Isolamento de primárias Miofibroblastos de Mouse e tecido do cólon humano

O objetivo geral deste procedimento é isolar miofibroblastos primários do tecido do cólon de camundongos ou humanos. Isso é feito colhendo primeiro o cólon do camundongo doador e enxaguando-o com PBS gelado. Em seguida, as células epiteliais são desnudadas por meio de uma série de lavagens e tratamentos enzimáticos.

Em seguida, a suspensão de células epiteliais é plaqueada em placas de cultura de tecidos e deixada incubar. Finalmente, as células não aderentes são lavadas para isolar os miofibroblastos. Em última análise, podem ser obtidos resultados que mostram o isolamento de células miofibroblásticas primárias por meio de coloração imuno-histoquímica, Demonstrando o procedimento estará compartilhando, yay, um técnico do meu laboratório.

Todos os experimentos foram aprovados pelo Escritório de Supervisão de Pesquisa Animal da Universidade da Califórnia usando um camundongo que foi sacrificado com flúor inalatório, seguido de luxação cervical. Comece fazendo uma incisão na linha média ventral. Retraia o intestino e localize o cólon, retraia a bexiga lateralmente e identifique o osso púbico usando uma tesoura fina.

Corte o osso para expor o reto, disseque a medula dorsal do reto e do cólon e imobilize o cólon do ânus ao ceco. Em seguida, faça uma transecção para desconectar o cólon do intestino delgado. Coloque a amostra em PBS gelado.

Depois de encher uma seringa de 10 cc com gelo frio, o PBS lava o lúmen do cólon várias vezes para limpar seu conteúdo. Em seguida, use uma tesoura para abrir o cólon longitudinalmente e coloque-o em um tubo cônico de 50 mililitros contendo 20 mililitros de gelo frio. O PBS continua a substituir o PBS até que o fluido esteja limpo, sem material particulado.

Um protocolo para obter tecido humano de pacientes cirúrgicos, incluindo a obtenção de consentimento informado por escrito dos pacientes antes da cirurgia, foi aprovado pelo escritório do Programa de Proteção à Pesquisa Humana da Universidade da Califórnia. Obtenha uma seção de meia polegada de espessura total da parede do cólon de uma ressecção do cólon realizada usando procedimentos padrão e coloque-a imediatamente em PBS gelado. Remova todos os apêndices mediáticos e epiloicos do cólon.

Como a presença de gordura afetará o processo de digestão, coloque todo o cólon do camundongo em um tubo cônico de 50 mililitros com 25 mililitros de EDTA de cinco milimolares em HBSS e incube-o em um banho de ar agitado a 37 graus Celsius por 15 minutos. Despeje cuidadosamente a solução e repita os relógios um total de cinco vezes. Para processar o tecido humano.

Use uma tesoura para cortá-lo em quatro pedaços de tamanhos iguais e coloque dois pedaços em cada um dos dois tubos de 50 mililitros contendo 25 mililitros de EDTA de cinco milimolares em HBSS. Lave o tecido cinco vezes demonstrou para as amostras de camundongos. Em seguida, lave brevemente o camundongo e os tecidos humanos em 20 mililitros de PBS gelado duas vezes.

Em seguida, transfira os tecidos para novos tubos de 50 mililitros contendo 20 mililitros de RPMI cinco e 10 unidades de pasta de disco e 2000 unidades de colagenase para o tecido de camundongo, ou 20 unidades de dise e 4.000 unidades de colagenase D para o tecido humano. Coloque o tubo em pé em um banho de ar agitado a 37 graus Celsius e agite a 250 RPM por até 60 minutos ou até que o tecido comece a parecer pegajoso. Agite os tubos duas a quatro vezes para quebrar o tecido.

Em seguida, esfole as amostras a 200 Gs a quatro graus Celsius por cinco minutos para isolar e cultivar miofibroblastos. Depois de despejar o sobrenadante do tecido digerido, resus, suspenda cada pellet em 10 mililitros de cloreto de amônio frio e potássio ou um tampão de lise CK e, em seguida, centrifugue a quatro graus Celsius e 200 Gs por cinco minutos. Depois de descartar o sobrenadante, use uma pipeta para ressuspender cada pellet em 10 mililitros de RPMI cinco.

Usando uma pipeta de 10 mililitros, passe metade das suspensões celulares através de um filtro de malha de 70 micrômetros em placas tratadas com TC de 100 milímetros. Adicione mais 15 mililitros de RPMI cinco a cada prato. Coe as suspensões restantes de cinco mililitros em pratos separados tratados com TC.

Incube as amostras em uma incubadora de dióxido de carbono a 10% a 37 graus Celsius por três horas. Em seguida, lave as culturas duas vezes com HBSS para remover as células não aderentes e adicione RPMI cinco fresco. As células aderentes são compostas por células epiteliais, macrófagos e miofibroblastos.

Uma semana após a semeadura, apenas os miofibroblastos se dividem, enquanto os macrófagos e as células epiteliais se dividem. Após a primeira passagem para a passagem, as células tripsina os olham e os dividem em dois para um. Uma vez isolados, os miofibroblastos humanos primários podem ser cultivados em cultura de células e usados por até quatro passagens.

Como mostrado aqui. As células são caracterizadas como actina de músculo liso alfa e fermentação positiva e desmina negativa. Consistente com os miofibroblastos subepiteliais intestinais, eles também têm uma morfologia estrelada característica.

Os miofibroblastos primários podem ser usados para confirmar os achados experimentais identificados em uma linhagem celular. Por exemplo, exposição de 18 células co à citocina pró-inflamatória. O TNF alfa levou a um aumento dependente do tempo na expressão do receptor EGF.

Isso se correlacionou com o aumento da expressão de COX dois induzida por EGF e fosforilação de P 42 44 MA quinase. Para validar essas descobertas experimentais. Os experimentos foram repetidos usando miofibroblastos humanos primários, isolados de cólon ressecado cirurgicamente de pacientes com câncer colorretal.

Esses números mostram que os miofibroblastos humanos primários imitam de perto os achados experimentais inicialmente identificados no alinhamento da linha celular 18 co. Depois de assistir a este vídeo, você deve ter uma boa compreensão de como isolar miofibroblastos primários do tecido do cólon de camundongos ou humanos.