Isolamento de hepatócitos humanos por duas etapas Collagenase Perfusão Procedimento

O objetivo geral deste procedimento é isolar hepatócitos humanos usando um procedimento de perfusão de colagenase em duas etapas. Isso é feito primeiro canulando os vasos sanguíneos em um pedaço de fígado com cânula de irrigação. Isso é seguido pela perfusão e digestão da peça de fígado usando colagenase.

O terceiro passo é a remoção da cápsula glistens, que libera as células hepáticas dissociadas. A etapa final é uma centrifugação de baixa velocidade que isola os hepatócitos. Em última análise, os hepatócitos podem ser identificados com microscopia de contraste de fase ou por coloração de albumina usando imunocitoquímica com viabilidade e rendimento de hepatócitos determinados usando um ensaio de exclusão de azul de triam.

A demonstração visual deste método é crítica, pois as etapas de canulação e digestão são difíceis de aprender. Isso ocorre porque a canulação requer alguma sutileza e a conclusão da digestão pode ser difícil de identificar. Para pessoas novas na técnica, demonstrando o procedimento estará Natalie Lun, uma técnica do meu laboratório.

Nesta demonstração, usaremos um pedaço de fígado de lâmpada no lugar de um pedaço de um humano, Configure o equipamento para a perfusão do pedaço de fígado da seguinte forma, ajuste o banho-maria para uma temperatura apropriada de modo que as soluções estejam a 37 graus Celsius quando atingirem o fígado. Peça. 41 graus Celsius é bom para as soluções um, dois e três, e para a solução do condensador de vidro encamisado quatro, no entanto, deve estar a 37 graus Celsius para reduzir a perda de atividade da colagenase. Pouco antes da profusão, ligue o regulador de gás Para o aparelho de oxigenação de um patologista, obtenha uma peça de fígado que, idealmente, tenha uma cápsula brilhante quase ou totalmente intacta e apenas um local de superfície cortada.

Esta peça de fígado no funil de Buchner que contém um disco de filtro perfurado, o sistema de perfusão deve agora ser preparado com a solução um usando uma cânula de irrigação curva de baixa vazão com pontas de oliva nos vasos sanguíneos maiores na superfície de corte da peça de fígado. À medida que o sangue sai do fígado, o tecido fica mais claro em áreas com boa perfusão. O número de cânulas usadas varia para fígados de tamanhos diferentes.

Em geral, quatro a oito cânulas devem ser usadas para fígados que variam de menos de 20 gramas a mais de 80 gramas. Selecione o medidor da cânula para ter um ajuste confortável e seguro. Deixe os vasos sanguíneos menores abertos para que o tampão seja drenado do tecido.

Agora, aumente a vazão na bomba peristáltica para entre 110 a 460 mililitros por minuto. É uma boa perfusão se a peça de fígado tiver uma cor mais clara em toda a taxa de fluxo usada. Depende do tamanho do fígado com taxas de perfusão mais altas usadas para fígados maiores.

De um modo geral, uma velocidade média de perfusão de 44 mililitros por minuto por cânula é ideal em uma variedade de pesos hepáticos diferentes. A taxa de fluxo escolhida deve resultar em um ligeiro aumento da peça de fígado. Mantenha o pedaço de fígado úmido durante a perfusão, cobrindo-o com um pedaço de gaze embebido em solução salina.

Depois de perfundir o tecido com um litro de solução, um para eliminar o sangue restante no pedaço de fígado. Troque o fluido de perfusão para a solução dois e perfunda por 10 minutos. Em seguida, mude o fluido de perfusão para a solução três e perfunda com meio litro.

Agora mude o fluido de perfusão para a solução quatro, que contém colagenase. Realize esta perfusão de forma recirculante durante nove a 12 minutos ou até que o fígado esteja suficientemente digerido. O tecido hepático deve parecer se romper ligeiramente sob a cápsula brilhante.

O fígado também deve se sentir amolecido quando sondado com o lado cego de um bisturi. É importante digerir o pedaço de fígado pelo tempo correto, pois a digestão excessiva pode levar à baixa viabilidade dos hepatócitos e a digestão insuficiente pode levar ao baixo rendimento dos hepatócitos. Comece desligando a bomba peristáltica e removendo a cânula da peça hepática.

Em seguida, coloque o tecido em uma placa de cristalização contendo 100 a 200 mililitros de solução. Cinco. Remova a cápsula brilhante com cuidado e sacuda suavemente as células. Se houver regiões que não estão bem perfundidas, um bisturi pode ser usado para cortar essas regiões para liberar as células contidas nelas.

Adicione mais solução cinco conforme necessário durante o processo e, finalmente, traga o volume da solução cinco para 500 mililitros. Agora filtre a suspensão da célula duas vezes. Primeiro, filtre as células através de uma malha de náilon de 210 mícrons em um frasco cônico de um litro.

Em seguida, filtre as células através de uma malha de náilon de 70 mícrons em um frasco cônico de um litro. Despeje dois volumes iguais da suspensão celular em tubos de centrífuga de 200 mililitros. Em seguida, centrifugue a suspensão de células filtradas a 72 Gs por cinco minutos a quatro graus Celsius.

Aspire o snat e ressuspenda suavemente o pellet celular em cerca de 200 mililitros de solução. Cinco. Repetir a centrifugação e ressuspender três vezes após a centrifugação final, ressuspender as células em solução frigorífica para uma concentração final de dois a 5 milhões de hepatócitos por mililitro. Um ensaio triam blue pode ser usado para medir com precisão a contagem de células usando um hemocitômetro.

Aqui são mostrados hepatócitos corados com azul trian de 648 isolamentos. A viabilidade média dos hepatócitos humanos isolados foi de 77 mais ou menos 10% O rendimento médio de hepatócitos foi de 13 mais ou menos 11 milhões de hepatócitos por grama de fígado por meio de imunofluorescência. Os hepatócitos isolados que coraram positivamente para albumina em verde tiveram uma pureza de 94 mais ou menos 1% para determinar a pureza dos hepatócitos.

A coloração imunofluorescente foi realizada quatro vezes com cinco repetições por ensaio. A microscopia de contraste de fase mostra as características morfológicas dos hepatócitos, como seu grande tamanho celular e formato poligonal. Depois de assistir a este vídeo, você deve ter uma boa compreensão de como isolar hepatócitos humanos usando um procedimento de perfusão de colagenase em duas etapas.