2.6: Transformação Bacteriana: O Método de Choque térmico

A transformação bacteriana é um método amplamente utilizado em que o DNA estranho é introduzido em uma bactéria, que pode amplificar ou clonar o DNA. As células que têm a capacidade de absorver prontamente esse DNA são chamadas de células competentes. Embora a transformação ocorra naturalmente em muitos tipos de bactérias, os cientistas descobriram maneiras de induzir e aumentar artificialmente a competência de uma célula bacteriana. Neste vídeo, falaremos sobre uma dessas maneiras, a transformação do choque térmico.

Antes de falarmos sobre a técnica de choque térmico, vamos primeiro discutir o tipo de DNA mais comumente usado na transformação bacteriana: o plasmídeo. Um plasmídeo é um DNA pequeno, circular e de fita dupla que pode reduzir seu tamanho por superenrolamento, de modo que pode passar facilmente pelos poros de uma membrana celular.

Um plasmídeo contém algumas regiões importantes que valem a pena mencionar. Os plasmídeos disponíveis comercialmente contêm um local de clonagem múltipla ou MCS. Esta região contém sequências específicas reconhecidas por endonucleases de restrição ou enzimas de restrição, que clivam o DNA. Fragmentos de DNA de interesse para o pesquisador podem ser inseridos no sítio de clonagem múltipla quando o plasmídeo e o fragmento de DNA são cortados com as mesmas endonucleases.

Os plasmídeos também contêm uma Origem de Replicação, ou ORI, que fornece informações à célula sobre onde a replicação do plasmídeo deve começar.

Além da origem da replicação e do local de clonagem múltipla, a maioria dos plasmídeos incluirá um gene de resistência a antibióticos. Este gene confere resistência a antibióticos a todas as células que contêm o plasmídeo, permitindo que essas células sobrevivam em meios contendo antibióticos.

Agora que discutimos os plasmídeos, vamos falar sobre as células nas quais eles serão introduzidos: as células competentes. O tipo de bactéria mais comumente usado na pesquisa e transformação de biologia molecular é a E. coli, que também habita o intestino grosso. As células são normalmente tornadas competentes por meio da exposição a um ambiente rico em cálcio.

As cargas positivas dos íons cálcio neutralizam as cargas negativas do plasmídeo e da parede celular bacteriana, dissipando a repulsão eletrostática e enfraquecendo a parede celular.

Ao expor as células a um aumento repentino de temperatura, ou choque térmico, é criada uma diferença de pressão entre o exterior e o interior da célula, que induz a formação de poros, através dos quais o DNA do plasmídeo superenrolado pode entrar. Depois de retornar as células a uma temperatura mais normal, a parede celular se auto-cura.

Uma vez que as células tenham absorvido o plasmídeo, elas serão capazes de crescer em placas de ágar misturadas com antibiótico.

Antes de iniciar a transformação do choque térmico, limpe a área de trabalho e certifique-se de que todo o equipamento esteja esterilizado.

Certifique-se de ter meios e ágar suficientes preparados, que fornecem a nutrição para as bactérias que você tornará competentes. Certifique-se também de esterilizar todas as soluções em autoclavagem. Deixe o meio líquido esfriar até a temperatura ambiente antes de usar e deixe o ágar esfriar até 50-55? C, a temperatura na qual o antibiótico pode ser adicionado e os pratos derramados. Deixe as placas esfriarem até a temperatura ambiente para solidificar.

Ao trabalhar com bactérias, deve-se sempre usar a técnica asséptica para manter a esterilidade. A técnica asséptica normalmente envolve o uso de um bico de Bunsen para esterilizar instrumentos e reagentes e criar uma corrente de convecção ? que mantém os contaminantes transportados pelo ar fora do espaço de trabalho.

Imediatamente antes da reação de choque térmico, pré-aqueça o meio à temperatura ambiente e as placas de ágar LB contendo antibióticos a 37 ° C. Certifique-se também de que seu banho-maria esteja a 42?C.

Em seguida, descongele as células quimicamente competentes no gelo.

Adicione, 1-5uL de 1ng/? L plasmídeo frio para as células bacterianas, misture delicadamente e retorne a mistura de células e plasmídeos ao gelo por 30 minutos.

Quando o tempo acabar, choque térmico da mistura de células e plasmídeos, colocando-a em banho-maria a 42? C por 30 segundos.

Imediatamente após tirar o tubo do banho-maria, coloque-o no gelo e adicione 450? L de mídia. Coloque-o em uma incubadora trêmula para 37? C por 1 hora a mais de 225 rpm para que as células possam se recuperar.

Usando a técnica asséptica adequada, adicione 20-200uL de bactérias a uma placa de ágar LB e espalhe o meio com um espalhador bacteriano. Incubar as placas durante a noite a 37? C de cabeça para baixo para evitar a exposição de bactérias à condensação.

No dia seguinte, as bactérias que absorveram o plasmídeo formam colônias.

Em seguida, conte as colônias para calcular a eficiência da transformação, que é o número de transformantes bem-sucedidos dividido pela quantidade total de DNA plaqueado.

Agora, as colônias podem ser selecionadas para experimentação adicional.

Antes de serem tornadas competentes, as bactérias utilizadas na transformação são armazenadas no congelador. Eles devem ser descongelados no gelo, espalhados em um prato de ágar ? sem antibióticos, e permitiu crescer durante a noite a 37?C.

Usando técnica asséptica, selecione uma colônia bacteriana da placa de ágar e cresça-a em uma grande cultura de 500 ml durante a noite a 37? C em uma incubadora trêmula? um instrumento, que evita a sedimentação da bactéria e até mesmo a dispersão de nutrientes no meio.

Enquanto as células estão crescendo, faça cloreto de cálcio 0,1 molar e cloreto de cálcio 0,1 molar mais soluções de glicerol a 15%, autoclave e deixe esfriar.

As medições de absorbância são usadas para determinar se as bactérias estão ou não em sua fase intermediária de crescimento, o que significa que elas absorverão prontamente o DNA. Assim que as células atingirem essa fase, coloque-as no gelo e mantenha-as lá durante todo o procedimento.

Em seguida, separe as células bacterianas em dois grandes tubos de centrífuga e gire a 4 ° C. Despeje o sobrenadante e ressuspenda em cerca de 100 ml 0,1 molar de cloreto de cálcio frio. Em seguida, incube as células no gelo por 30 minutos. Esta etapa é repetida pelo menos mais uma vez. Ciclos de fiação e ressuspensão de células são frequentemente chamados de lavagem de suas células.

Após a lavagem final, ressuspenda as células em uma solução fria de 50mL de cloreto de cálcio 0,1 molar mais glicerol a 15%. Essas células agora são quimicamente competentes.

Distribuir 50? L de bactérias em vários tubos de microcentrífugas e armazene a -80? C até estar pronto para choque térmico.

Existem muitas aplicações e variações de transformação bacteriana.

Além do choque térmico, a eletroporação é outra técnica comum de transformação. Como o próprio nome indica, a eletroporação envolve o uso de eletricidade para fazer poros na membrana celular bacteriana através dos quais o DNA pode passar.

Com relação à triagem de bactérias transformadas, os plasmídeos geralmente contêm um gene que codifica a enzima beta-galactosidase para auxiliar na triagem. Quando o substrato para esta enzima é incluído em placas de ágar, as bactérias que foram transformadas com plasmídeos contendo uma inserção produzem colônias brancas, enquanto aquelas que não o fazem, produzem colônias azuis. Este método é conhecido como triagem azul e branca.

Na maioria dos experimentos de transformação, o objetivo é fazer com que as bactérias que se dividem rapidamente produzam grandes quantidades de seu plasmídeo, que inclui seu gene alvo. Após a transformação bacteriana, o próximo passo é cultivar grandes quantidades de bactérias em meio líquido contendo antibióticos e realizar a purificação do plasmídeo, que, como o nome sugere, envolve a purificação dos plasmídeos das bactérias. Muitos kits comerciais estão disponíveis para esse fim.

Às vezes, o objetivo da transformação é fazer com que as bactérias gerem grandes quantidades de proteínas codificadas pelo plasmídeo. Aqui você vê células bacterianas sendo homogeneizadas e lisadas antes que uma técnica chamada purificação de afinidade possa ser realizada para isolar a proteína alvo. Depois de purificar grandes quantidades da proteína, ela pode ser cristalizada e a estrutura da proteína específica de interesse pode ser identificada.

Você acabou de assistir JoVE Introdução às transformações de choque térmico. Neste vídeo, revisamos: o que é a transformação por choque térmico e como ela funciona, o princípio por trás dela e como transformar bactérias com sucesso. Obrigado por assistir!