Name: Permeabilização de células aderidas Usando um gás inerte Jet (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-09-04T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 21 s
Description: Aprenda a permeabilizar células aderentes usando jato de gás inerte para transferência eficiente de biomoléculas em células mamíferas. Este método oferece permeação espacialmente restrita com alta viabilidade celular.

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Os autores gostariam de agradecer às seguintes fontes de financiamento: Canadian Institutes of Health Research (CIHR), as ciências naturais e do Conselho de Pesquisa de Engenharia (NSERC).

1. Desenvolvimento do Programa LabView <ol><li> Um controlador de fluxo de massa (MKS M100B Massa-Flo Controller) está ligado à linha de gás de hélio para assegurar uma taxa de fluxo de gás precisa. Este aparelho é controlado por uma tensão de entrada, que varia entre 0 e 5 V. Um circuito de controle no programa LabView determina a tensão necessária num dado momento. A interface entre o computador eo controlador de fluxo de massa é realizada por um dispositivo de aquisição de dados (NI USB-6009), e uma fonte de alimentação de 12 V fornece energia para o controlador de fluxo de massa. </li><li> Duas corrediças posicionamento lineares são utilizados para controlar o movimento da placa de 6 cavidades, uma para cada sentido. Cada conjunto é constituído por uma série MA15-Velmex montagem UniSlide acoplado com um motor passo a passo, e os dois conjuntos são controlados por um único Velmex VXM Intensificação do controlador do motor. O controlador permite movimentar-se o manual de cada motor ou aceita uma seqüência de comandos seriais externos, a combinação de que permitir o movimento específico patterns. Vários padrões podem ser programados para o programa LabView, exigindo que o usuário forneça apenas a velocidade da tocha desejada, bem como as dimensões de caminho. </li></ol> 2. Preparação do Equipamento <ol><li> Abra tanto o cilindro de hélio e regulador. </li><li> Ligue o controlador do motor. </li><li> Abra o programa LabView e verificar todas as condições. </li><li> Certifique-se de que a plataforma está centrado. Para verificar, olhar para cada fase do motor e verificar que cada carro não está perto de uma das extremidades palco. Ou que o centro do programa de carruagens ou ajustar manualmente usando os controles de corrida na parte da frente do controlador de motor. </li><li> Se esta é a primeira corrida do dia, recomenda-se executar o programa de uma vez, sem células, para garantir a configuração está funcionando corretamente. </li></ol> 3. Preparação do Gás Jet Capilar Bico Altura <ol><li> Retire o capilar do suporte e zerar o mostrador altura. </li><li> Coloque o 6 bem-placa on da plataforma. </li><li> Substituir e reduzir o capilar jato de gás para o fundo do poço até atingir o lamínula. Prenda o capilar no suporte. </li><li> Utilização do selector de altura, elevar o capilar 3 mm. Marque esta altura na base capilar. </li><li> Elevar o capilar a uma altura segura e, em seguida, retire a placa de 6 poços. </li></ol> 4. Celular Permeabilização Protocolo <ol><li> Cultura linha de células aderentes até à confluência na tampa de vidro desliza numa placa de 6 poços, utilizando técnicas de cultura Standard. Para as células HeLa, de sementes de placas de 6 poços, com 2 x 10 5 células por poço e incubar durante 48 horas antes do tratamento. </li><li> Prepare o volume apropriado de solução contendo o vector desejado. Para hrGFPII-1, uma concentração de 50 ng / mL em 1x PBS fornece um forte sinal de fluorescência em células HeLa de 24 horas após a transfecção. Para os estudos de dextrano, é recomendado de 80 ug / ml de 10 kDa dextrano fluorescente verde. A partir de agora, esta solução vai ser encaminhado para um&quot;solução vetor&quot; s. </li><li> Remova a mídia de cultura de células de bem e lavar três vezes com PBS 1x. </li><li> Pipetar 1,370 ml de solução vetor preparados no passo 4.2 em bem. Isto deve resultar em uma profundidade de líquido de aproximadamente 1,3 mm. </li><li> Coloque o recipiente contendo a solução de vector no centro da plataforma. Abaixe o bico de jato de gás para o nível previamente marcado indicando uma altura do bocal de 3 mm acima do slide. </li><li> Ajustar a taxa de fluxo de hélio no programa Labview e seleccionar o padrão de movimento desejado para ser utilizado. Selecione &quot;Executar&quot; quando estiver pronto para iniciar o protocolo de permeabilização. Haverá um período de atraso inicial durante o qual o controlador de fluxo de massa se prepara para proporcionar a taxa de fluxo necessária. Uma vez que a taxa de fluxo apropriada tiver sido atingido, o programa LabView irá activar os motores passo a passo para mover a bem no padrão desejado permeabilização. Uma vez que a plataforma parar, esperar cerca de 30 segundos e retire a solução vetor.Nota: a permeabilização óptima ocorre perto de uma pressão dinâmica de 100 a 200 Pa, a saída do bocal, de acordo com o diâmetro do capilar. </li><li> Lavar bem três vezes com PBS 1x. </li><li> Encha bem com meio de cultura fresco. </li><li> Repita os passos de 4,3-4,6 para o número desejado de experimentos. Nota: Certifique-se de incluir amostras de controle que consistem em poços que estão sendo preenchidos com a solução de vetor sem o jato de gás que está sendo executado sobre eles. Deixar a solução em poços de controlo durante cerca de 1 min, em seguida, continuar com os passos 4.5 e 4.6. </li><li> Se realizando uma experiência de transfecção hrGFP, retornar de 6 cavidades da placa para incubadora durante 24 horas para permitir que o material transfectadas ser transcrita pelas células. Se a execução de um experimento permeabilização dextrano, volte 6 bem-placa para incubadora por 15 min. </li></ol> 5. Imagens de células <ol><li> Se desejar, imediatamente antes de imagem, contrastante com mancha vivo / morto apropriado para avaliar a morte celular. </li><li> Células de imagem com appropmicroscópio riate para investigar a eficácia de transfecção / permeabilização. </li></ol>

<ol><li>Rosenberg, S. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gene+transfer+into+humans--immunotherapy+of+patients+with+advanced+melanoma%2C+using+tumor-infiltrating+lymphocytes+modified+by+retroviral+gene+transduction%5BTitle%5D)+AND+%22The+New+England+Journal+of+Medicine%22%5BJournal%5D)">Gene transfer into humans--immunotherapy of patients with advanced melanoma, using tumor-infiltrating lymphocytes modified by retroviral gene transduction.</a> The New England Journal of Medicine. 323, 570-578 (1990).</li>
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<li>Greenleaf, W. J., Bolander, M. E., Sarkar, G., Goldring, M. B., Greenleaf, J. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Artificial+cavitation+nuclei+significantly+enhance+acoustically+induced+cell+transfection%5BTitle%5D)+AND+%22Ultrasound+in+Medicine+%26+Biology%22%5BJournal%5D)">Artificial cavitation nuclei significantly enhance acoustically induced cell transfection.</a> Ultrasound in Medicine & Biology. 24, 587-595 (1998).</li>
<li>Yang, N. S., Burkholder, J., Roberts, B., Martinell, B., McCabe, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+and+in+vitro+gene+transfer+to+mammalian+somatic+cells+by+particle+bombardment%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">In vivo and in vitro gene transfer to mammalian somatic cells by particle bombardment.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 87, 9568-9572 (1990).</li>
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<li>Chouinard-Pelletier, G. L., Guay, M., Coulombe, D., Leask, S., L, R., Jones, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Use+of+inert+gas+jets+to+measure+the+forces+required+for+mechanical+gene+transfection%5BTitle%5D)+AND+%22Biomedical+Engineering+Online%22%5BJournal%5D)">Use of inert gas jets to measure the forces required for mechanical gene transfection.</a> Biomedical Engineering Online. 11, (2012).</li>
<li>Leduc, M., Coulombe, S., Leask, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Atmospheric+Pressure+Plasma+Jet+Deposition+of+Patterned+Polymer+Films+for+Cell+Culture+Applications%5BTitle%5D)+AND+%22Ieee+T.+Plasma+Sci%22%5BJournal%5D)">Atmospheric Pressure Plasma Jet Deposition of Patterned Polymer Films for Cell Culture Applications.</a> Ieee T. Plasma Sci. 37, 927-933 (2009).</li>
<li>Lu, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microfluidic+shear+devices+for+quantitative+analysis+of+cell+adhesion%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Microfluidic shear devices for quantitative analysis of cell adhesion.</a> Analytical Chemistry. 76, 5257-5264 (2004).</li>
<li>Sankin, G. N., Yuan, F., Zhong, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pulsating+tandem+microbubble+for+localized+and+directional+single-cell+membrane+poration%5BTitle%5D)+AND+%22Physical+Review+Letters%22%5BJournal%5D)">Pulsating tandem microbubble for localized and directional single-cell membrane poration.</a> Physical Review Letters. 105, 078101(2010).</li>
</ol>

Os autores declaram que não têm interesses financeiros concorrentes.

Inerte permeabilização jato de gás é uma técnica útil para a transfecção de células aderentes. Ele oferece a capacidade de transferir biomoléculas para as células com a utilização de forças mecânicas, o que elimina a necessidade de produtos químicos potencialmente nocivos ou vectores virais. A técnica poderia dar aos pesquisadores e clínicos de forma eficiente e relativamente simples de transfecção com precisão células. A seletividade da permeabilização também é único permitindo que os pesquisadores apenas para tratar c...

Com a evolução da biomedicina e da compreensão da mecânica de células, a entrega de biomoléculas em células tornou-se vital para muitos campos de pesquisa e terapias médicas. Diferentes técnicas têm sido desenvolvidas para introduzir moléculas estranhas através da membrana do plasma e para dentro do citoplasma celular. Estes podem ser geralmente classificadas como: técnicas virais, químicos ou mecânicos. Técnicas virais podem transfectar material genético tais como ARN e ADN utilizando vectores virais 1. Técnicas virais tendem a ter alta eficiência em certas linhagens de células, no entanto, eles têm o potencial para reações imunes e inflamatórias 2. Métodos de transfecção químicos comuns incluem precipitação com fosfato de cálcio de 3, 4 e exotoxinas bacterianas lipofecção 5. Estas técnicas têm provado ser eficaz, no entanto, certos problemas surgem, tais como toxicidade da célula e não especificidade. Além disso, as técnicas tais como o cálcio phosphate precipitação foram encontrados a ter eficiências de transfecção superior a 70%, mas apenas em certas linhas celulares, raramente em células primárias 6. Isto é digno de nota que cada vez mais esforços de pesquisa são colocados em pilhas, em especial no caso da concepção de vários tratamentos para uso clínico e o estudo do ADN funcionamento. Temporal rompimento da membrana celular através de estímulos mecânico é uma alternativa para a introdução de moléculas estranhas nas células. As técnicas incluem: microinjecção de moléculas 7, electroporação usando um campo eléctrico para romper a membrana de 8,9, sonoporação usando ondas de ultra-sons para romper a membrana de células 10-12, bombardeamento de partículas, como revelado no &quot;pistola de genes&quot;, que dispara partículas ligadas com genes na célula 13, e, mais recentemente, a aplicação de tensão de corte do fluido que tem sido demonstrado que temporalmente permeabilizar as células de mamíferos 14,15. Embora mecânicométodos al evitar alguns dos problemas acima mencionados, eles são normalmente acompanhadas por eficiências menores e configurações muito complexas e especializadas. Uma tocha de descarga luminescente pressão atmosférica (APGD-t) foi desenvolvido na McGill, com o objetivo inicial de funcionalização de superfícies e retirar células aderentes in vitro 16. Por acaso, descobriu-se que uma mancha vivo / morto sendo usado foi de algum modo a ser levado por células sem um agente de permeabilização ser adicionado. Além disso, esta parecia ter ocorrido apenas em áreas restritas dos poços, que aconteceram a corresponder-se com o caminho da tocha. A investigação sobre as capacidades de permeabilização da APGD-t contínua e em estudos de controlo, verificou-se que o jacto de gás veicular inerte do plasma sem excitação, também foi capaz de permeabilizar as células. Isto contradiz a hipótese inicial de que as espécies reativas criadas pelo jato de plasma prejudicada temporariamente a função da membrana e sugeriu que simplesmente os mecânicosforças cal foram suficientes para causar a permeabilização celular. A partir daqui, os estudos continuaram em nosso laboratório para tentar quantificar e caracterizar a eficiência de permeabilização de um jato de gás inerte, bem como olhar para as suas capacidades de transfecção 16. Através destes estudos, verificou-se que os microporos façam efectivamente na membrana do plasma, e estas tendem a selar os poros dentro de aproximadamente 5 seg 15. Demonstrámos a utilidade do cultivo in vitro e in vivo na membrana corioalantóica de um embrião de pinto.

<table><tbody><tr><td>Vitality hrGFPII-1</td><td>Agilent Technologies Canada</td><td>240143-57</td><td>Proteína fluorescente verde para experimentos de transfecção em células HeLa</td></tr><tr><td>Dextran, AlexaFluor 488; 10.000 MW, aniônico, Fixable</td><td>Life Technologies Inc.</td><td>D22910</td><td>dextrano para experimentos de permeabilização</td></tr><tr><td>Kit de Viabilidade/Citotoxicidade VIVO/MORTO</td><td>Life Technologies Inc.</td><td>L3224</td><td>para contracoloração de células de mamíferos</td></tr><tr><td>Prolong Gold Antifade Reagent</td><td>Invitrogen</td><td>P36930</td><td>para montagem de lâminas ao obter imagens</td></tr> de <tr><td>hélio de pureza ultra-alta</td><td>Praxair Canada Inc.</td><td>HE 5.0UH-T</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Hyclone DMEM/ High Glucose Media - 500 ml</td><td>Thermo Scientific</td><td>SH30022.01</td><td>para células HeLa</td></tr><tr><td>Fetal Soro Bovino</td><td>Invitrogen</td><td>26140079</td><td>Para mídia DMEM</td></tr><tr><td>Penicilina-Estreptomicina, líquido</td><td>Invitrogen</td><td>15140-122</td><td>Para mídia DMEM</td></tr><tr><td>Solução salina tamponada com fosfato (PBS) 1x</td><td></td><td></td><td>Produzido em laboratório</td></tr><tr><td>&nbsp;</td><td></td><td></td><td><forte>Tabela 1</forte>. Lista de reagentes necessários</td></tr><tr><td>Microplacas tratadas com TC transparente de 6 poços</td><td>Corning</td><td>3506</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>#1 22 x 22 Lamínulas</td><td>Fisher</td><td>12-542B</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Glass Capillaries</td><td>World Precision Instruments</td><td></td><td>WPI Sizing</td></tr><tr><td>Information ID (mm): 1, 0.86, 0.68, 0.5 Pedido #: 1B200, 1B150, 1B120, 1B100</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Controlador Mass-Flo</td><td>MKS</td><td>M100B01314CS1BV</td><td>Controlador de fluxo de massa, Série M100B, requer uma fonte de alimentação externa de 12 V</td></tr><tr><td>USB-6009 Dispositivo DAQ</td><td>National Instruments</td><td>779026-01</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Conjunto UniSlide com motor de passo e controlador</td><td>Velmex</td><td></td><td>Duas séries MA15 UniSlide Assemblies, equipadas com motores de passo Vexta 1.8&deg; fornecidos pela Velmex, e controladas por um Controlador de Motor de Passo VXM</td></tr><tr><td>&nbsp;</td><td></td><td></td><td>Tabela 2. Lista de equipamentos necessários</td></tr></tbody></table>

permeabilização de células aderidas usando um gás inerte jet

Permeabilization of Adhered Cells Using an Inert Gas Jet

Existem várias técnicas de transfecção celular e estes podem ser divididos em três categorias principais: virais, químicas e mecânicas. Este protocolo descreve um método mecânico para temporalmente permeabilizar as células aderentes utilizando um jacto de gás inerte, que pode facilitar a transferência de normalmente macromoléculas não permeáveis ​​nas células. Acreditamos que esta técnica funciona por transmissão de forças de cisalhamento sobre a membrana plasmática de células aderentes, resultando na formação temporária de microporos. Uma vez que esses poros são criadas, as células são, então, permeável ao material genético e outras biomoléculas. As forças mecânicas envolvidas não correr o risco de danificar as células permanentemente ou desencaixar do seu substrato. Existe, portanto, uma estreita faixa de dinâmica de gás inerte, onde a técnica é eficaz. Um jato de gás inerte mostrou-se eficaz na permeabilização várias linhas celulares aderentes incluindo HeLa, HEK293 e células endoteliais da aorta abdominal humanos. Este protocolo é apropriado para a permeabilization de células aderentes, quer in vitro e, como aqui demonstrado, in vivo, mostrando que pode ser utilizado para a pesquisa e, potencialmente, em aplicações clínicas futuras. Tem também a vantagem de permeabilização de células de uma forma espacialmente restritiva, que poderia revelar-se uma ferramenta de pesquisa valiosa.

Permeabilização de células HeLa com 10 kDa dextrano fluorescente verde usando um jacto de gás hélio com um capilar de diâmetro interno 0,86 milímetros é mostrado na Figura 1. As células foram contrastadas imediatamente após a permeabilização com 2 ul / ml EthD-1 solução (Live / Dead viabilidade / citotoxicidade Kit) para visualizar a morte celular. Imediatamente após contracoloração, lamínulas foram montadas e fotografadas. Esta figura mostra resultados da execução do jato de gás hélio em três diferente...

Este protocolo descreve um método para a permeabilização temporária de células aderentes utilizando um jacto de gás inerte. Esta técnica facilita a transferência de material genético e biomoléculas em células de mamíferos aderentes por meio da utilização das forças mecânicas para romper a membrana de plasma.

Permeabilização de células aderidas Usando um gás inerte Jet

Various cell transfection techniques exist and these can be broken down to three broad categories: viral, chemical and mechanical. This protocol describes ...

O objetivo geral deste procedimento é permeabilizar células aderentes. Isso é realizado primeiramente cultivando-se as células experimentais em lamínulas colocadas em placas de seis poços. O segundo passo é lavar as células com 1x PBS e cobri-las com a solução contendo a biomolécula a ser transferida para o interior da célula.Em seguida, aplica-se o jato de gás inerte. A amostra permeabiliza as células. O passo final é fixar e corar as células, se desejado.Por fim, a microscopia de imunofluorescência é utilizada para demonstrar a eficiência de permeação e a viabilidade celular. A principal vantagem desta técnica em relação aos métodos existentes, como a proliferação ou as armas de genes, é que ela é facilmente configurada e permite a permeação espacialmente restrita de células aderentes. Em um cultivo, geralmente, indivíduos novos nesta técnica podem ter dificuldades, pois pode ser necessário tempo para aperfeiçoar certos parâmetros, como a taxa de fluxo de gás ou o diâmetro do capilar, a fim de permitir uma permeação eficiente em suas aplicações específicas.O controlador de fluxo mássico utilizado neste procedimento exige uma fonte de alimentação externa de 12 volts e é conectado a uma linha de gás hélio para garantir uma taxa de fluxo de gás precisa. A interface entre o controlador de fluxo mássico e o computador é realizada por meio de um dispositivo de aquisição de dados. Esta unidade é controlada por uma tensão de entrada que varia entre zero e cinco volts. Um circuito de controle no programa LabVIEW determina a tensão necessária a qualquer momento.Duas escorregas lineares de posicionamento são usadas para controlar o movimento da placa de seis poços, uma para cada direção. Cada conjunto consiste em um conjunto de escorrega linear MA 15 série Velm X uni acoplado a um motor de passo, e ambos os conjuntos são controlados por um único controlador de motor de passo VELM XVXM. O controlador permite o avanço manual de cada motor ou aceita uma sequência de comandos seriais externos.A combinação que permite padrões específicos de movimento. Vários padrões podem ser programados no programa LabVIEW, exigindo que o usuário forneça apenas a velocidade desejada da tocha, bem como as dimensões do percurso. Inicie a preparação do equipamento abrindo o cilindro de hélio e o regulador, e ligue o controlador do motor.Abra o programa de visualização do laboratório e verifique todas as condições. Em seguida, certifique-se de que a plataforma está centralizada para verificação. Observe cada estágio do motor e verifique se cada carro não está próximo a nenhuma das extremidades do estágio e, então, use o programa para centralizar os carros.Se esta for a primeira execução do dia, recomenda-se executar o programa uma vez sem células para garantir que a configuração está funcionando corretamente. Para preparar a altura do bico capilar do Jett a gás, remova a capilar do suporte e zere o mostrador de altura. Coloque a placa de seis poços sobre a plataforma.Substitua a capilar do jato de gás e abaixe-a até o fundo do poço até tocar o lamínula. Fixe a capilar no suporte utilizando o botão de ajuste de altura. Levante a capilar três milímetros e marque essa altura na base da capilar.Por último, eleve a capilaridade a uma altura segura e, em seguida, remova a placa de seis poços. A linhagem celular aderente para este protocolo deve ser cultivada até a confluência em lamínulas de vidro em uma placa de seis poços, utilizando técnicas de cultivo padrão para células helo. Sementeie as placas de seis poços com duas vezes 10 à quinta potência de células por poço e incube por 48 horas antes do tratamento.No dia do tratamento, prepare um volume apropriado de solução contendo o vetor desejado. Para estudos com dextrina, recomenda-se 80 microgramas por mililitro de dextrina verde fluorescente de 10 kilodaltons, em quarto lugar. Esta solução será denominada solução de vetor.Remova o meio de cultura celular de um poço e lave três vezes com um XPBS. Pipete 1.370 microlitros da solução do vetor no poço. Isso deve resultar em uma profundidade de líquido de aproximadamente 1,3 milímetro. Coloque o poço contendo a solução do vetor no centro da plataforma.Abaixe o bico do jato de gás até o nível previamente marcado, indicando uma altura do bico de três milímetros acima da lâmina. Defina a taxa de fluxo de hélio no programa de visualização do laboratório e selecione o padrão de movimento desejado a ser utilizado. Selecione executar.Quando estiver pronto para iniciar o protocolo de permeação, haverá um período inicial de latência durante o qual o controlador de vazão em massa estará se preparando para fornecer a vazão necessária. Para o sucesso deste protocolo, é importante otimizar as condições de fluxo para minimizar a profundidade celular e a dessorção celular. Uma vez atingida a vazão apropriada, o programa LabVIEW ativará os motores de passo para mover o poço no padrão de permeação desejado. Após a plataforma parar, remova a placa de seis poços da plataforma.Aguarde aproximadamente 30 segundos e, em seguida, remova a solução vetorial. Lave o poço três vezes com PBS. Após a terceira lavagem, preencha o poço com meio de cultura fresco.Repita o protocolo de permeação pelo número desejado de experimentos. Certifique-se de incluir amostras controle que consistem em poços preenchidos com a solução vetorial sem que o jato de gás tenha sido aplicado sobre eles. Deixe a solução nos poços controle por aproximadamente um minuto antes de remover a solução.Lave as células com PBS e preencha o poço com meio de cultura fresco. Retorne a placa de seis poços ao incubador; no caso de incubação com permeação de dextrina, incube por 15 minutos. Posteriormente, visualize as células com o microscópio apropriado para investigar a eficácia da permeação.Mostrados aqui estão os resultados da permeabilização de células HeLa com dextrina verde fluorescente de 10 quilodaltons utilizando um jato de gás hélio com diâmetro interno de 0,86 milímetro. Os painéis capilares A, B e C mostram os resultados obtidos com o jato de gás hélio operado em três pressões de saída diferentes, e o painel D é um controle com dextrina adicionada, mas sem exposição ao jato de gás hélio. As células foram contracoradas imediatamente após a permeabilização para visualizar a morte celular. Nessas imagens, a dextrina fluoresce em verde e as células mortas fluorescem em vermelho.Observou-se nos painéis A e B que a largura e a eficiência da trilha de permeação aumentaram com uma pressão dinâmica mais elevada, com apenas um leve aumento na morte celular. No entanto, uma vez atingida uma pressão dinâmica alta, como observado no painel C, as células HeLa foram destacadas dos lamínulas e ocorreu muito pouca permeação periférica, conforme verificado por estudos de microscopia eletrônica de varredura. Microporos foram observados na membrana celular.Neste exemplo, a permeação de células HeLa foi realizada utilizando um jato de gás hélio com uma capilaridade de diâmetro interno de 0,86 milímetro a uma pressão de saída de 300 pascals. Foram obtidas imagens de microscopia eletrônica de varredura com uma ampliação de 50.000 x. O painel A mostra uma amostra controle exibindo uma superfície celular lisa, enquanto o painel B mostra a superfície de uma célula permeabilizada exibindo um poro com diâmetro de 84 nanômetros. Uma vez dominada, essa técnica deve levar de 15 a 30 minutos, se realizada corretamente. Após o procedimento, podem ser realizadas colorações para avaliar fatores adicionais, como a viabilidade celular.

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Bioengineering

Bioengenharia

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