Name: Preparação de Amostras de proteômica fixados em formalina e embebidos em parafina Tissue (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-09-02T17:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 20 s
Description: Aprenda a preparar amostras de tecido FFPE para análise proteômica usando microdissecção a laser e digestão enzimática sequencial. Este protocolo permite identificar até 10.000 proteínas a partir de quantidades mínimas de material clínico.

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O autor agradece o Dr. Matthias Mann pelo apoio contínuo e Sra. Katharina Zettl para demonstrar o método. Este trabalho foi apoiado pela Sociedade Max-Planck para o Avanço da Ciência.

1. Instrumentação Obrigatório <ol><li> Preparação de fatias de tecido para microdissecção e amostra de lise <ol><li> Termobloco definido como 99 ° C ou de um banho de água fervente. </li><li> Microdissector operacional Laser (por exemplo PALM, Zeiss, Göttingen, Alemanha). </li><li> Termostatizada centrífuga de bancada, a temperatura ajustada para 20 ° C. </li><li> Câmara úmida (caixa), com um rack para tubos Eppendorf eliminação do tipo. </li><li> Incubadora ajustado para 37 ° C. </li><li> Espectrofluorímetro permitindo medição de fluorescência animado perto de luz UV com cuvetes de quartzo micro-escala (0,1-0,2 ml). </li></ol></li></ol> 2. Soluções <ol><li> &#39;Tissue Tampão de Lise &quot;(TLB): de 0,1 M de Tris-HCl, pH 8,0, DTT 0,1 M, 0,5% (w / v) de polietileno glicol 20.000 e SDS a 4%. </li><li> Solução UA: 8 M de ureia em 0,1 M Tris-HCl pH 8,5. Prepare 1 ml por 1 amostra. Soluções UA e IAA tem que estar preparado na hora e usado dentro de um dia. </li><li> Solução IAA: 0.05 M iodoacetamide na UA. Prepare a 0,1 ml por 1 exemplo. </li><li> Endoproteinase Lys-C, solução estoque. </li><li> Tripsina, solução estoque. </li><li> &quot;Digestão tampão &#39;(DB): 0,05 M de Tris-HCl pH 8,5. Prepare a 0,25 ml por 1 exemplo. </li><li> &#39;Solução Padrão Triptofano&#39;: 0,1 mg triptofano em 1 ml de água deionizada. </li><li> &#39;Ensaio tampão B&#39; (OPA): 10 mM Tris-HCl, pH 7,6. </li><li> Solução de Britton e Robinson Universal Buffer (Brub). Prepara-se uma solução contendo 0,1 M de CH3COOH, 0,1 MH 3 PO 4, e 0,1 MH 3 BO 3 e ajustar-se com NaOH 1 M até a pH pretendido (2, 4, 5, 6, e 11). Antes da utilização diluída 5 vezes com água desionizada. </li><li> Tampão A: 1% (v / v) CH3COOH na água deionizada. </li><li> Tampão B: 60% (v / v), CH3CN, 1% (v / v) em água desionizada CH3COOH. </li></ol> 3. Ponteira e Colunas &#39;StageTip&#39; <ol><li> Prepare SAX ponta-coluna empilhando 6 camadas de membrana Empore-Anion em uma common 0,2 ml ponta da pipeta. Faça duas colunas SAX-ponta por amostra. </li><li> Prepare &#39;StageTip&#39; empilhando 3 camadas de Empore-C 18 em uma ponta de pipeta de 0,2 ml. Faça 6 dicas palco para cada amostra. </li></ol> 4. Preparação de fatias de tecido para Microdissecção e Amostra de Lise <ol><li> Cortar secções com um micrótomo (a espessura das fatias depende da amostra. Normalmente microdissecção funciona bem com fatias de 7-10 mm). </li><li> Irradiar lâminas de membrana (1.0 MembraneSlide PEN) com luz UV por 45 min. </li><li> Monte as seções sobre os slides de membrana Irradiado e seco a 37 ° C por 2 horas. </li><li> Retire a parafina das secções montadas por duas incubações sucessivas em xileno durante 2,5 min e 1,5 min. Reidratar as seções por incubações consecutivas em etanol absoluto, 70% de etanol e água, cada um por 1 min. </li><li> Mancha as seções com hematoxilina de Mayer por 20 s, lave com água por 1 minuto, e ar seco. </li><li> Recolha os populati celularesno interesse de usar o sistema de captura de microdissecção a laser. Ao utilizar o instrumento PALM (Zeiss) coletar as amostras nas tampas adesivas (Adhesive PAC 200). </li><li> Pipeta-se uma alíquota de TLB sobre o material de microdissecção na tampa. Fechar o tubo e recolher a suspensão, por um curto espaço de centrifugação. Lise do tecido microdissecção a 99 ° C num bloco de aquecimento com agitação (600 rpm) durante 1 hora. Use 3 mL de tampão para 10 nl do tecido microdissecção. </li><li> Clarificar o extracto em bruto por centrifugação a 16.000 x g a 18 ° C durante 10 min. O lisado pode ser armazenado congelado a -20 ° C. </li></ol> 5. Processamento de Amostra <ol><li> Misturar até 50 mL do lisado clarificado com 200 ul de ácido úrico nas unidades de ultrafiltração (30k forense) e centrifugar a 14.000 xg até menos de 10 ul da solução permanece no filtro. Normalmente, este passo requer 10-15 minutos de centrifugação. </li><li> Pipetar 200 l de UA para a unidade de ultrafiltraçãoe centrifuga-se como em 5.1. Esvazie o tubo de coleta. </li><li> Pipetar 50 ul de solução de IAA e misturar a 600 rpm num termo-misturador durante 1 min e centrifuga-se como em 5.1. </li><li> Pipetar 100 l de ácido úrico para a unidade de ultrafiltração e centrifugar como em 5.1. Repita esta etapa duas vezes </li><li> Pipetar 100 mL da DB para a unidade de ultrafiltração e centrifugar a em 5.1. Repita esta etapa duas vezes. </li><li> Transfira as unidades de filtração para novos tubos de coleta. Pipetar 40 ul de banco de dados com a endoproteinase Lys-C (proteinase a proporção de proteína total de 1:100) e misturar a 600 rpm, em termo-misturador durante 1 minuto. Incubar as unidades numa câmara húmida a 37 ° C durante 18 horas. </li><li> Centrifugar as unidades de filtragem a 14.000 xg, tal como em 5.1. </li><li> Pipetar 160 l de água desionizada e centrifugar as unidades de filtro como em 5.1. O flow-through em pool (5.7 e 5.8 passos) contém os peptídeos liberados por endoproteinase de Lys C. </li><li> Transferir a unidade de ultrafiltração para um novo tubo de recolha. Adicionar 40 mLDB com tripsina (razão enzima para proteína de 1:100) e misturar a 600 rpm, em termo-misturador durante 1 minuto. Incubar as unidades numa câmara húmida a 37 ° C durante 4 h. Repita os passos 5.7 e 5.8 para recolher os peptídeos trípticos. </li></ol> 6. A quantificação dos peptídeos <ol><li> A medição do teor de péptido nas digestões de proteínas pode ser realizada em tampão diluída, porque os resíduos de triptofano são bem acessíveis ao solvente. </li><li> Pipetar 0,2 ml da ABB na cuvete de quartzo e registrar o espectro de emissão para &#39;em branco&#39;. </li><li> Preparar curva de calibração usando 0,1 mg etapas, adicionando um mL alíquotas de SST para a cuvete e mix suave com a ABB. </li><li> Limpar a tina. </li><li> Pipetar a amostra e registrar o espectro (amostra). </li><li> Calcular a concentração de proteína e peptídeo Desde 0,1 ug de triptofano corresponde a cerca de 9 mg de proteína (com base na média de 1,1% do teor de triptofano em misturas de proteínas obtidas by lisar células humanas), o teor de proteína da amostra no conteúdo ou peptídeo na digest é igual: <img alt="Equação 1" fo:content-width="2.787in" fo:src="/files/ftp_upload/50589/50589eq1highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50589/50589eq1.jpg" /> onde F (Padrão1) é a fluorescência do triptofano de 0,1 ug padrão. O teor de péptido permite o cálculo do rendimento do processo de digestão e fornece informações essenciais para o fraccionamento seguinte péptido e análise de espectrometria de massa. </li></ol> 7. Fracionamento dos Lys-C e trípticos Peptídeos <ol><li> Dilui-se as soluções de péptidos obtidos por digestão com Lis-C e tripsina com 0,2 ml de Brub pH 11 e pH 5, respectivamente. </li><li> Monte o SAX ponta-coluna na tampa adaptador tubo centrífuga. </li><li> Lavar e equilibrar a coluna de ponta-SAX, sucessivamente, com 0,1 ml de metanol, 0,1 ml de NaOH 1 M, e 3 vezes com 0,1 ml de Brub, pH 11 para a separação de Lys-C Peptides e com Brub, pH 5 para os peptídeos trípticos. O fluxo das soluções através da coluna de material é facilitada por centrifugação a 4.000 x g. </li><li> Lavar e equilibrar os C 18 - &#39;&#39; StageTips subsequentemente, com 0,05 ml de metanol, depois com 0,05 ml de tampão B e com 0,05 ml de tampão A. Prepara seis C 18 - &#39;StageTips&#39;, 4 para a separação da Lys- péptidos C e dois para a separação dos peptídeos trípticos. </li><li> Monte o Tip-coluna SAX no C 18 - &#39;StageTip&#39;. Coloque as soluções de amostra para os SAX Ponta-colunas equilibradas e centrifugar as colunas a 5.000 xg por 3 min. </li><li> Equilibrar as colunas &#39;pipeta de ponta de&#39; com 0,1 ml da Brub, pH 11 ou pH 5, respectivamente, para o Lyc-C e as amostras trípticos. Facilitar o fluxo através de centrifugação a 5000 x g. </li><li> Transfira a Tip-coluna SAX para o próximo C 18 - &#39;StageTip&#39;. </li><li> Continuar a eluição dos péptidos com Brub pH 6, 4 e 2 para a amostra Lys C e com BRUB pH 2 para a amostra com péptidos trípticos. Para cada etapa de eluição usar um C separado 18 - &#39;StageTip&#39;. </li><li> Lave os C 18 - &#39;StageTips&#39; com 0,05 ml de tampão A. </li><li> Eluir fracções com 0,05 ml de tampão B em frascos utilizados directamente para a injecção das amostras em sistema LC montados com um espectrómetro de massa. </li></ol>

<ol><li>Nagaraj, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Deep+proteome+and+transcriptome+mapping+of+a+human+cancer+cell+line%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+systems+biology%22%5BJournal%5D)">Deep proteome and transcriptome mapping of a human cancer cell line.</a> Molecular systems biology. 7, 548(2011).</li>
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<li>Wisniewski, J. R., Zougman, A., Mann, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Combination+of+FASP+and+StageTip-based+fractionation+allows+in-depth+analysis+of+the+hippocampal+membrane+proteome%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Proteome+Res%22%5BJournal%5D)">Combination of FASP and StageTip-based fractionation allows in-depth analysis of the hippocampal membrane proteome.</a> J. Proteome Res. 8 (12), 5674-5678 (2009).</li>
<li>Rappsilber, J., Ishihama, Y., Mann, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stop+and+go+extraction+tips+for+matrix-assisted+laser+desorption%2Fionization%2C+nanoelectrospray%2C+and+LC%2FMS+sample+pretreatment+in+proteomics%5BTitle%5D)+AND+%22Anal.+Chem%22%5BJournal%5D)">Stop and go extraction tips for matrix-assisted laser desorption/ionization, nanoelectrospray, and LC/MS sample pretreatment in proteomics.</a> Anal. Chem. 75 (3), 663-670 (2003).</li>
<li>Thompson, S. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Impact+of+pre-analytical+factors+on+the+proteomic+analysis+of+formalin-fixed+paraffin-embedded+tissue%5BTitle%5D)+AND+%22Proteomics+Clin.+Appl%22%5BJournal%5D)">Impact of pre-analytical factors on the proteomic analysis of formalin-fixed paraffin-embedded tissue.</a> Proteomics Clin. Appl. , (2012).</li>
</ol>

O autor não tem nada a revelar.

A capacidade de estudar o material FFPE pela tecnologia proteômica a uma profundidade comparável com o sequenciamento de ácidos nucleicos e técnicas de microarray abre novas perspectivas em biomarcadores e droga descoberta alvo. O protocolo descrito permite a caracterização e quantificação de proteomas de populações de células microdissecadas a uma escala de 10.000 proteínas. Quando se utiliza menos do material de microdissecção um menor conjunto de dados pode ser gerada, mas, talvez, em muitos casos, estas podem também fornecer dados clínicos valiosos. Assim, qualquer uma das amostras pode ser analisada directamente após o processo de MED-FASP ou podem ser separados em fracções menos. Desde procedimento FASP é compatível com qualquer tipo de protease, outras enzimas ou sua combinação pode ser usado a partir de digestões de proteínas 6. A qualidade do material FFPE parece ser o problema mais crítico da análise. Temos experimentado que o tecido fixo da mesma origem mas vindo de diferentesClínica de ORL tinha propriedades distintas. Usando tecido de uma fonte que foram capazes de gerar peptídeos com alto rendimento, enquanto material similar de outra clínica era quase inútil. É provável que a fixação aplicado e procedimentos de incorporação, bem como condições de armazenagem são os principais factores que afectam as propriedades do material clínico 12. Por isso, é aconselhável testar as propriedades de algumas amostras antes de iniciar um projeto maior. Muitas publicações descreveram o uso do material de FFPE no passado. No entanto, o número de proteínas identificadas nestes estudos nunca excedeu mais do que 1.000-2.000 proteínas 4. Considerando o tamanho das proteomas específicos de células humanas compreendendo mais de 10.000 proteínas, esses estudos foram capazes apenas de proporcionar uma imagem muito superficial, quase se limitando a proteínas altamente abundantes envolvidas em funções de manutenção. Nosso protocolo permite isolamento eficiente do material clínico ou biológico from preservado tecido e é otimizado para lise, processamento de proteínas e peptídeos prefraccionamento. Como conseqüência nosso fluxo de trabalho de preparação da amostra, quando acoplado à espectrometria de massa de alta qualidade, permite insights sobre um proteomas quase completos. Notável, isso é possível em requisitos minutos quantidade de amostra. A principal vantagem de utilizar os tecidos preservados é a sua vasta disponibilidade relativa. Amostras FFPE arquivados há muitos anos e décadas, e, por vezes considerada como inútil, agora, graças à tecnologia proteômica, aparecem como material de grande valor para a investigação clínica. Considerando que muitas doenças podem ser estudados utilizando fresco ou congelado exploração do material do material de FFPE parece ser particularmente importante para o estudo de doenças raras 12, foram recolha de um conjunto representativo da amostra leva geralmente um longo período de tempo.

Fixação com paraformaldeído e inclusão em parafina (FFPE) é o método padrão para a preservação e investigação pathomorphologic de material tecido clínica. Microscopia do tecido preservado permite a identificação de doenças relacionadas com alterações morfológicas, e detecção e correção de ocorrência de antigénios da febre relacionada. Uma vez que tipicamente, apenas uma pequena porção da amostra FFPE é usado nestas análises, grandes quantidades de material clínico permanecem arquivados e podem ser exploradas em outros tipos de trabalhos. Durante a última década a pesquisa em ciências da vida tem sido fortalecida pela poderosa tecnologia proteômica. Esta tecnologia permite a identificação e quantificação de milhares de proteínas em misturas complexas de proteínas. Uma característica importante da tecnologia é que a quantidade de material só minutos são necessários para as análises de grande escala. Estudos recentes demonstraram que proteomic proteínas pode ser estudada numa escala de amostra quaselete proteomas 1, 2. Este tipo de sistema permite investigações de largura conhecimentos na composição das células e identificação de grupos de proteínas que ocorrem em níveis anómalos de doenças. Considerando que estes estudos necessários grandes capacidades de espectrometria de massa, o trabalho recente demonstrou que medida semelhante de identificação pode ser alcançado dentro de um único dia de medição 3. A exigência de valor relativamente baixo da amostra e da ampla disponibilidade das amostras clínicas preservadas nós e os outros tentados a desenvolver métodos que permitam a exploração proteômica do material FFPE (para uma revisão ver 4). Aproveitando a reversibilidade da fixação em formalina sob um tratamento térmico, temos desenvolvido um protocolo que permite a extracção quantitativa de proteínas a partir do tecido fixo 5. Nós mostramos que o procedimento de fixação não preserva apenas proteínas, mas também, pelo menos, algumas modificações pós-traducionais. Fosforylation e N-glicosilação pode ser estudado utilizando as amostras FFPE 5, porém um pré-requisito para isso é uma condições de coleta de tecido, de armazenamento e de fixação completamente controladas. Em seguida, temos aperfeiçoado o método para a captura de microdissecção a laser do tecido fixado e para a proteômica reator baseado processamento da amostra 6, 7. Um estudo em grande escala sobre o câncer colorretal permitiu a análise quantitativa de 7.500 proteínas da microdissectados de material clínico 8. Finalmente, temos melhorado a forma de exploração de material microdissecção aplicando consecutivo de dois protocolo digestão de proteínas passo 9. Em comparação com as estratégias de digestão comuns usando enzima única, este procedimento permite a geração de mais peptídeos seqüência única e, conseqüentemente, resulta em uma maior profundidade de identificação de proteínas. Análise de microdissecção adenoma do cólon humano permitiu análise proteômica a uma profundidade de 9.500 proteínas por amostra 3. Neste garanhãoy mapeamos 55.000 peptídeos por amostra, permitindo a identificação de 88-89% de proteínas com pelo menos 2 peptídeos. Aqui apresentamos um protocolo otimizado para preparação de amostras de material para análise FFPE LC-MS/MS. Este protocolo inclui a preparação de secções de tecido por microdissecção, a lise das células isoladas, e o processamento de amostras num formato de reactor (FASP) 6. Em seguida, descrevemos uma determinação espectrofluorométrico de rendimentos peptídeo, uma tarefa com grande importância para a identificação ideal peptídeo pela espectrometria de massa. Por fim, demonstramos uma forte permutador de aniões (SAX) à base de técnica de separação para peptídeo fracionamento. Neste método, tanto a separação de peptídeos e limpeza final, são realizadas utilizando microcolunas pipeta de ponta de 10, 11. Este passo é opcional, mas é recomendado em estudos em que mais do que alguns microgramas peptídeos podem ser obtidos a partir de uma única amostra. O SAX-fracionamento pode aumentar substancialmente o número ea gama dinâmica de identficações e estender a cobertura seqüência de proteína 3, 10.

<table><tbody><tr><td>MembraneSlide 1.0 PEN</td><td>Carl-Zeiss Microscopy GmBH, Goettingen, Alemanha</td><td>415190-9041-000</td><td></td></tr><tr><td>Tampa adesiva 200 opaca</td><td>Carl-Zeiss Microscopy GmBH, Goettingen, Alemanha</td><td>415190-9181-000</td><td></td></tr><tr><td>Solução de hematoxilina de Mayer </td><td>Sigma-Aldrich St. Louis, MO</td><td>MHS32</td><td></td></tr><tr><td>Forensic 30k </td><td>Merck Millipore Darmstadt, Alemanha</td><td>MRCF0R030</td><td>(Anteriormente vendido como Microcon YM-30) </td></tr><tr><td>Empore Anion</td><td>Tecnologias bioanalíticas 3M Company ST. Paul, MN</td><td>2252</td><td></td></tr><tr><td>Empore C18</td><td>Tecnologias bioanalíticas 3M Company ST. Paul, MN</td><td>2215</td><td></td></tr><tr><td>Tripsina </td><td>Promega</td><td>2014-06-27</td><td></td></tr><tr><td>Endoproteinase Lys-C</td><td>Wako</td><td>129-02541</td><td></td></tr></tbody></table>

preparação de amostras de proteômica fixados em formalina e embebidos em parafina tissue

Proteomic Sample Preparation from Formalin Fixed and Paraffin Embedded Tissue

Material clínico preservada é uma fonte única para a investigação proteômica de distúrbios humanos. Aqui nós descrevemos um protocolo otimizado permitindo a análise quantitativa em larga escala de fixados em formalina e incluído em parafina (FFPE) do tecido. O processo compreende quatro etapas distintas. A primeira é a preparação de secções do material de FFPE microdissecção e de células de interesse. Na segunda etapa, as células isoladas são lisadas e processados ​​usando &#39;filtro auxiliado a preparação da amostra&#39; (FASP) técnica. Neste passo, as proteínas são esgotadas de reagentes utilizados para a lise da amostra e são digeridas em solução em duas etapas utilizando a endoproteinase LysC e tripsina. Após cada digestão, os péptidos são recolhidos em fracções separadas e o seu conteúdo é determinado usando uma medição de fluorescência altamente sensível. Finalmente, os peptídeos são fraccionados em microcolunas &#39;pipeta-tip&#39;. Os IysC-péptidos são separadas em quatro fracções ao passo que a pe trípticaptides são separados em duas frações. Desta maneira as amostras preparadas permitir a análise de proteomas de quantidades diminutas de material para uma profundidade de 10.000 proteínas. Assim, o fluxo de trabalho descrito é uma técnica poderosa para o estudo de doenças em todo o sistema, da forma, bem como para a identificação de potenciais biomarcadores e alvos de drogas.

Análise proteômica de material FFPE requer métodos robustos e reprodutíveis para a preparação da amostra. Nesta publicação, demonstram um protocolo que permite o isolamento eficaz de populações de células a partir do material fixo e a sua transformação química, resultando em fracções de péptidos de pureza elevada que pode ser utilizado directamente para análise LC-MS/MS. O processo consiste em quatro partes distintas: (1) preparação de secções das amostras FFPE e sua microdissecção, (2) a lise da amostra e processamento das proteínas utilizando abordagem MED FASP, e (3) quantificação e (4) fraccionamento da os péptidos (Figura 1). No primeiro passo do processo, as amostras de FFPE são seccionados com um micrótomo e montadas em lâminas cobertas de membrana. Para aumentar a adesão entre as secções de tecido e a superfície da membrana da corrediça é necessário irradiar a superfície da lâmina com luz UV. Para isso, use a luz de uma lâmpada UVintegrado no banco de cultura de células. Após esta etapa, as lâminas são submetidas a lavagens, permitindo a remoção de parafina e re-hidratação das amostras. O material é reidratado corados com hematoxilina por um tempo curto. Isto resulta numa fraca coloração da amostra, mas é suficiente para a visualização de áreas de amostra para microdissecação. O processo de coloração tem de ser interrompido rapidamente por lavagem das lâminas com um excesso de água. A coloração prolongada dos resultados da amostra em baixos rendimentos peptídicas. Na próxima etapa, as secções secas são submetidas a microdissecação. A selecção da área de tecido de células individuais depende do tipo de investigação e exige conhecimento específico em histologia ou Pathomorphology. O material lançado por laser é cobrado sobre superfícies adesivas dos tubos de coleta de amostra. Uma vez que a capacidade de ligação do material de adesivo é limitado, é necessário transferir o material de microdissecção da tampa para tele tubo após dissecção de cada 3-5 mm 2 da amostra. Isto pode ser facilmente feito por pipetagem de alguns microlitros de tampão de lise do tecido (LTB) para a tampa e um curto espaço de fiação de tubo em uma centrífuga. Depois a amostra é recolhida no fundo do tubo, a microdissecção e a recolha da amostra sobre a tampa pode ser continuado. Uma vez que toda a amostra é recolhida os tubos têm que ser adicionalmente tapado com parafilme e incubado num banho de água a cerca de 99 ° C com agitação contínua durante 1 hora. Uma vez que durante a incubação de água condensa-se sobre a tampa, a cada 15 minutos os tubos têm de ser pouco centrifugada para recolher a água de volta no cone de tubo. Para obter peptídeos os lisados ​​de tecido são processadas usando a abordagem MED-FASP. Neste método, as proteínas hidrolisadas são empobrecido do detergente e outras substâncias de baixo peso molecular, carboamidomethylated em resíduos de cisteinilo, e depois, consecutivamente digerido com duas enzimas difFering em suas especificidades de clivagem: endoproteinase LysC e tripsina. Depois de cada passo de digestão, os péptidos são recolhidos em fracções separadas. Nesta parte da preparação da amostra que é importante continuar a cada um dos passos de centrifugação, até mais do que 95% da solução inicialmente carregado para dentro da unidade de filtração da membrana passou. Analisando tecido do cólon e cancro da sua observou-se que este procedimento produz 3-6 pg de péptido por 100 nl (tecido 100 ug ou 10 mm 2 de uma secção de 10 mm) do material de microdissecção (Tabela 1). Uma vez que a proteína total extraída dos tecidos é de cerca de 10% do peso do tecido dos processos de extracção e de digestão em conjunto resulta em um rendimento de 30-60% no que diz respeito ao tecido original fresco. Estes valores reflectem as perdas de proteína durante a desidratação e de coloração, por microdissecção, e a retenção da parte da amostra não digerida nas unidades de ultrafiltração. Porque extração e processamento de nenhumtecido FFPE n-microdissecção resultou em rendimento de proteína e peptídeo-conversão de 75% 5, é provável que as perdas de amostra críticas ocorrem durante as etapas anteriores MED-FASP. Uma característica importante das misturas de péptidos obtidos por este processo é o seu elevado grau de pureza, que facilita ainda mais péptido processo de fraccionamento de fraccionamento e a identificação de espectrometria de massa. Isto foi recentemente demonstrado pela análise de amostras de adenoma colorrectal 3. Nesse estudo cerca de 40% dos eventos de MS / MS levou à identificação de peptídeos de tecido FFPE e resultou em mapeamento de até 17.000 péptidos por ensaio LC-MS/MS único. Taxas mais altas de identificação foram alcançados apenas na análise in vitro de células cultivadas congelados 3. Nas duas últimas partes de todo o processo, os peptídeos isolados são quantificados e fraccionado em microcolunas pipeta com ponta. Uma vez que as quantidades de péptido isolado, a partir do tecido são microdissecção serbaixo 10 ug eles não podem ser quantificados utilizando ensaios de proteína à base de corantes comummente utilizados. Também os A 280 medidas de UV-espectral a estas concentrações não são úteis devido ao efeito de espalhamento de luz. Em contraste, as medições de fluorescência dos resíduos de triptofano oferecer uma maneira de confiança para a determinação do teor de péptido. Recentemente, temos mostrado que até 5.000 proteínas de células em cultura podem ser identificados em um &#39;tiro&#39; 4 hr análise LC-MS/MS 7. No entanto, este tipo de análise aplicada aos tecidos nativos raramente permite a identificação de mais do que 3000 mil proteínas. Para aumentar a profundidade da análise dos péptidos gerados na MED FASP têm de ser pré-fraccionadas antes LC-MS/MS. A separação de micro-coluna SAX base é um método de fraccionamento simples e eficiente 10. Já foi aplicada em vários estudos proteomic incluindo aqueles analisando tecido fixo 5, 8, 9. O SAX-microcolu &#39;pipeta ponta&#39;mns, eo C 18 - colunas de dessalinização &quot;StageTip &#39;9 são fáceis de preparar. As colunas são montados por empilhamento de tampões, cortadas a partir do SAX ou C 18 membranas, numa ponta de pipeta de 200 ul 11. Exemplos de a análise das amostras de FFPE fraccionado-SAX são mostrados na Tabela 1. <img alt="Figura 1" src="/files/ftp_upload/50589/50589fig1.jpg" /> Figura 1. Introdução ao procedimento. O processo consiste em quatro partes distintas: (1) preparação de secções das amostras FFPE e sua microdissecção, (2) a lise da amostra e processamento das proteínas utilizando abordagem MED FASP, e (3) quantificação e (4) fraccionamento da os péptidos. <table border="1" class="jove_content_small" fo:keep-together.within-page="always"><tbody><tr><td fo:width="1.4in"> Amostra </td><td fo:width="1in"> Amostra pré-fracionamento / digestão </strong&gt; </td><td fo:width="1in"> Espectrômetro de massa utilizado </td><td fo:width="1.25in"> Ng rendimento péptido / amostra nL (± DP) </td><td fo:width="1.25in"> Identificações únicas proteína por amostra única </td><td fo:width=".75in"> Referência </td></tr><tr><td> • Adenonocarcinoma • mucosa do cólon normal </td><td> SAX / uma enzima </td><td> Orbitrap-Velos </td><td> 36 ± 11 (n = 8) 30 ± 8 (n = 8) </td><td> 5.985 ± 54 5.868 ± 110 </td><td> 8 </td></tr><tr><td> • Colonic Adenoma </td><td> SAX / duas enzimas </td><td> Q Exactive </td><td> 56 ± 6,1 (n = 3) </td><td> 9.501 ± 28 </td><td> 3 </td></tr></tbody></table> Tabela 1. Resultados representativos das análises proteomic do tecido microdissecção FFPE.

Formalina de arquivo fixo e incluído em parafina (FFPE) amostras clínicas são material valioso para a investigação de doenças. Aqui demonstramos um fluxo de trabalho de preparação da amostra, permitindo uma análise em profundidade proteômica de tecido FFPE microdissecção.

Preparação de Amostras de proteômica fixados em formalina e embebidos em parafina Tissue

Preserved clinical material is a unique source for proteomic investigation of human disorders. Here we describe an optimized protocol allowing large scale ...

O objetivo geral deste procedimento é gerar e pré-fracionar peptídeos a partir de material formalina-fixado e embebido em parafina, ou FFPE, para análise proteômica. Isso é realizado mediante o isolamento do tecido desejado por microdissecção, seguido pela lise celular. O segundo passo é gerar peptídeos por meio do processamento da amostra.Utilizando a preparação de amostras assistida por filtro com digestão múltipla por enzimas. Os peptídeos são então quantificados mediante a medição de sua fluorescência de triptofano. O passo final é a fracionamento dos peptídeos utilizando uma técnica de separação baseada em troca iônica aniónica forte para fracionamento de peptídeos.No fim das contas, as amostras preparadas permitem a análise de proteomas a partir de quantidades mínimas de material até uma profundidade de 10.000 proteínas. A principal vantagem desta técnica em relação aos métodos existentes, como a digestão em gel ou em solução, é que ela é aplicável a quantidades mínimas de amostras clínicas, como células microdissecadas a laser. O método fornece amostras contendo peptídeos perfeitos e puros.O que facilita a exploração proteômica de tecidos e doenças humanas? Todo o protocolo consiste em técnicas desenvolvidas e publicadas anteriormente. Estas incluem fasp de alta recuperação, ativação com ponteira de pipeta e determinação do conteúdo de peptídeos com base na fluorescência de triptofano, demonstrando que o procedimento será Sra.Catina, uma técnica do nosso laboratório, começa a preparar fatias de tecido para microdissecção cortando seções com um micrótomo. A espessura das fatias depende da amostra. Geralmente, a microdissecção funciona bem com cortes de sete a 10 micrômetros.Após irradiar os lâminas com membrana com luz UV por 45 minutos, monte as seções sobre eles antes de secar a 37 graus Celsius por duas horas. Desparafinize as seções montadas por meio de duas incubações sucessivas em frascos consecutivos de xilol por dois minutos e meio e um minuto e meio. Em seguida, reidrate as seções consecutivamente.Incubações de um minuto em etanol absoluto, etanol a 70% e, finalmente, água. Após a coloração das seções com hematina de Meyer por 20 segundos.Enxágue com água por um minuto e deixe secar ao ar. Colete a população celular de interesse utilizando um sistema de microdissecção a laser. Ao usar o instrumento palm, colete as amostras nas tampas adesivas usando três microlitros de tampão de lise tecidual para 10 nanolitros do tecido microdissecado.Adicione o tampão ao material microdissecado na tampa e feche o tubo. Colete a suspensão após uma breve centrifugação. Em seguida, lise o tecido microdissecado a 99 graus Celsius em um bloco de aquecimento com agitação por uma hora.Clarifique o extrato bruto por centrifugação a 16.000 Gs e 18 graus Celsius durante 10 minutos. Misture até 50 microlitros do lisado clarificado com 200 microlitros da solução UA em uma unidade de ultrafiltração. Em seguida, centrifugue a 14.000 Gs até que reste menos de 10 microlitros da solução no filtro.Normalmente, este passo requer 10 a 15 minutos de centrifugação. Em seguida, pipete 200 microlitros da solução UA para a unidade de ultrafiltração e centrifugue. Como antes, esvazie o tubo de coleta antes de pipetar 50 microlitros da solução IAA para a unidade de ultrafiltração.Agite a 600 rpm em um misturador térmico à temperatura ambiente por um minuto e centrifugue. Como antes, prossiga com os passos de ultrafiltração e centrifugação conforme descrito no protocolo textual que acompanha este vídeo. Em seguida, transfira as unidades de filtração para novos tubos de coleta.Pipete 40 microlitros de tampão de digestão com endoproteinase lic C antes de misturar a 600 RPM no misturador térmico por um minuto. Incube as unidades em uma câmara úmida a 37 graus Celsius por 18 horas. Após centrifugar as unidades de filtro como feito anteriormente, pipete 160 microlitros do tampão DB e centrifugue.As unidades de filtro pelas quais o fluxo agrupado passa contêm os peptídeos liberados pela endoprotease lic C. Em seguida, colete os peptídeos trípticos conforme descrito no protocolo do texto. A medição do teor de peptídeos nos digestos proteicos pode ser realizada em tampão diluído porque os resíduos de triptofano estão bem acessíveis ao solvente. Para quantificar os peptídeos, pipete primeiro 0,2 mililitros do tampão de ensaio DB na cubeta de quartzo Q.Em seguida, coloque o Q vet no suporte do instrumento qve e registre o espectro de emissão do branco. Prepare uma curva de calibração usando incrementos de 0,1 micrograma, adicionando alíquotas de um microlitro da solução padrão de triptofano ao Q vet e misturando suavemente com o tampão db. Após limpar o Q vet, pipete a amostra e registre o espectro da amostra.Prossiga para calcular a concentração de proteína e peptídeo conforme descrito no protocolo textual antes da fracionamento. Prepare a coluna em ponta SAX empilhando seis camadas de membrana iônica EM.Import em uma ponteira comum de 0,2 mililitro. Prepare duas colunas em ponta SAX por amostra.Em seguida, prepare a ponta tipo estágio empilhando três camadas de M four C 18. Em uma ponta de pipeta de 0,2 mililitro, prepare seis pontas tipo estágio para cada amostra. Para começar.Fracione as soluções de peptídeos obtidas por digestão com ly C diluindo-as com 0,2 mililitros de tampão universal BRI e Robinson, pH 11. Da mesma forma, dilua as soluções de peptídeos obtidas por digestão com tripsina com 0,2 mililitros de tampão universal BRI e Robinson, pH 5. Monte a coluna em ponta SAX na tampa do adaptador de tubo centrífugo antes de lavar e equilibrar a coluna em ponta SAX e as pontas tipo estágio C18 conforme descrito no protocolo textual.Em seguida, monte a coluna com ponta SAX na ponta do estágio C18. Carregue as soluções amostrais nas colunas com ponta SAX equilibradas e centrifugue as colunas a 5.000 Gs durante três minutos. Lave as colunas de pontas de pipeta com 0,1 mililitros das amostras diluídas.Facilite o fluxo por centrifugação a 5.000 Gs. Transfira a coluna em forma de ponta SAX para a próxima ponta em etapa C18 e continue a eluir os peptídeos conforme descrito no protocolo textual. Após a lavagem das pontas em etapa C18 com 0,05 mililitros do tampão A, elua as frações com 0,05 mililitros do tampão B em frascos, posteriormente utilizados para a injeção das amostras em um sistema de cromatografia líquida acoplado a um espectrômetro de massas representativo. Os resultados da extração e digestão de proteínas são mostrados aqui.A lise de 250 nanolitros de tecido, correspondente a uma área microdissecada de 25 milímetros quadrados de um corte de 10 micrômetros, resulta em aproximadamente 45 microgramas de proteína total após a digestão consecutiva em duas etapas no formato rápido com a endoprotease Slice C e tripsina, obtendo-se rendimentos superiores a 50% da proteína total. É apresentada aqui uma medição representativa da fluorescência do conteúdo de peptídeos; os espectros do padrão de triptofano e da amostra mostram máximos entre 350 e 360 nanômetros. A intensidade da fluorescência é proporcional ao teor de triptofano.Após assistir a este vídeo, você deverá ter uma boa compreensão de como preparar amostras de tecido com alta densidade para análise proteômica utilizando a técnica de microdissecção, processamento de amostras e fracionamento de peptídeos. Uma vez dominada, esta técnica pode ser realizada em três a quatro horas, mais o tempo necessário para a digestão proteica. Ao tentar este procedimento, é importante lembrar de utilizar fatias de tecido recém-preparadas após seu corte. Este método abriu caminho para pesquisadores na área de proteômica explorarem os proteomas de tecidos e células, bem como as anomalias em humanos, utilizando material fixado e embebido em parafina.

proteomic-sample-preparation-from-formalin-fixed-paraffin-embedded

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Este vídeo demonstra o protocolo para a extração de DNA a partir de material fixado em formalina parafina. Este é um procedimento multi-dia em que as secções de tecido são desparafinizadas com xilol, reidratados com etanol e tratados com proteinase K para purificar e isolar DNA para análise de genes específicos ou genome-wide subseqüentes.

Extração de DNA de material parafinado Embedded para análises genéticas e epigenéticas

O vídeo a seguir descreve como preservar a morfologia de um tecido com fixação de formalina e inclusão em parafina.

Preservação de tecido embebido em parafina fixada em formalina (FFPE): um método para estudar a morfologia do tecido

Este protocolo de extracção modificado melhora RNA e DNA rendimentos provenientes de regiões mais precisamente alvo de interesse nos blocos de tecido histopatológicos.

Preparação de Núcleos de tecido parafina-encaixados formalina-fixados para RNA e DNA Extraction

Hibridação in situ de fluorescência (FISH) é geralmente necessário em combinação com histopatologia e diagnóstico molecular para seleção da terapia na medicina personalizada. Um fixador de tecido não-cross-linking, livre de formol romance que permite alta qualidade morfológica, molecular e análises de peixes do mesmo espécime por adição de uma etapa pós-fixação antes de peixes é apresentado.

Protocolo para HER2 pescar usando um fixador de tecido não-cross-linking, livre de formol para combinar as vantagens da crio-preservação e fixação de formalina

Este protocolo descreve um método reprodutível e confiável para preparação de formol fixada tecido destinado a espectrometria de massa de imagens baseada em sublimação.

Preparação ideal de formol fixada amostras para peptídeo baseado Matrix assistida por espectrometria de massa de ionização/dessorção Laser Imaging fluxos de trabalho

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Coleta e processamento de linfonodos de animais de grandes porte para a análise do RNA: preparando-se para estudos de linfonodo Transcriptomic de espécies de animais grandes

Na era da imunoterapia contra o câncer, o interesse em elucidar a dinâmica do microambiente tumoral aumentou de forma impressionante. Este protocolo detalha uma técnica de imagem de espectrometria de massa em relação às suas etapas de coloração e imagem, que permitem uma análise espacial altamente multiplexada.

Expandindo a compreensão do microambiente tumoral usando imagens de espectrometria de massa de amostras de tecido fixo e parafina

Aqui, estabelecemos um método proteômico baseado em espectrometria de massa usando regiões isoladas de interesse em seções de tecido fixadas em formalina e embebidas em parafina. Este protocolo é usado para analisar o proteoma de áreas específicas do tecido em seções de tecido arquivadas fixadas em formalina e embebidas em parafina.

Uma abordagem simplificada para proteômica baseada em espectrometria de massa usando regiões de tecido selecionadas

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Aprenda a preparar amostras de tecido FFPE para análise proteômica usando microdissecção a laser e digestão enzimática sequencial. Este protocolo permite identificar até 10.000 proteínas a partir de quantidades mínimas de material clínico.

Preparação de Amostras de proteômica fixados em formalina e embebidos em parafina Tissue

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