Preparação de Amostras de proteômica fixados em formalina e embebidos em parafina Tissue

O objetivo geral deste procedimento é gerar e pré-fracionar peptídeos a partir de material formal e fixo e embebido em parafina ou FFPE para análise proteômica. Isso é realizado pelo isolamento do tecido desejado por microdissecção, seguido de lise celular. O segundo passo é gerar peptídeos por processamento de amostras.

Usando a preparação de amostras auxiliada por filtro de digestão multienzimática. Os peptídeos são então quantificados medindo sua fluorescência de triptofano. A etapa final é o fracionamento dos peptídeos usando uma técnica de separação baseada em trocador de ânions forte para fracionamento de peptídeos.

Em última análise, as amostras preparadas permitem a análise de proteomas de quantidades mínimas de material até uma profundidade de 10.000 proteínas. A principal vantagem desta técnica sobre os métodos existentes, como na digestão em gel ou em solução, é que ela é aplicável a quantidades mínimas de amostras clínicas, como células microsectivas a laser. O método fornece amostras contendo peptídeos perfeitos e puros.

O que facilita a exploração proteômica de tecidos e doenças humanas? Todo o protocolo consiste em técnicas desenvolvidas e publicadas no passado. Estes incluem fasp de alta recuperação, pipeta de ponta e determinação do conteúdo de peptídeos com base na fluorescência do triptofano, demonstrando que o procedimento será a Sra.

Catina um técnico do nosso laboratório Para começar a preparar fatias de tecido para seções de corte de microdisect com um micrótomo. A espessura das fatias depende da amostra. Normalmente, a microdissecção funciona bem com fatias de sete a 10 micrômetros.

Depois de irradiar as lâminas de membrana com luz UV por 45 minutos, monte as seções nelas antes de secar a 37 graus Celsius por duas horas. Analise as seções montadas por duas incubações sucessivas em frascos consecutivos de xileno por dois minutos e meio e um minuto e meio. Em seguida, reidratar as seções consecutivamente.

Incubações de um minuto em etanol absoluto, 70% de etanol. E, finalmente, água. Depois de corar as seções com Hematin de Meyer por 20 segundos.

Enxágüe com água por um minuto e deixe secar ao ar. Colete a população de células de interesse usando um sistema de microdissecção por captura a laser. Ao usar o instrumento de palma, colete as amostras nas tampas adesivas usando três microlitros de tampão de lise tecidual para 10 nanolitros do tecido microdisecto.

Aplique o tampão no material microdissecado na tampa e feche o tubo. Recolher a suspensão após uma centrifugação curta. Em seguida, piolhos os micros dissecaram o tecido a 99 graus Celsius em um bloco de aquecimento com agitação por uma hora.

Clarificar o extracto bruto por centrifugação a 16 000 Gs e 18 graus Celsius durante 10 minutos. Misture até 50 microlitros do lisado clarificado com 200 microlitros da solução de UA em uma unidade de ultrafiltração. Em seguida, centrifugue a 14.000 GS até que menos de 10 microlitros da solução permaneçam no filtro.

Normalmente, esta etapa requer de 10 a 15 minutos de centrifugação. Em seguida, pipete 200 microlitros da solução de UA para a unidade de ultrafiltração e centrifugue. Como antes, esvazie o tubo de coleta antes de pipetar 50 microlitros da solução de IAA na unidade de ultrafiltração.

Misture a 600 RPM em um misturador térmico em temperatura ambiente por um minuto e centrifugue. Como antes, continue as etapas de ultrafiltração e centrifugação conforme descrito no protocolo de texto que acompanha este vídeo. Em seguida, transfira as unidades de filtragem para novos tubos de coleta.

Pipete 40 microlitros de tampão de digestão com endo proteinase lic C antes de misturar a 600 RPM no misturador térmico por um minuto. Incubar as unidades em uma câmara úmida a 37 graus Celsius por 18 horas. Depois de centrifugar as unidades de filtro como feito anteriormente, pipetar 160 microlitros do tampão DB e centrifugar.

As unidades de filtro através das quais o fluxo agrupado contém os peptídeos liberados pela endo protease lic C.Em seguida, colete os peptídeos trípticos conforme descrito no protocolo de texto. A medição do teor de peptídeos nas digerações de proteínas pode ser realizada em tampão diluído porque os resíduos de triptofano são bem acessíveis ao solvente. Para quantificar os peptídeos, primeiro pipete 0,2 mililitros de tampão de ensaio DB no veterinário de quartzo Q.

Em seguida, coloque o Q vet no suporte qve dos instrumentos e registre o espectro de emissão para o branco. Preparar uma curva de calibração utilizando passos de 0,1 microgramas, adicionando alíquotas de um microlitro da solução-padrão de triptofano ao veterinário Q e misturando suavemente com o tampão db. Depois de limpar o veterinário Q, pipetar a amostra e registar o espectro da amostra.

Prossiga para calcular a concentração de proteínas e peptídeos conforme descrito no protocolo de texto antes do fracionamento. Prepare a coluna de ponta SAX empilhando seis camadas de EM. Importe a membrana de íons em uma ponta de pipeta comum de 0,2 mililitro. Faça duas colunas de ponta SAX por amostra.

Em seguida, prepare a ponta do palco empilhando três camadas de M quatro C 18. Em uma ponta de pipeta de 0,2 mililitro, faça seis pontas de estágio para cada amostra. Para começar.

O fracionamento dilui as soluções peptídicas obtidas por digestões com ly C com 0,2 mililitros de BRI e tampão universal Robinson. pH 11 dilui de forma semelhante as soluções peptídicas obtidas por digestões com tripsina com 0,2 mililitros de tampão Britain e Robinson Universal. pH cinco montar a coluna de ponta SAX na tampa do adaptador do tubo centrífugo antes de lavar e adquirir equilibrando a coluna de ponta SAX e as pontas do estágio C 18 conforme descrito no protocolo de texto.

Em seguida, monte a coluna de ponta SAX na ponta do estágio C 18. Carregue as soluções de amostra nas colunas de ponta SAX equilibradas e centrifugue as colunas a 5.000 Gs por três minutos. Lave as colunas da ponteira da pipeta com 0,1 mililitros das amostras diluídas.

Facilitar o escoamento por centrifugação a 5.000 Gs.Transferir a coluna da ponta SAX para a ponta C 18 seguinte e continuar a eluir os peptídeos conforme descrito no protocolo de texto. Após a lavagem das pontas do estágio C 18 com 0,05 mililitros de tampão a, eluir as frações com 0,05 mililitros de tampão B em frascos, posteriormente usados para injeção das amostras em um sistema de cromatografia líquida montado com um representante do espectrômetro de massa. Os resultados da extração e digestão de proteínas são mostrados aqui.

A lise de 250 nanolitros de tecido, que corresponde a uma área microdissecada de 25 milímetros quadrados a partir de uma fatia de 10 micrômetros, resulta em aproximadamente 45 microgramas de proteína total após a digestão consecutiva em duas etapas no formato de jejuns com endo protease fatia C e tripsina resulta em rendimentos de mais de 50% da proteína total. Aqui é mostrada uma medição de fluorescência representativa do conteúdo de peptídeos, os espectros do padrão Trytophan e a amostra mostram máximos de 350 a 360 nanômetros. A intensidade da fluorescência é proporcional ao teor de triptofano.

Depois de assistir a este vídeo, você deve ter uma boa compreensão de como preparar amostras de tecido alto para análise proteômica usando técnica de microdissecação, processamento de amostras e fracionamento de peptídeos Uma vez dominada, essa técnica pode ser feita em três a quatro horas mais o tempo necessário para indigestão de proteínas. Ao tentar este procedimento, é importante lembrar de usar fatias de tecido recém-preparadas após seu desenvolvimento. Essa técnica abriu caminho para pesquisadores no campo da proteômica explorarem os proteomas de tecidos e células e as anormalidades em humanos usando arval para material fixo e parêntese.