Isolamento de hepatócitos humanos por duas etapas Collagenase Perfusão Procedimento

O objetivo geral deste procedimento é isolar hepatócitos humanos utilizando um procedimento de perfusão com colagenase em duas etapas. Isso é realizado primeiramente canulando os vasos sanguíneos em um fragmento de fígado com uma cânula de irrigação. Em seguida, realiza-se a perfusão e digestão do fragmento de fígado utilizando colagenase.

O terceiro passo é a remoção da cápsula glistens, que libera as células hepáticas dissociadas. O passo final é uma centrifugação de baixa velocidade que isola os hepatócitos. Em última análise, os hepatócitos podem ser identificados por microscopia de contraste de fase ou por coloração de albumina usando imunocitoquímica, com a viabilidade e o rendimento dos hepatócitos determinados por meio de ensaio de exclusão de triam azul.

A demonstração visual deste método é essencial, pois as etapas de cânula e digestão são difíceis de aprender. Isso ocorre porque a cânula exige certa destreza e a conclusão da digestão pode ser difícil de identificar. Para pessoas novas na técnica, a demonstração do procedimento será realizada por Natalie Lun, uma técnica do meu laboratório.

Nesta demonstração, utilizaremos um fragmento de fígado de carpa no lugar de um fragmento humano. Prepare o equipamento para a perfusão do fragmento de fígado conforme a seguir: ajuste o banho-maria à temperatura apropriada para que as soluções atinjam 37 graus Celsius quando chegarem ao fragmento de fígado. 41 graus Celsius é adequado para as soluções um, dois e três; já a solução quatro, para o condensador de vidro com jaqueta, deve estar a 37 graus Celsius para reduzir a perda de atividade da colagenase. Pouco antes da perfusão, ligue o regulador de gás para o aparelho de oxigenação. A partir de um patologista, obtenha um fragmento de fígado que, idealmente, tenha uma cápsula de Glisson predominantemente ou completamente intacta e apenas uma superfície cortada.

Este fragmento de fígado sobre o funil de Buchner, que contém um disco filtrante perfurado, deve ter o sistema de perfusão agora preparado com a solução um, utilizando uma cânula de irrigação curva com pontas em forma de azeitona e inserida nos vasos sanguíneos maiores da superfície cortada do fragmento de fígado, com uma taxa de fluxo baixa. À medida que o sangue é eliminado do fígado, o tecido torna-se mais claro nas áreas com boa perfusão. O número de cânulas utilizadas varia conforme o tamanho dos fígados.

De modo geral, quatro a oito cânulas devem ser usadas para fígados com massa variando de menos de 20 gramas a mais de 80 gramas. Escolha o calibre da cânula para que tenha um encaixe firme e seguro. Deixe os vasos sanguíneos menores abertos para permitir que o tampão drene do tecido.

Agora, aumente a taxa de fluxo da bomba peristáltica para entre 110 e 460 mililitros por minuto. Uma boa perfusão é aquela em que o fragmento de fígado apresenta uma coloração mais clara ao longo de toda a taxa de fluxo utilizada. Depende do tamanho do fígado, sendo que taxas de perfusão mais altas são usadas para fígados maiores.

De modo geral, uma velocidade média de perfusão de 44 mililitros por minuto por cânula é ideal para uma variedade de pesos hepáticos diferentes. A vazão escolhida deve resultar em um leve aumento de volume do fragmento hepático. Mantenha o fragmento hepático úmido durante a perfusão, cobrindo-o com um pedaço de gaze embebido em solução salina.

Após perfundir o tecido com um litro de solução, uma para remover qualquer sangue remanescente no fragmento de fígado. Troque o fluido de perfusão para a solução dois e realize a perfusão por 10 minutos. Em seguida, mude o fluido de perfusão para a solução três e perfunda com meio litro.

Agora, troque o fluido de perfusão pela solução quatro, que contém colagenase. Realize esta perfusão de maneira recirculante por nove a 12 minutos ou até que o fígado esteja suficientemente digerido. O tecido hepático deve parecer se romper levemente sob a cápsula brilhante.

O fígado também deve apresentar consistência macia ao ser sondado com o lado rombo de um bisturi. É importante digerir o fragmento de fígado pelo tempo correto, pois uma digestão excessiva pode resultar em baixa viabilidade dos hepatócitos, enquanto uma digestão insuficiente pode levar a baixo rendimento de hepatócitos. Comece desligando a bomba peristáltica e removendo a cânula do fragmento de fígado.

Em seguida, coloque o tecido em um béquer contendo de 100 a 200 mililitros da solução Cinco. Remova cuidadosamente a cápsula de glistens e agite suavemente para soltar as células. Se houver regiões que não foram bem perfundidas, pode-se usar um bisturi para cortar essas regiões e liberar as células nelas contidas.

Adicione mais solução cinco conforme necessário durante o processo e, por fim, complete o volume da solução cinco até 500 mililitros. Agora, filtre a suspensão celular duas vezes. Primeiro, filtre as células através de uma malha de náilon de 210 micrômetros em um frasco cônico de um litro.

Em seguida, filtre as células através de uma peneira de náilon de 70 microns para um frasco cônico de um litro. Despeje volumes iguais da suspensão celular em tubos de centrífuga de 200 mililitros. Em seguida, centrifugue a suspensão celular filtrada a 72 ×g por cinco minutos a quatro graus Celsius.

Aspire o sobrenadante e ressuspenda suavemente o pellet celular em aproximadamente 200 mililitros da solução Cinco. Repita a centrifugação e a ressuspensão três vezes; após a centrifugação final, ressuspenda as células em solução de armazenamento frio para uma concentração final de dois a cinco milhões de hepatócitos por mililitro. Um ensaio com azul de tripano pode ser usado para medir com precisão a contagem celular utilizando um hemocitômetro.

Mostram-se aqui hepatócitos corados com azul de trian de 648 isolamentos. A viabilidade média dos hepatócitos humanos isolados foi de 77 ± 10%. O rendimento médio de hepatócitos foi de 13 ± 11 milhões de hepatócitos por grama de fígado por meio de imunofluorescência. Os hepatócitos isolados que se coraram positivamente para albúmina em verde apresentaram uma pureza de 94 ± 1% para determinar a pureza dos hepatócitos.

A coloração por imunofluorescência foi realizada quatro vezes com cinco réplicas por ensaio. A microscopia de contraste de fase mostra as características morfológicas dos hepatócitos, como seu grande tamanho celular e forma poligonal. Após assistir a este vídeo, você deverá ter uma boa compreensão de como isolar hepatócitos humanos utilizando um procedimento de perfusão com colagenase em dois passos.