Question 1

O que é um plasmídio e por que é usado na transformação bacteriana?

Accepted Answer

Um plasmídeo é um pequeno pedaço circular e extracromossômico de DNA que atua como um vetor para transportar sua sequência específica de DNA para células bacterianas. Ele contém um local de clonagem múltipla onde enzimas de restrição insere seu gene alvo, uma origem de replicação para cópia de DNA e um gene de resistência a antibióticos que permite que as bactérias transformadas sobrevivam em meios contendo antibióticos.

Question 2

Como a eletroporação cria poros nas membranas celulares bacterianas?

Accepted Answer

A eletróporação aplica um campo elétrico de alta tensão de 1.000 a 10.000 volts por centímetro por milissegundos, fazendo com que a tensão através da membrana alcance 0,5-1 volts. Isso reorganiza a bicamada de fosfolipídios, criando poros temporários pelos quais DNA plasmídico passa. Uma vez que a pulsação para, a bicamada se repara, aprisionando o DNA dentro da célula.

Question 3

O que são células eletrocompetentes e como são preparadas?

Accepted Answer

As células eletrocompetentes são bactérias preparadas para prontamente absorver DNA durante a eletroporação. As células de E. coli são cultivadas até a fase logarítmica média, então lavadas várias vezes em água desionizada e solução de glicerol 10% para remover o sal. A remoção do sal é crítica porque o alto teor de sal causa arco elétrico, uma descarga elétrica que mata as células e indica falha na transformação.

Question 4

Por que a constante de tempo é importante na previsão do sucesso da eletropodação?

Accepted Answer

A constante de tempo mede a rapidez com que a voltagem decai após a aplicação do pulso elétrico. Boas constantes de tempo para bactérias variam de 5-10 milissegundos. A decaída rápida indica alta concentração de sal, causando arco elétrico e morte celular. Monitorar a constante de tempo ajuda a prever se sua transformação terá sucesso antes de observar o crescimento da colônia.

Question 5

Como é que a eletroporação se compara à transformação por choque térmico?

Accepted Answer

O choque térmico usa cloreto de cálcio e exposição ao calor em vez de pulsos elétricos, tornando-o mais suave para bactérias e mais barato do que a eletroporação. No entanto, o choque térmico produz eficiências de transformação mais baixas, leva mais tempo e funciona apenas em bactérias, leveduras e protoplastos de plantas. A eletroporação alcança uma eficiência maior e se aplica a células de mamíferos através de um processo chamado transfecção.

Question 6

Quais etapas seguem a eletroporação para identificar bactérias transformadas com sucesso?

Accepted Answer

Após pulsar, adicione meio de recuperação às células e incube a 37°C por uma hora com agitação. Coloque as células em ágar contendo antibiótico e incube durante a noite a 37°C. Apenas as bactérias que incorporaram com sucesso o plasmídeo sobrevivem ao antibiótico. Conte as colônias resultantes e calcule a eficiência de transformação dividindo os transformantes bem-sucedidos pelo DNA total placado.

Question 7

Quais são as aplicações da eletroporação além da transformação bacteriana?

Accepted Answer

A eletreporaçao se aplica a células de mamíferos através da transfecção, usando intensidades de campo mais baixas e constantes de tempo mais altas do que células bacterianas. Os cientistas também usam eletreporaçao em organismos inteiros como embriões de galinha em desenvolvimento, injetando DNA plasmídeo no tecido cerebral e aplicando um campo elétrico. Isso permite a observação da expressão de proteína fluorescente e mudanças estruturais no tecido neural em desenvolvimento.

Transformação Bacteriana: Eletroporação - Questionário de avaliação