Transplante de células olfativas Ensheathing para avaliar a recuperação funcional após a lesão do nervo periférico

O objetivo geral deste procedimento é apresentar um modelo de transplante celular baseado no uso de células olfativas e de Bainier no modelo de lesão do nervo laríngeo. Isso é realizado inicialmente mediante secção e realização de anastomose do nervo laríngeo recorrente. Em seguida, são transplantadas as células olfativas e de Bainier obtidas da mucosa olfativa ou dos bulbos olfativos.

Então, dois a três meses após a cirurgia, os animais são avaliados por laringoscopia e eletromiografia. Por fim, o nervo laríngeo recorrente é isolado para estudos histológicos. Em última análise, podem ser obtidos resultados que demonstram que as células olfativas e as células de bainha melhoram o rebrotamento axonal do nervo laríngeo recorrente e a recuperação funcional das pregas vocais por meio de laringoscopia, eletromiografia e medidas histológicas.

Este método pode responder perguntas fundamentais na área de lesão do nervo periférico que envolvem a medida do crescimento axonal e a capacidade de quantificar a funcionalidade da recuperação. Geralmente, indivíduos novos neste método terão dificuldades porque a anastomose recorrente dos nervos laríngeos exige habilidades microcirúrgicas. Após gerar culturas primárias marcadas com GFP de bulbo olfatório, ou BO, e mucosa olfatória, ou MO, conforme descrito no protocolo escrito. Prepare-se para a cirurgia autoclavando todos os instrumentos.

Uma vez que a rata tenha sido anestesiada por injeção intraperitoneal de quetamina e clorpromazina, verifique o nível de sedação realizando um aperto no dedo do pé. Depile a área cirúrgica e posicione a rata em decúbito dorsal, desinfete a pele com lavagens alternadas de álcool e solução de Betadine. Em seguida, monte um ambiente cirúrgico estéril e mantenha procedimentos estéreis durante toda a cirurgia.

Use um bisturi para fazer uma incisão cutânea cervical medial de dois centímetros. Em seguida, seguindo a linha branca medial, realize uma incisão vertical dos músculos infra-hióideos utilizando um retrator ortostático entre os músculos infra-hióideos. Exponha a laringe e, em seguida, o nervo laríngeo recorrente ou RLN.

Em seguida, sob microscópio cirúrgico, use tesoura microcirúrgica para cortar completamente o nervo ao nível do sétimo anel traqueal com um ponto de sutura 11 T. Realize anastomose para desservir o laringe logo antes do transplante. Use tripsina EDTA 0,05% para remover as células OB e OM das placas.

Em seguida, para interromper a digestão, adicione cinco mililitros de meio quente após centrifugar as células a 432 ×g por cinco minutos. Use um hemocitômetro para contar as células e ajuste a concentração celular neste modelo entre 1,2 e seis vezes 10 à sexta potência células em 30 microlitros de D-M-E-M-F 12, usados em um tubo microcêntrifuga. Prepare uma proporção de um para dois de células com fator de crescimento, Matrigel reduzido e coloque no gelo logo antes do transplante.

Retire o tubo do gelo e segure-o para aquecer a mistura. Usando uma pipeta, deposite a solução de células em Matrigel no local da anastomose e permita que a mistura se autoassemble quando estiver firme. Use quatro pontos cirúrgicos para fechar os músculos e a pele.

Coloque a rata em uma gaiola individual e mantenha-a sob uma lâmpada de aquecimento por 24 horas. Administre analgésicos pelos próximos cinco dias, aproximadamente dois meses após a cirurgia, após anestesiar. Ratos como descritos anteriormente neste vídeo, utilize uma pinça no dedo do pé para confirmar a sedação.

Coloque a rata em decúbito dorsal antes de inserir um vídeo com ângulo de 30 graus. Ajuste o laringoscópio para obter a melhor visualização da laringe, reproduzindo a mesma visão em cada gravação. Determine marcos anatômicos, como a comissura posterior, a prega vocal direita onde ela se insere na apófise vocal do OID e a prega vocal esquerda onde ela se insere na hipótese vocal do oid.

Registre os movimentos das pregas vocais selecionando três sequências de abdução máxima sucessiva e abdução máxima. Para analisar a função laríngea, determine o movimento angular absoluto medindo a diferença entre o movimento de abdução máxima e abdução máxima das pregas vocais. Determine o escore dinâmico medindo a amplitude do movimento e o escore funcional medindo as movimentações de sinquinesia e paradoxais para realizar a eletromiografia.

Coloque um eletrodo sobre o músculo isquiotibial da rata após expor a laringe e a traqueia, conforme demonstrado para anastomose do nervo recorrente. Exponha a cartilagem cricotireoidea. Em seguida, utilizando tesoura microcirúrgica, abra a cartilagem cricotireoidea para expor o músculo cricotireoideo posterior ou músculo PCA.

Insira um eletrodo agulha monopolar no músculo com o animal sob ventilação espontânea. Utilize um sistema de aquisição para registrar a atividade elétrica muscular do músculo PCA. Analise a atividade muscular em termos de riqueza e sincronização com a respiração, atribuindo uma pontuação qualitativa de zero a três utilizando a seguinte escala.

Zero equivale a um traçado não testado, sem aumento durante a inspiração. Um equivale a um traçado rítmico com aumento na inspiração, mas pobre; dois equivale a um traçado rítmico com atividade mais rica; e três equivale a um traçado rítmico muito intenso, constituindo um padrão de interferência semelhante ao de uma atividade voluntária máxima.

Em seguida, para evitar danos ao NRL devido ao seu pequeno tamanho, exponha o nervo vago, depois fixe um eletrodo e realize a estimulação neste local. Registre a latência e a duração do potencial no músculo CPA. Por fim, após a eutanásia do animal por sobredosagem de pentobarbital sob microscópio, localize a anastomose, suture e remova o coto distal do NRL entre a anastomose e a laringe.

Realize a análise histológica de acordo com o protocolo descrito aqui após o transplante de células de culturas primárias de mucosa olfativa, e bulbo olfativo são exemplos de traçados de EMG obtidos no músculo PCA durante a respiração. Animais do grupo controle apresentaram uma rica atividade muscular elétrica com aumento durante a inspiração, o que não foi observado no grupo tratado. Nesta figura, análises histológicas do NRL por coloração com azul de toluidina mostram perfis típicos de fibras de animais normalmente reinervados e transplantados.

Essa medição permite a quantificação do número de fibras mielinizadas, do tamanho médio das fibras e da espessura média da bainha de mielina, conforme mostrado aqui. Para concluir as análises histológicas, o rastreamento de células positivas para GFP foi realizado após o transplante intra-nervoso no nervo ciático.

Este local foi escolhido em vez do NRL porque o pequeno tamanho do NRL impede o transplante intra-neural. A anastomose de Hans pode ser realizada em 15 minutos, desde que seja executada corretamente após seu desenvolvimento. Essas técnicas abriram caminho para pesquisadores na área de lesão do nervo periférico explorarem o uso do transplante celular em um modelo de rato.

Após assistir a este vídeo, você deverá ter uma boa compreensão de como transplantar células no modelo de lesão do nervo recorrente e avaliar a recuperação funcional das pregas vocais por meio de eletromiografia, endoscopia laboratorial e medições histológicas.