCRs usando um ensaio de repórter baseado em TEV.

Interrogatório paralelo de β-Arrestin2 Recrutamento para Triagem de Ligand em escala GPCR usando ensaio PRESTO-Tango

Neste trabalho, um ensaio de fluorescência de cálcio intracelular de alto rendimento para placas de 384 poços para rastrear pequenas bibliotecas de moléculas em receptores acoplados à proteína G recombinante (GPCRs) é descrito. O alvo, o receptor de cinina do carrapato da febre do gado, Rhipicephalus microplus, é expresso em células CHO-K1. Este ensaio identifica agonistas e antagonistas usando as mesmas células em um ensaio de "adição dupla".

Um ensaio de fluorescência de cálcio de "dupla adição" para a triagem de alto rendimento de receptores acoplados à proteína G recombinante

Este protocolo descreve o uso de biossensores baseados em BRAKET para medição em tempo real da ativação da proteína G em células vivas HEK293 após estimulação do ligante do receptor acoplado à proteína G. Aqui, o receptor β2-adrenérgico e o receptor canabinóide tipo 1 servem como exemplos para demonstrar a eficiência dos sensores para vários subtipos de proteína G e em vários GPCRs.

Biossensores de proteína G baseados em BRAKET para medir a atividade do receptor acoplado à proteína G em células vivas

Teste de sensibilidade visual em lagartos usando um paradigma de condicionamento operante, que emprega a reprodução de vídeo de random-dot kinematograms e computer-generated invertebrados.

Teste de sensibilidade visual para a velocidade e direção do movimento em Lagartos

Aprenda a introduzir sondas moleculares geneticamente codificadas em receptores acoplados à proteína G usando p-azido-L-fenilalanina. Este método permite fotocruzamento direcionado e marcação bioortogonal para estudos estruturais.

Geneticamente codificados Molecular Probes para estudar G receptores acoplados à proteína

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