2.8: O Método ELISA

O ELISA, ou ensaio imunoenzimático, é um método amplamente utilizado para determinar a presença ou ausência de uma proteína-alvo específica.

Por meio de uma série de etapas de lavagem e ligação, um anticorpo conjugado ou ligado a uma enzima reconhecerá uma proteína-alvo no fundo de uma placa de 96 poços. Quando o substrato é adicionado à amostra, ocorrerá uma reação enzimática, causando uma mudança de cor que permite a identificação e quantificação da proteína alvo.

Antes de discutirmos como realizar um ELISA, vamos nos familiarizar com os equipamentos e reagentes necessários.

A configuração para uma reação ELISA é normalmente uma placa de fundo plano de 96 poços. Os fundos planos dos poços ajudarão a facilitar uma distribuição uniforme de sua amostra experimental, bem como de seus anticorpos de captura e detecção.

Os ELISAs detectam a presença de proteínas-alvo específicas em soluções aquosas experimentais. Urina, meios de cultura celular e soro são amostras experimentais comuns.

Em um ELISA, o anticorpo que se liga diretamente à proteína alvo é o anticorpo primário. Possui alta afinidade, ou seja, alta capacidade de se ligar firmemente, para um epítopo - uma região específica - da proteína alvo. O anticorpo primário geralmente não é marcado ou não conjugado.

Como mencionado, os anticorpos se ligam principalmente às suas proteínas-alvo por meio da ligação de alta afinidade a um epítopo específico. No entanto, a amostra experimental pode conter pedaços de células que expressam locais de ligação inespecíficos, locais que podem se ligar à região constante ou não específica do epítopo de seus anticorpos detectores.

Portanto, a adição de um tampão de bloqueio é essencial em um ELISA para cobrir quaisquer locais de ligação inespecíficos em suas amostras experimentais. Caso contrário, você pode ter reações enzimáticas ocorrendo em poços que não contêm proteína-alvo, fornecendo dados falsos positivos!

O anticorpo secundário em um ELISA é o anticorpo usado para reconhecer o anticorpo primário. Este anticorpo é geralmente conjugado a uma enzima. Às vezes, o anticorpo secundário tem um nome estranho. Por exemplo, se o anticorpo secundário feito ou criado em um burro para reconhecer um anticorpo primário criado em uma cabra, o anticorpo secundário seria chamado de anticorpo anti-cabra de burro. Quando se trata de nomear anticorpos secundários, o primeiro nome indica o organismo que produziu o anticorpo secundário e o segundo nome representa o organismo que produz o anticorpo primário.

Um substrato, que se liga ao sítio ativo da enzima ligada ao anticorpo secundário, também será necessário. A reação química que ocorre durante essa reação causa uma mudança de cor no substrato incolor. Este chamado ensaio colorimétrico permite a identificação e quantificação da presença da proteína alvo.

A reação enzimática continuará enquanto houver substrato disponível. Portanto, após um breve período de incubação, uma solução de parada, que causa mais uma mudança de cor para indicar que a reação foi de fato interrompida, é adicionada aos poços.

Um leitor de microplacas será utilizado para quantificar a concentração da proteína de interesse em cada poço por meio da leitura da absorbância, ou seja, a quantidade de produto colorido, em cada poço. A absorbância é proporcional à quantidade de proteína alvo presente.

Agora que você tem todo o seu equipamento pronto, vamos executar um ELISA!

Para realizar um ELISA padrão ou direto, primeiro cubra os poços da placa de 96 poços com a proteína-alvo de interesse diluída no tampão de revestimento. Coloque seus controles positivos e negativos neste momento também.

Depois de incubar a placa revestida por tempo suficiente para dar tempo à proteína para adsorver completamente ou se fixar no fundo da placa, despeje o excesso de solução de revestimento com um movimento rápido do pulso.

Em seguida, bloqueie qualquer possível ligação não específica ou sinal de fundo, incubando cada poço no buffer de bloqueio.

Agora despeje o tampão de bloqueio e lave os poços com uma breve incubação à temperatura ambiente em solução salina tamponada com fosfato, ou PBS, e 1% de BSA.

Enquanto os poços estão sendo enxaguados com PBS, prepare diluições de uma concentração conhecida da proteína alvo para criar uma curva padrão. A absorbância dos poços de curva padrão, que contêm concentrações conhecidas da proteína alvo, será usada para calcular a concentração de proteína-alvo em seus poços de amostra experimentais com base em uma comparação da absorbância dos poços de amostra com a absorbância dos poços de curva padrão.

Agora é hora de adicionar a detecção ou anticorpo primário!

A placa é então incubada, geralmente à temperatura ambiente, para permitir que uma quantidade suficiente de anticorpos se ligue à proteína-alvo para posterior detecção e quantificação da proteína.

Após essa incubação, o excesso de anticorpos é removido e os poços são lavados brevemente com PBS.

O anticorpo secundário é então adicionado à placa e a placa é novamente incubada ? normalmente em uma plataforma giratória ? para permitir que o anticorpo secundário se ligue. As etapas de lavagem são repetidas como antes.

Em seguida, adicione o substrato à placa para ver quais poços contêm sua proteína-alvo. Cubra a placa para proteger a reação da luz e, após uma breve incubação, interrompa a reação com a solução de parada.

Por fim, coloque sua placa no leitor de microplacas para medir a absorbância ou quantidade de solução colorida, em cada poço. Você precisará selecionar quais poços deseja que o leitor analise. Quando o instrumento terminar de ler a placa, uma leitura da absorbância para cada poço será exibida.

É importante observar que cada kit ELISA tem um limite de detecção. Ou seja, apenas concentrações de proteína acima e abaixo de limites específicos podem ser determinadas com precisão. Concentrações muito pequenas de proteína geralmente estão muito próximas dos níveis de fundo de coloração inespecífica, enquanto concentrações muito altas podem indicar que o excesso de proteína ou anticorpo não foi devidamente lavado naquele poço de amostra.

Então, por que você pode realizar um ELISA? Vamos dar uma olhada em algumas aplicações comuns.

Provavelmente, o tipo mais comum de ELISA realizado é o ELISA sanduíche.

Em um ELISA sanduíche, uma placa de 96 poços é revestida primeiro com um anticorpo primário que reconhece a proteína alvo de interesse.

Neste experimento, os meios de cultura de células colhidos de linhagens celulares produtoras de anticorpos humanos foram plaqueados por um sistema automatizado em placas de 96 poços pré-revestidas com um anticorpo primário que reconhece anticorpos humanos.

Depois de lavar o excesso de amostra com PBS, um anticorpo secundário ligado a enzima é adicionado, seguido por um substrato colorimétrico.

A absorbância é então medida da mesma forma que para um ELISA típico. Por exemplo, neste experimento, esses dados ELISA serão usados para determinar quais linhas celulares produzem o anticorpo humano com maior afinidade por ? que é a melhor capacidade de ligar com precisão a ? seu antígeno alvo.

O teste de gravidez de venda livre é um tipo de ELISA sanduíche.

Quando a urina da mulher potencialmente grávida é adicionada ao teste, os anticorpos primários ligados à enzima ligados ao teste se ligam ao hormônio da gravidez hCG, se estiver presente. Se a mulher estiver grávida, uma reação de enyzme de substrato ocorrerá quando os anticorpos primários forem reconhecidos por anticorpos secundários ligados ao substrato no local de teste e uma linha colorida aparecerá.

Outro tipo de ELISA é o ELISA competitivo, que pode ser usado para detectar a presença de anticorpos.

Se os anticorpos de interesse estiverem presentes na amostra, eles se ligarão à proteína alvo presa ao fundo da placa. Mais tarde, quando os anticorpos de detecção ligados à enzima são adicionados à placa, os anticorpos ligados à enzima encontrarão poucas ou nenhuma proteína para se ligar; eles terão sido "superados" pelos anticorpos de interesse na amostra experimental.

Em um ELISA competitivo, então, os poços coloridos indicam as amostras que realmente não contêm o anticorpo de interesse! As amostras de plasma do paciente são normalmente executadas em um ELISA competitivo para determinar se os anticorpos para certos patógenos, como o vírus HIV, estão presentes na amostra.

Você acabou de assistir JoVE introdução à realização de um ELISA. Neste vídeo, revisamos: o que é um ELISA e como funciona; quais equipamentos e reagentes você precisará realizar e ELISA; e algumas aplicações diferentes do ensaio. Obrigado por assistir e lembre-se de não deixar seu substrato se desenvolver demais!