Microinjeção estereotáxica de vetores virais Expressando Cre Recombinase para estudar o papel de genes alvo em cocaína condicionado Lugar de Preferência

O objetivo geral deste procedimento é ablação seletiva de genes-alvo durante fases discretas do paradigma de preferência de local de condição para testar sua contribuição para esse comportamento ao longo do tempo. Isso é feito pela primeira micro injeção estereotáxica do vetor viral associado ao eno recombinante que expressa Cree recombinase. Em seguida, os camundongos podem se recuperar em sua gaiola doméstica por 10 a 14 dias para reativação máxima de C.

A terceira etapa do procedimento é testar os camundongos em preferência de local condicionada, incluindo as fases de extinção e reintegração da aquisição. A etapa final do procedimento é realizar um exame histológico de camundongos microinjetados para validar a colocação correta da microinjeção. Em última análise, podem ser obtidos resultados que mostram mudanças no comportamento de aquisição, extinção e/ou reintegração em resposta ao nocaute genético por meio de testes comportamentais de preferência de local de condição.

A principal vantagem desta técnica sobre os métodos existentes, como o sistema de acasalamento CRE lock P, é que ela permite um tempo mais específico e especificidade anatômica do nocaute do gene discretamente, permitindo a investigação da perda do gene em cada fase do comportamento. As implicações dessa técnica se estendem ao tratamento do comportamento viciante porque envolve uma melhor compreensão da base genética que pode estar subjacente a como a exposição a pistas contextuais pode desencadear memórias relacionadas à cocaína que podem levar ao desejo e à recaída em viciados. Para começar, coloque uma gaiola de rato com roupa de cama em uma trava de calor para aquecer para recuperação pós-operatória.

Configure um barbeador elétrico para raspar a cabeça e etanol e iodo para esterilizar o couro cabeludo. Use 70% de etanol para limpar as barras auriculares e segurar a boca dos ataques estéreo usando uma seringa Hamilton de cinco microlitros. Retire cinco microlitros de vetor viral e coloque-o em um suporte de seringa Nos ataques estéreo.

Coloque uma almofada de aquecimento de micro-ondas ou uma almofada elétrica nos ataques estéreo depois de injetar no mouse uma injeção IP de um coquetel de cetamina xilazina. De acordo com o protocolo de texto, faça um beliscão de cauda para verificar o nível de sedação. Em seguida, raspe a cabeça entre as orelhas e os olhos e use aplicadores de algodão estéreis para limpar a área com lavagens alternadas de etanol e iodo.

Em seguida, transfira o mouse para a almofada aquecida no estéreo ataca zero. A barra do dente e a barra da orelha escalam e colocam os dentes do mouse na barra do dente, aparafusam o focinho e as barras da orelha. Se qualquer movimento de movimento de movimento de movimento for notado.

Administre uma dose de reforço de cetamina xilazina coquetel. Em seguida, lubrifique os olhos para evitar que sequem. Em seguida, usando um corte de bisturi, abra o couro cabeludo logo atrás das orelhas.

Coloque clipes de buldogue nos cantos do couro cabeludo para remover a pele do crânio. Certificando-se de que Bgma e Lambda sejam facilmente visíveis. Certifique-se de que a sutura de bgma a Lambda esteja alinhada e reposicione a cabeça, se necessário.

Depois de confirmar que as configurações de ataque estéreo estão zeradas, coloque a ponta da agulha no lugar em bma. Meça as coordenadas dorsal, ventral, medial, medial lateral e ântero-posterior para BMA e lambda. Em seguida, ajuste a cabeça até que as coordenadas ventrais para BMA e lambda estejam dentro de 0,02 milímetros uma da outra.

Centralize a ponta da agulha no bgma e, a partir desse ponto, mova-se na direção ântero-posterior até a coordenada desejada. Em seguida, perfure um furo na coordenada desejada. Verificando se a agulha é capaz de entrar sem ser interrompida pelo crânio, abaixe a agulha até a coordenada ventral desejada.

Uma vez alcançada a coordenada, mergulhe 0,015 milímetros abaixo dela por cerca de 10 segundos para criar uma pequena bolsa para o vetor viral a uma taxa de aproximadamente 0,1 microlitros por minuto, injete o volume desejado de vetor viral após esperar três minutos para que o vetor viral se difunda, levante a ponta da agulha 0,015 milímetros e aguarde mais dois minutos. Quando as injeções estiverem completas, aplique cera óssea para selar os dois orifícios e, em seguida, suture o couro cabeludo. Finalmente, aplique o bloqueio nervoso na área ferida.

Remova o mouse dos ataques estéreo e coloque-o em uma gaiola quente em um bloco de calor para se recuperar por 45 minutos a uma hora. Deixe o mouse se recuperar por pelo menos 10 dias para permitir a reativação máxima. Dê ao animal água e amoleça a comida e a buprenorfina duas vezes ao dia, se necessário, para a dor após a recuperação, coloque os camundongos na câmara central de um aparelho de preferência de local de três câmaras por um 62º período de habituação com as portas da guilhotina fechadas.

Após a habituação, abra as portas da guilhotina e permita que os ratos explorem livremente as três câmaras por 1200 segundos. Use o software Med PC four para registrar o tempo gasto pelo animal em cada câmara usando as diretrizes do protocolo de texto. Atribua os camundongos a câmaras de condicionamento com base em seu desempenho durante o pré-teste.

Durante os próximos três dias, injete 10 miligramas por quilograma de cocaína durante uma sessão matinal e combine-os imediatamente na câmara designada por 1200 segundos. Retorne os ratos às gaiolas de suas casas por quatro horas, depois injete-os com solução salina e confine imediatamente os ratos na câmara oposta por 1200 segundos. Para testar a aquisição, coloque os camundongos na câmara central com as portas da guilhotina fechadas por um 62º período de habituação.

Abra as portas da guilhotina e permita a exploração livre por 1200 segundos ou gravação. O tempo gasto em todas as câmaras calcula a preferência subtraindo a quantidade de tempo gasto na câmara do par salino da quantidade de tempo gasto na câmara do par de cocaína. Depois de realizar o CPP em camundongos microinjetados, considera-se que eles adquiriram preferência por uma câmara específica.

Quando a preferência por cocaína é definida como o tempo gasto na câmara do par de cocaína menos o tempo gasto na câmara do par salino é significativamente maior em comparação com a pontuação de preferência basal. Se, como controle de coorte, os camundongos injetados não mostrarem preferência pela câmara ou show do par de cocaína, uma colocação de aversão é verificada imediatamente por histologia, e os camundongos com colocação incorreta são eliminados do estudo. Se a preferência é normalmente adquirida pela coorte injetada de controle, o paradigma é estendido pelo início da extinção.

Considera-se que os camundongos extinguiram a preferência induzida pela droga por uma câmara específica. Quando a preferência por cocaína em dois dias consecutivos de extinção é significativamente menor em comparação com a pontuação de preferência de aquisição neste momento, pode-se restabelecer com uma droga prime. Se a pontuação de preferência após a administração do medicamento prime for estatisticamente indistinguível daquela na aquisição, diz-se que essa coorte restabeleceu a preferência induzida pelo medicamento pela câmara pareada do medicamento usando PCR quantitativo.

Esta figura demonstra que o gene de interesse foi de fato nocauteado em camundongos microinjetados após microinjeção de RAAV Cree GFP no núcleo accumbens que possuem a isoforma do canal de cálcio tipo L, bandos CAV 1.2 de RAAV. Os punções injetados com Cree mostram uma diminuição significativa na expressão gênica em comparação com os camundongos injetados com A-A-V-G-F-P mostrados aqui. A análise imuno-histoquímica do núcleo accumbens para GFP revela a colocação bilateral adequada de RAAV Cree microinjetado após este procedimento.

Outras técnicas, como PCR quantitativo em tempo real e Western bodying, podem ser realizadas para responder a perguntas sobre o efeito do knockdown de um gene nos níveis de expressão de outros genes de interesse. Depois de assistir a este vídeo, você deve ter uma melhor compreensão de como ablação seletiva de genes-alvo no cérebro de camundongos usando vetores virais de microinjeção estereotáxica para testar seletivamente o papel desses genes na extinção de aquisição e restabelecimento do paradigma de preferência de lugar de condição.