Uso de Citometria de imagem para quantificação de fungos patogênicos em associação com células do hospedeiro
19 de junho de 2013
Aqui, demonstramos como citometria de imagem pode ser usada para quantificação de fungos patogénicos em associação com as células hospedeiras em cultura. Esta técnica pode ser usado como uma alternativa para CFU enumeração.
O objetivo geral deste procedimento é quantificar leveduras patogênicas em associação com células hospedeiras sem unidades formadoras de colônias de plaqueamento. Primeiro, infecte as células dos macrófagos com capsulação H ou as células de levedura C albicans coram as células dos macrófagos infectadas com laranja aina e iodeto de propídio para destacar as células de levedura viáveis. Em seguida, usando um citômetro de imagem, capture uma série de imagens e analise os parâmetros de tamanho e forma para enumerar com precisão as células de levedura.
Os resultados da citometria de imagem podem ser efetivamente usados para quantificar leveduras patogênicas em associação com células hospedeiras. Tive a ideia desse método pela primeira vez ao fazer pesquisas no campo da patogênese fúngica, na qual tive que plaquear e contar repetidamente as unidades formadoras de colônias para quantificação da cápsula do fungo patogênico Histoplasma. A principal vantagem da citometria de imagem sobre o método padrão de enumeração de UFC é sua velocidade aumentada, pois elimina as etapas de trabalho e tempo intensivo de plaqueamento, incubação e contagem de múltiplas diluições seriais de UFC ao comparar o crescimento de cepas selvagens e mutantes dentro das células hospedeiras.
Este método elimina o viés potencial introduzido por diferentes habilidades para iniciar o crescimento da qualidade em meios sólidos. Geralmente, indivíduos novos neste método podem ser desafiados pela citometria de imagem. Instrumentação e software.
Comece o procedimento cultivando os macrófagos na densidade desejada. Em placas de 24 poços, adicione as células fúngicas na fase logarítmica de crescimento e, em seguida, incube por 90 minutos para permitir a fagocitose. Em seguida, lave os macrófagos três vezes com PBS para remover os fungos extracelulares incubados nos pontos de tempo definidos experimentalmente antes da análise da amostra em baixa multiplicidade de infecção, as células de macrófagos infectadas permanecem viáveis por vários dias e as amostras podem ser analisadas aproximadamente a cada 12 a 24 horas.
Após três lavagens com PBS, adicione 0,5 mililitros de água estéril às células de macrófagos infectadas. Incube por cinco minutos em temperatura ambiente para liberar os fungos das células dos macrófagos. Em seguida, colha o lisado em um tubo estéril e mantenha no gelo.
Transfira 20 microlitros do lisado para um tubo separado. Adicione 20 microlitros de solução de iodeto de propídio laranja para análise citométrica de imagem imediata. Efectuar uma diluição de dez vezes dos lisados em meios.
Em seguida, coloque 100 microlitros de cada diluição em duplicata. Em placas HMM aros. Incube as placas em uma câmara umidificada a 37 graus Celsius com 5% de dióxido de carbono por sete a oito dias.
Conte manualmente as colônias nas placas, exibindo um mínimo de 100 e um máximo de 1000 colônias distintas. Para coletar os macrófagos vivos, lave as células três vezes com PBS. Em seguida, adicione 0,5 mililitros de PBS e incube por 30 minutos a quatro graus Celsius.
Remova os macrófagos dos poços de cultura de tecidos por pipetagem suave. Transfira o líquido para um tubo estéril e guarde com gelo. Para configurar o instrumento acelerômetro, insira os módulos ópticos de fluorescência no sistema e certifique-se de que estejam travados no lugar.
Ligue o citômetro de imagem no menu suspenso do ensaio do software. Selecione o tipo de ensaio predefinido e o tipo de célula para viabilidade. O ensaio é otimizado para detecção de laranja aina e iodeto de propídio para detecção de infecção por candida albicans.
O ensaio é otimizado para detecção de GFP. Agora abra a guia de opções e clique em tirar imagem de fundo Após a conclusão da operação, clique em visualizar imagem de campo claro para a medição de viabilidade A OPI. Misture 20 microlitros de amostra com 20 microlitros de A OPI e pipete na câmara de contabilidade para a taxa de infecção por candida albicans.
Misture bem a amostra e pipete-a diretamente na câmara de contagem. Depois que as células se acomodarem na câmara, insira a câmara de contagem no citômetro de imagem para aquisição de imagem. Coloque a amostra em foco e clique em contagem.
Quando a operação de aquisição de imagem estiver concluída, remova a câmara de contagem descartável e descarte-a adequadamente. Para uma medição de OPI, os resultados de concentração e viabilidade são exibidos na página de resultados da contagem para determinar a taxa de infecção por candida albicans. Depois de obter os resultados da contagem, clique em exportar.
Em seguida, envie os dados para o FCS express four para análise da população celular de GFP. No FCS express, importe o arquivo de dados e plote os resultados em um histograma de fluorescência. Em seguida, aplique uma porta de população de células ao histograma para determinar as porcentagens populacionais de células infectadas por candida albicans.
Este experimento monitora o crescimento de células de macrófagos infectadas pela levedura hcaps Lotum em pontos de tempo definidos. As amostras são coradas e analisadas por citometria baseada em imagem. As células de levedura liberadas de macrófagos atados são identificadas pelo software de visão Soter.
Aqui, o número absoluto de leveduras vivas detectadas é maior do que a levedura capaz de formar colônias em meio sólido. Esses dados destacam a presença de um número significativo de células viáveis, mas não cultiváveis. Esses macrófagos derivados da medula óssea foram infectados com células de levedura C albican expressando proteína fluorescente verde sob o controle do promotor A DH one.
Multiplicidades de infecção variando de 0,1 a 10 resultaram em aumentos incrementais na intensidade de GFP dentro de macrófagos infectados, bem como na porcentagem total de macrófagos infectados Uma vez dominados. Essa técnica pode ser feita em apenas alguns minutos por amostra, se for executada corretamente. Ao tentar este procedimento, é importante lembrar de definir os parâmetros de forma que apenas as células fúngicas e não as células hospedeiras sejam contadas.
Depois de assistir a este vídeo, você deve ter uma boa compreensão de como usar a citometria de imagem para quantificar leveduras patogênicas em associação com células hospedeiras. Não se esqueça de que trabalhar com fungos patogênicos pode ser extremamente perigoso, portanto, use equipamentos de proteção individual e siga os procedimentos adequados de descarte de resíduos de risco biológico.
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Visão Geral
Este estudo demonstra o uso da citometria de imagem para quantificar fungos patogênicos em associação com células hospedeiras em cultura. Este método serve como uma alternativa eficiente à enumeração tradicional de unidades formadoras de colônia (UFC).
Componentes Principais do Estudo
Área da Ciência
- Patogênese fúngica
- Microbiologia celular
- Técnicas de imagem quantitativa
Antecedentes
- Leveduras patogênicas podem ser difíceis de quantificar usando métodos tradicionais.
- A enumeração de UFC é trabalhosa e demorada.
- A citometria de imagem oferece uma alternativa mais rápida para quantificação.
- O estudo foca na interação entre macrófagos e leveduras patogênicas.
Objetivo do Estudo
- Quantificar leveduras patogênicas em células hospedeiras sem utilizar métodos de UFC.
- Melhorar a eficiência na quantificação de infecções fúngicas.
- Fornecer um método confiável para analisar as interações entre leveduras e células.
Métodos Utilizados
- Infecção de células de macrófagos com H capsulação ou células leveduriformes de C albicans.
- Coloração das células infectadas com laranja de acridina e iodeto de propídio.
- Captura de imagens utilizando um citômetro de imagem.
- Análise dos parâmetros de tamanho e forma para enumerar as células leveduriformes.
Resultados Principais
- A citometria de imagem quantifica efetivamente leveduras patogênicas em células hospedeiras.
- O método reduz o tempo e o trabalho envolvidos na enumeração de UFC.
- Os resultados podem ser usados para comparar o crescimento entre cepas selvagens e mutantes.
- A técnica aprimora o estudo da patogênese fúngica.
Conclusões
- A citometria de imagem é uma alternativa viável à enumeração de UFC.
- Este método simplifica o processo de quantificação para pesquisadores.
- Abre novas possibilidades para o estudo de interações entre hospedeiro e patógeno.
Perguntas Frequentes
Relevância Executiva para a Indústria
A quantificação de fungos patogênicos em células hospedeiras é essencial para a validação de alvos antifúngicos e a identificação de compostos líderes na descoberta de fármacos antifúngicos. A enumeração tradicional por UFC apresenta como limitações o crescimento lento, a eficiência variável de plaqueamento e fluxos de trabalho intensivos em mão de obra, o que restringe a produtividade em estudos comparativos de cepas e mecanísticos. A citometria de imagem oferece uma alternativa rápida, sensível e econômica que permite a avaliação quantitativa da viabilidade de leveduras e do crescimento intracelular sem a necessidade de plaqueamento, proporcionando maior confiança preditiva nos ensaios pré-clínicos de agentes antifúngicos.
Aplicações Estratégicas em P&D de Biotecnologia Farmacêutica
Descoberta Inicial e Validação de Alvo
- Valor Científico: Permite a investigação de hipóteses terapêuticas mediante a quantificação do crescimento intracelular de leveduras em macrófagos, esclarecendo a dinâmica das interações entre patógeno e hospedeiro.
- Valor Operacional: Oferece validação funcional de alvos por meio da medição direta da carga de leveduras viáveis nas células hospedeiras, reduzindo a dependência de desfechos substitutos.
- Valor Preditivo: Reforça a confiabilidade preditiva e o triagem de portfólios ao detectar populações de leveduras viáveis, mas não cultiváveis, que passam despercebidas em contagens de UFC, melhorando a precisão na comparação de cepas.
Triagem e Desenvolvimento de Ensaios
- Prontidão do ensaio: Prepara sistemas biológicos validados (co-cultivos de levedura e macrófagos) para triagem de compostos antifúngicos com protocolos padronizados de infecção e lise.
- Saída quantitativa: Fornece enumeração reproduzível de células de levedura com base em tamanho e forma por meio da coloração com acridina laranja/iodeto de propídio e citometria de imagem, permitindo avaliação confiável de compostos.
- Escalabilidade: Permite reutilização da plataforma em diferentes patógenos fúngicos (por exemplo, Histoplasma capsulatum, Candida albicans) e análise de linhagens mutantes, aumentando a produtividade da triagem.
Pesquisa Translacional e Pré-Clinica
- Relevância para a Doença: Modela a patogênese fúngica humana mediante a quantificação da replicação de leveduras nos fagossomos de macrófagos, alinhando-se a estratégias translacionais de biomarcadores para a carga de patógenos intracelulares.
- Continuidade Pré-clínica: Conecta a descoberta à validação pré-clínica ao fornecer métricas quantitativas de infecção ao longo do tempo, apoiando decisões de avanço com ajuste de risco.
- Redução de Riscos Mecanística: Concentra-se na redução de riscos preditiva ao revelar discrepâncias entre UFC e as contagens reais de leveduras viáveis, destacando as limitações dos ensaios tradicionais de viabilidade.
Integração de Pipeline e Fluxo de Trabalho
O método integra-se ao contínuo de descoberta de antifúngicos, desde a validação inicial do alvo até a identificação de compostos líderes e os testes de eficácia pré-clínica, permitindo a avaliação quantitativa de compostos antifúngicos em modelos fisiologicamente relevantes de hospedeiro-patógeno.
- Biologia da Descoberta: Apoia a verificação de hipóteses e a elucidação de vias ao quantificar a sobrevivência e replicação de leveduras dentro de células hospedeiras sob perturbações genéticas ou farmacológicas.
- Triagem: Permite a preparação do ensaio por meio de fluxos de trabalho padronizados de infecção, lise e coloração que geram saídas quantitativas reprodutíveis para triagem de bibliotecas de compostos.
- Análises: Gera enumeração de leveduras e métricas de viabilidade baseadas em tamanho e forma por citometria de imagem, facilitando a comparação de condições antifúngicas e fenótipos de linhagens.
- Pesquisa Translacional: Conecta-se à continuidade pré-clínica ao modelar o crescimento fúngico intracelular em macrófagos, uma característica de virulência fundamental nas micoses sistêmicas.
- Reutilização Empresarial: Funciona como uma plataforma de quantificação reutilizável entre espécies fúngicas e tipos de células hospedeiras, reduzindo o desenvolvimento redundante de ensaios.
Impacto Operacional e Empresarial
- Valor Científico: Aumenta a confiança preditiva na validação de alvos ao detectar populações viáveis de levedura não detectadas por UFC, reduzindo a ambiguidade mecanicista nos estudos do mecanismo de ação de antifúngicos.
- Valor Operacional: Aprimora a padronização e reprodutibilidade por meio da aquisição e análise automatizadas de imagens, minimizando a variabilidade dependente do usuário na contagem de leveduras.
- Valor Estratégico: Melhora as decisões de prosseguir ou não prosseguir ao fornecer cinéticas de infecção mais rápidas e precisas, reduzindo o tempo e o consumo de recursos na triagem inicial de antifúngicos.
- Impacto no Portfólio: Permite a priorização ajustada ao risco ao identificar compostos eficazes contra reservatórios intracelulares de levedura, abordando uma limitação fundamental dos antifúngicos atuais.
Considerações sobre a Implementação
- Requer experiência em patogênese fúngica, cultura de macrófagos e microscopia de fluorescência para garantir a discriminação precisa entre levedura e hospedeiro.
- Depende de instrumentação de citometria por imagem (por exemplo, Cellometer Vision) com óptica de fluorescência e software de ensaio de viabilidade para detecção de verde de acridina/iodeto de propídio e GFP.
- Necessita padronização entre equipes dos tempos de infecção, multiplicidade de infecção e protocolos de lise para assegurar liberação e quantificação reprodutíveis de leveduras.
- Envolve considerações de adaptação para diferentes espécies fúngicas (por exemplo, cepas que expressam GFP) e tipos de células hospedeiras (por exemplo, macrófagos primários versus linhagens celulares) para manter a especificidade do sinal.
- Limitado pela necessidade de otimizar parâmetros de coloração e de imagem para excluir sinais das células hospedeiras e evitar supercontagem, especialmente em amostras com fundo elevado.
