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Basic Methods in Cellular and Molecular Biology

O Método ELISA

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JoVE Science Education Basic Methods in Cellular and Molecular Biology

The ELISA Method

2.7: Bacterial Transformation: Electroporation

2.9: Plasmid Purification

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10:06 min

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April 30, 2023

Overview

Um ensaio imunossorbente ligado à enzima (ELISA) é normalmente realizado para detectar a presença e/ou quantidade de uma proteína alvo de interesse dentro de uma amostra experimental. A detecção da proteína alvo é possível por anticorpos, que fazem do ELISA um imunoensaio. Através de uma série de etapas de incubação e lavagem, esses anticorpos, que são frequentemente ligados, ou conjugados, a uma enzima, detectarão o revestimento de proteínas na parte inferior de um poço em uma placa de microtráde. Quando exposta a um substrato, a enzima ligada a anticorpos causará uma mudança de cor, indicando assim a presença da proteína de interesse na amostra.

Neste vídeo, explica-se a teoria por trás de como as ELISAs funcionam, incluindo uma discussão sobre a ligação de anticorpos primários e secundários e a importância de bloquear etapas. A teoria é seguida pela prática, à medida que o vídeo progride para uma explicação do procedimento passo a passo. Finalmente, são introduzidas variações do ELISA padrão, como o sanduíche e os ELISAs competitivos, e as aplicações do mundo real deste método, como em testes de gravidez sem prescrição médica, são explicadas.

Procedure

O ensaio elisa, ou ensaio imunossorbente ligado à enzima, é um método amplamente utilizado para determinar a presença ou ausência de uma proteína alvo específica.

Através de uma série de etapas de lavagem e ligação, um anticorpo conjugado, ou ligado, a uma enzima reconhecerá uma proteína alvo na parte inferior de uma placa de 96 poços. Quando o substrato é adicionado à amostra, ocorrerá uma reação enzimática, causando uma mudança de cor que permite a identificação e quantificação da proteína alvo.

Antes de discutirmos como realizar um ELISA, vamos nos familiarizar com os equipamentos e reagentes que você vai precisar.

O ajuste para uma reação ELISA é tipicamente uma placa inferior plana de 96 poços. As partes inferiores planas dos poços ajudarão a facilitar uma distribuição uniforme de sua amostra experimental, bem como seus anticorpos de captura e detecção.

Os ELISAs detectam a presença de proteínas-alvo específicas em soluções aquosas experimentais. Urina, mídia de cultura celular e soro são amostras experimentais comuns.

Em um ELISA, o anticorpo que se liga diretamente à proteína alvo é o anticorpo primário. Tem alta afinidade, ou seja, uma alta capacidade de se ligar firmemente, para um epítope – uma região específica – da proteína alvo. O anticorpo primário geralmente não é rotulado, ou não conjugado.

Como mencionado, os anticorpos se ligam principalmente às suas proteínas-alvo através de alta afinidade ligando-se a um epítope específico. No entanto, a amostra experimental pode conter pedaços de células que expressam locais de ligação não específicos, locais que podem ligar a região específica ou não-epitope específica de seus anticorpos detectores.

Portanto, a adição de um buffer de bloqueio é essencial em um ELISA para cobrir quaisquer locais de ligação não específicos em suas amostras experimentais. Caso contrário, você pode ter reações enzimáticas ocorrendo em poços que não contêm proteína alvo, dando-lhe dados falsos positivos!

O anticorpo secundário em um ELISA é o anticorpo usado para reconhecer o anticorpo primário. Este anticorpo é geralmente conjugado a uma enzima. Às vezes, o anticorpo secundário tem um nome funky. Por exemplo, se o anticorpo secundário feito, ou criado, em um burro para reconhecer um anticorpo primário criado em uma cabra, o anticorpo secundário seria chamado de anticorpo anti-cabra burro. Quando se trata de nomear anticorpos secundários, o primeiro nome indica o organismo que produziu o anticorpo secundário, e o segundo nome representa o organismo que produz o anticorpo primário.

Um substrato, que se liga ao local ativo da enzima ligada ao anticorpo secundário, também será necessário. A reação química que ocorre durante esta reação causa uma mudança de cor no substrato incolor de outra forma. Este chamado ensaio colorimétrico permite a identificação e quantificação da presença da proteína alvo.

A reação enzimática continuará enquanto houver substrato disponível. Portanto, após um breve período de incubação, uma solução de parada, que faz com que outra mudança de cor indique que a reação foi de fato interrompida, é adicionada aos poços.

Um leitor de microplacão será usado para quantificar a concentração da proteína de interesse em cada poço lendo a absorvância, ou seja, a quantidade de produto colorido, em cada poço. A absorvância é proporcional à quantidade de proteína alvo presente.

Agora que você tem todo o seu equipamento pronto, vamos executar um ELISA!

Para executar um padrão, ou direto, ELISA, primeiro cubra os poços da placa de 96 poços com sua proteína alvo de interesse diluída no tampão de revestimento. Emplaque seus controles positivos e negativos neste momento também.

Depois de incubar a placa revestida tempo suficiente para dar tempo à proteína para adsorb completamente, ou anexar, na parte inferior da placa, despeje a solução de revestimento em excesso com um movimento rápido do seu pulso.

Em seguida, bloqueie qualquer possível sinal de ligação ou fundo não específico incubando cada poço no buffer de bloqueio.

Agora despeje o tampão de bloqueio e lave os poços com uma breve incubação de temperatura ambiente em salina tamponada de fosfato, ou PBS, e 1% BSA.

Enquanto os poços estão sendo enxaguados com PBS, preparem diluições de uma concentração conhecida da proteína alvo para criar uma curva padrão. A absorção dos poços de curva padrão, que contêm concentrações conhecidas da proteína alvo, será usada para calcular a concentração de proteína-alvo em seus poços experimentais baseados na comparação da absorção dos poços amostrais com a absorção dos poços de curva padrão.

Agora é hora de adicionar a detecção ou anticorpo primário!

A placa é então incubada, geralmente à temperatura ambiente, para permitir que uma quantidade suficiente de anticorpos se ligue à proteína alvo para detecção posterior e quantificação da proteína.

Após esta incubação, o excesso de anticorpos é removido e os poços são brevemente lavados com PBS.

O anticorpo secundário é então adicionado à placa, e a placa é novamente incubada – tipicamente em uma plataforma rotativa – para permitir que o anticorpo secundário se ligue. As etapas de lavagem são repetidas como antes.

Em seguida, adicione o substrato à placa para ver quais poços contêm sua proteína alvo. Cubra a placa para proteger a reação da luz e, em seguida, após uma breve incubação, pare a reação com a solução stop.

Por fim, coloque sua placa no leitor de microplacões para medir a absorção ou quantidade de solução colorida, em cada poço. Você precisará selecionar quais poços você deseja que o leitor analise. Quando o instrumento terminar de ler a placa, será exibida uma leitura da absorvência de cada poço.

É importante notar que cada kit ELISA tem um limite de detecção. Ou seja, apenas concentrações proteicas acima e abaixo de limites específicos podem ser determinadas com precisão. Concentrações muito pequenas de proteína geralmente são muito próximas dos níveis de fundo de coloração não específica, enquanto concentrações muito altas podem indicar que o excesso de proteína ou anticorpo não foi adequadamente lavado nessa amostra bem.

Então por que você pode fazer um ELISA? Vamos dar uma olhada em algumas aplicações comuns.

Provavelmente o tipo mais comum de ELISA realizado é o sanduíche ELISA.

Em um sanduíche ELISA, um prato de 96 poços é revestido primeiro com um anticorpo primário que reconhece a proteína alvo de interesse.

Neste experimento, a mídia de cultura celular colhida a partir de linhas celulares produtoras de anticorpos humanos, foram banhadas por um sistema automatizado em placas de 96 poços pré-revestidas com um anticorpo primário que reconhece anticorpos humanos.

Após lavar a amostra em excesso com PBS, um anticorpo secundário ligado à enzima é adicionado, seguido por um substrato colorimétrico.

A absorvância é então medida da mesma forma que para um ELISA típico. Por exemplo, neste experimento, esses dados ELISA serão usados para determinar quais linhas celulares produzem o anticorpo humano com maior afinidade – que é a melhor capacidade de se ligar com precisão – seu antígeno alvo.

O teste de gravidez sem prescrição é um tipo de sanduíche ELISA.

Quando a urina da mulher potencialmente grávida é adicionada ao teste, anticorpos primários ligados à enzima ligados ao teste ligarão o hormônio da gravidez hCG se ele estiver presente. Se a mulher estiver grávida, uma reação substrato-enyzme ocorrerá quando os anticorpos primários forem reconhecidos por anticorpos secundários ligados a substratos no local de teste, e uma linha colorida aparecerá.

Outro tipo de ELISA é a ELISA competitiva, que pode ser usada para detectar a presença de anticorpos.

Se os anticorpos de interesse estiverem presentes na amostra, eles se ligarão à proteína alvo anexada ao fundo da placa. Mais tarde, quando os anticorpos de detecção ligados à enzima forem adicionados à placa, os anticorpos ligados à enzima encontrarão poucas ou nenhuma proteína para se ligar; eles terão sido “superados” pelos anticorpos de interesse na amostra experimental.

Em um ELISA competitivo, então, os poços coloridos indicam as amostras que realmente não contêm o anticorpo de interesse! As amostras de plasma do paciente são tipicamente executadas em um ELISA competitivo, a fim de determinar se anticorpos para certos patógenos, como o vírus HIV, estão presentes na amostra.

Você acabou de assistir jove introdução para executar um ELISA. Neste vídeo revisamos: o que é um ELISA e como funciona; quais equipamentos e reagentes você precisará realizar e ELISA; e algumas aplicações diferentes do ensaio. Obrigado por assistir, e lembre-se de não deixar seu substrato se sobresenvolvir!

Transcript

The ELISA, or enzyme-linked immunosorbent assay, is a widely used method for determining the presence or absence of a specific target protein.

Via a series of washing and binding steps, an antibody conjugated, or linked, to an enzyme will recognize a target protein at the bottom of a 96-well plate. When substrate is added to the sample, an enzymatic reaction will occur, causing a color change that allows the identification and quantification of the target protein.

Before we discuss how to perform an ELISA, let’s get familiar with the equipment and reagents that you will need.

The setting for an ELISA reaction is typically a 96-well flat bottom plate. The flat bottoms of the wells will help facilitate an even distribution of your experimental sample, as well as your capture and detection antibodies.

ELISAs detect the presence of specific target proteins in experimental aqueous solutions. Urine, cell culture media, and serum are common experimental samples.

In an ELISA, the antibody that directly binds to the target protein is the primary antibody. It has high affinity, that is, a high ability to bind tightly, for an epitope – a specific region – of the target protein. The primary antibody is usually unlabeled, or un-conjugated.

As mentioned, antibodies mostly bind to their target proteins through high affinity binding to a specific epitope. However, the experimental sample may contain pieces of cells that express nonspecific binding sites, sites that can bind the constant, or non-epitope specific, region of your detector antibodies.

Therefore, addition of a blocking buffer is essential in an ELISA to cover any nonspecific binding sites in your experimental samples. Otherwise you may have enzymatic reactions occurring in wells that do not contain target protein, giving you false positive data!

The secondary antibody in an ELISA is the antibody used to recognize the primary antibody. This antibody is usually conjugated to an enzyme. Sometimes the secondary antibody has a funky name. For example, if the secondary antibody made, or raised, in a donkey to recognize a primary antibody raised in a goat, the secondary antibody would be called a donkey anti-goat antibody. When it comes to naming secondary antibodies, the first name indicates the organism that produced the secondary antibody, and the second name represents the organism that produces the primary antibody.

A substrate, which binds to the active site of the enzyme linked to the secondary antibody, will also be needed. The chemical reaction that occurs during this reaction causes a color change in the otherwise-colorless substrate. This so-called colorimetric assay allows the identification and quantification of the presence of the target protein.

The enzymatic reaction will continue as long as there is available substrate. Therefore, after a brief incubation period, a stop solution, which causes yet another color change to indicate the reaction has in fact been halted, is added to the wells.

A microplate reader will be used to quantify the concentration of the protein of interest in each well by reading the absorbance, that is, the amount of colored product, in each well. The absorbance is proportional to the amount of target protein present.

Now that you have all your equipment ready, let’s run an ELISA!

To perform a standard, or direct, ELISA, first coat the wells of the 96-well plate with your target protein of interest diluted in coating buffer. Plate your positive and negative controls at this time as well.

After incubating the coated plate long enough to give the protein time to completely adsorb, or attach, to the bottom of the plate, dump off the excess coating solution with a quick flick of your wrist.

Then block any possible non-specific binding or background signal by incubating each well in blocking buffer.

Now dump off the blocking buffer and wash the wells with a brief room temperature incubation in phosphate buffered saline, or PBS, and 1% BSA.

While the wells are being rinsed with PBS, prepare dilutions of a known concentration of the target protein to create a standard curve. The absorbance of the standard curve wells, which contain known concentrations of the target protein, will be used to calculate the concentration of target protein in your experimental sample wells based on a comparison of the absorbance of the sample wells to the absorbance of the standard curve wells.

Now it’s time to add the detection or primary antibody!

The plate is then incubated, usually at room temperature, to allow a sufficient amount of antibody to bind to the target protein for later detection and quantification of the protein.

After this incubation, excess antibody is removed and the wells are briefly washed with PBS.

Secondary antibody is then added to the plate, and the plate is once again incubated – typically on a rotating platform – to allow secondary antibody to bind. Washing steps are repeated as before.

Next, add the substrate to the plate to see which wells contain your target protein. Cover the plate to protect the reaction from light, and then after a brief incubation, halt the reaction with stop solution.

Finally, place your plate in the microplate reader to measure the absorbance or amount of colored solution, in each well. You will need to select which wells you want the reader to analyze. When the instrument is finished reading the plate, a readout of the absorbance for each well will be displayed.

It is important to note that each ELISA kit has a detection limit. That is, only protein concentrations above and below specific limits can be accurately determined. Very small concentrations of protein are usually too close to the background levels of non-specific staining, while very high concentrations may indicate that excess protein or antibody was not properly washed away in that sample well.

So why might you perform an ELISA? Let’s take a look at a few common applications.

Probably the most common type of ELISA performed is the sandwich ELISA.

In a sandwich ELISA, a 96-well plate is coated first with a primary antibody that recognizes the target protein of interest.

In this experiment, cell culture media harvested from human antibody-producing cell lines, were plated by an automated system onto 96-well plates pre-coated with a primary antibody that recognizes human antibodies.

After washing away the excess sample with PBS, an enzyme-linked secondary antibody is added, followed by a colorimetric substrate.

The absorbance is then measured in the same way as for a typical ELISA. For example, in this experiment, this ELISA data will be used to determine which cell lines produce the human antibody with the highest affinity for – that is best ability to bind accurately to – its target antigen.

The over-the-counter pregnancy test is one type of sandwich ELISA.

When the potentially pregnant woman’s urine is added to the test, enzyme-linked primary antibodies attached to the test will bind the pregnancy hormone hCG if it is present. If the woman is pregnant, a substrate-enyzme reaction will occur when the primary antibodies are recognized by substrate-bound secondary antibodies at the test site, and a colored line will appear.

Another type of ELISA is the competitive ELISA, which can be used to detect the presence of antibodies.

If the antibodies of interest are present in the sample, they will bind to the target protein attached to the bottom of the plate. Later, when enzyme-linked detection antibodies are added to the plate, the enzyme-linked antibodies will find few to no proteins to bind; they will have been “out-competed” by the antibodies of interest in the experimental sample.

In a competitive ELISA, then, the colored wells indicate the samples that actually do not contain the antibody of interest! Patient plasma samples are typically run in a competitive ELISA in order to determine if antibodies for certain pathogens, like the HIV virus, are present in the sample.

You’ve just watched JoVE introduction to performing an ELISA. In this video we reviewed: what an ELISA is and how it works; what equipment and reagents you will need to perform and ELISA; and some different applications of the assay. Thanks for watching, and remember not to let your substrate overdevelop!