Controle quantitativo e temporal de oxigênio Microenvironment no Ilhéu Individual

O objetivo geral deste procedimento é aplicar hipóxia intermitente em escala de minutos a ilhós pancreáticos em microescala para investigar os efeitos do pré-condicionamento. Isso é feito fabricando primeiro um dispositivo microfluídico multimodal com uma fina membrana permeável a gás. O segundo passo é criar um sistema computadorizado de modulação de oxigênio.

Em seguida, os ilhós são cuidadosamente carregados no dispositivo e, em seguida, os microfluídicos líquidos e de oxigênio são conectados. A etapa final é coordenar a microscopia com a microfluídica multimodal para visualizar os parâmetros do ilhó que são alterados durante a modulação do oxigênio. Em última análise, a técnica de hipóxia intermitente com ilhós é usada para mostrar que a resposta à glicose é claramente prejudicada na hipóxia.

Enquanto as modulações temporais da hipóxia podem treinar ilhós para responder com menos comprometimento. A principal vantagem dessa técnica sobre os métodos existentes, como oxigênio dissolvido ou uso de uma câmara hipóxica, é a precisão. A concentração de oxigênio pode ser fornecida às pálpebras em intervalos de tempo rápidos e minúsculos, sem estresse absoluto de fluxos complicados.

Também permite monitoramento em tempo real com piso e microscopia. Este mestre pode ajudar a responder a questões-chave no campo do transplante Alli, como definir deficiências hipóxicas nos locais de transplante ou regimes de pré-condicionamento para melhorar os resultados do transplante. Portanto, esse método pode fornecer informações sobre a hipóxia de Alli.

Também pode ser aplicado a outros tecidos e sistemas, como o sistema nervoso central, tecidos cardíacos, rins e outros órgãos de transplante. A demonstração em vídeo deste método é crítica, pois muitos dos fabricantes de dispositivos e alças de ilhós. As etapas são difíceis de aprender devido à nova natureza interdisciplinar da técnica, mas inerente ao desafio ou familiarizado Comece fabricando a camada de cobertura do dispositivo microfluídico.

Para conseguir isso, despeje PDMS pré-misturados com DGAs a uma altura de 1,5 milímetros em uma placa de Petri em branco e cure-a a 80 graus Celsius por duas horas. Em seguida, fabrique a camada microfluídica de glicose com mestre de câmara de profusão por rotação de duas camadas de 350 mícrons de espessura de SU 8 21 50 para formar uma única camada de 700 mícrons em um wafer de silicone de quatro polegadas. Em seguida, exponha-o à luz ultravioleta usando a máscara fotográfica da camada microfluídica de glicose para transferir o padrão de microcanal para a camada SU oito.

Enxágue a área não exposta com o revelador SU oito. Em seguida, despeje PDMS pré-misturados com DGAs no MA até uma altura de três milímetros e catalise a 80 graus Celsius por duas horas. Depois de curado, corte a camada microfluídica de glicose para moldar e use um punção de dois milímetros para formar as portas de entrada e saída, bem como um punção de oito milímetros de diâmetro para a câmara principal.

Em seguida, fabrique o mestre de micro poços para imobilização palpebral por rotação de uma camada de 100 mícrons de espessura de SU 8 2100 em um wafer de silício limpo de quatro polegadas e, em seguida, use a litografia UV para transferir o padrão de micro poço para esta camada. Enxágue as áreas não expostas com o revelador quando o mestre de micropoços estiver completo. Adicione duas camadas de PDMS de 100 mícrons por revestimento giratório a 900 RPM por 30 segundos e, em seguida, curando por 10 minutos a 80 graus Celsius para produzir cada camada.

Quando terminar, perfure a entrada de dois milímetros de diâmetro nas portas de saída. Finalmente, fabrique o mestre microfluídico de gás girando SU 8 2100 a 100 mícrons de espessura como na camada anterior e transfira os padrões microfluídicos de gás novamente usando litografia UV. Enxágue a área não exposta com revelador.

Em seguida, despeje uma camada de 1,5 milímetro de espessura de PDMS no mestre microfluídico de gás e cure a 80 graus Celsius por duas horas. Em seguida, corte o PDMS para moldar com a lâmina de barbear. Em seguida, perfure as portas de entrada e saída de dois milímetros de diâmetro na camada de cobertura para alinhar com onde elas são encontradas nas outras camadas para unir as várias camadas.

Primeiro, prepare-os limpando as superfícies com fita adesiva, expondo-as a um arco Corona e, em seguida, alinhando as camadas manualmente na seguinte ordem. Primeiro, cole a membrana à camada de gás inferior com os micropoços voltados para cima. Em seguida, cole a camada microfluídica de glicose no topo da membrana do micropoço.

Por fim, cole a camada de entrada e saída na parte superior, encapsulando todo o conjunto. Ajude a formar uma ligação firme adicionando um peso de um quilo em cima do conjunto e assando-o a 100 graus Celsius por três horas. Então vazar.

Teste o dispositivo carregando água na camada aquosa, submergindo o dispositivo e fluindo ar através da camada de gás com a seringa enquanto procura por vazamentos. Finalmente, esterilize os dispositivos sem vazamentos passando 70% de etanol pela camada aquosa por um a dois minutos. Configure os micro dispensadores conectando primeiro os cabos de controle dos micro dispensadores às unidades de acionamento incluídas.

Em seguida, conecte os drivers à placa de E/S digital nas portas correspondentes aos controles de exibição de laboratório. Em seguida, conecte as fontes de alimentação de cinco volts e 20 volts CC aos seus contatos correspondentes nas unidades de acionamento e conecte o IO digital a um laptop para executar códigos de visualização de laboratório para controle de gás, conforme descrito no apêndice do protocolo de texto que o acompanha. Em seguida, conecte um micro dispensador ao nitrogênio e o outro ao ar comprimido, ambos contendo 5% de dióxido de carbono e defina os dois gases para dois PS. Eu conecto as saídas do dispensador em uma junção T antes de entrar no dispositivo microfluídico.

Em seguida, monte o dispositivo no estágio aquecido de um microscópio invertido com 0% e 21% de oxigênio conectado ao dispositivo. Em seguida, coloque um sensor de oxigênio de fibra óptica na saída de fluido do dispositivo para medir o oxigênio dissolvido dentro da saída em tempo real. Em seguida, conecte o dispositivo a uma bomba peristáltica e comece a fluir água através do dispositivo a 250 microlitros por minuto.

Caracterize a resposta transitória da modulação do oxigênio alternando os micro dispensadores entre cinco e 21% de oxigênio. Conecte uma bomba peristáltica ao dispositivo microfluídico e posicione a tubulação sobre uma placa quente de 37 graus Celsius para aquecer o fluido antes que ele entre no dispositivo microfluídico. Além disso, conecte a porta de saída da microfluídica de glicose a um coletor de frações para começar a dissecar C 57 camundongos pretos seis e isolar ilhós pancreáticos por digestão de colagenase e separação de gradiente de densidade F ccal, conforme descrito nos vídeos a seguir disponíveis na JoVE uma vez isolados.

Incube os ilhós em meio RPMI 1640 contendo 10% de FBS, 1% de estreptomicina de penicilina e 20 pilhas milimolares em placas de Petri por 24 a 48 horas. Use os ilhós dentro de dois dias para garantir resultados consistentes. Em seguida, prepare o tampão de bicarbonato de Krebs ringer fresco, conforme descrito no protocolo de texto que acompanha, com uma solução contendo dois milimolares de glicose e outra contendo 14 milimolares de glicose.

Aqueça as soluções em tubos cônicos de 50 mililitros, colocando-os em banho-maria a 37 graus Celsius. Em seguida, prepare a coloração para os ilhós isolados adicionando cinco micromolares de 4:02 AM e DMSO e 2,5 micromolares de RH 1 23 e 100% de etanol a dois mililitros do tampão Krebs contendo dois milimolares de glicose. Em seguida, pegue os ilhós com uma pipeta de 10 microlitros e incube-os na mancha por 30 minutos a 37 graus Celsius.

Uma vez corado, carregue aproximadamente 20 ilhós no dispositivo através da entrada do microcanal de glicose. Direcione os ilhós para a câmara preparando o tampão da saída de volta para a entrada. Em seguida, perfunda os ilhós e tampone por 10 minutos para remover o excesso de corantes.

Primeiro, desenhe dois tampão de bicarbonato de Krebs milimolar através do sistema por cinco minutos para estabelecer uma linha de base de pulso normal. Em seguida, estimule a câmara com o tampão de glicose de 14 milimolares por 15 minutos, seguido por uma lavagem de 15 minutos com o tampão de glicose de dois milimolares. Durante este processo, registre o 510 nanômetro para duas emissões, excitando a dieta de 340 nanômetros e 380 nanômetros.

Além disso, registre a emissão de 530 de RH 1 23 excitando o corante em 480 nanômetros. Para minimizar os distúrbios convectivos durante a modulação do oxigênio, aplique o fluxo tampão durante as etapas de estimulação e lavagem e certifique-se de interromper o fluxo nas outras etapas durante o teste. Colete o efluente da saída de glicose em intervalos de um minuto para uso em análises adicionais usando a abordagem microfluídica mostrada neste vídeo, é possível regular a porcentagem de oxigênio que flui rapidamente pela fina membrana PDMS usando os microinjetores computadorizados.

Aqui está um exemplo dessa modulação variando de um minuto a seis minutos. Também é possível fornecer modulações quantitativas sub-minuto de oxigênio entre duas e 8,5 partes por milhão, fornecendo oxigênio entre cinco e 21% A linha azul mostra a porcentagem de oxigênio fornecido e verde é o oxigênio dissolvido resultante em partes por milhão. Quando este ciclo é aplicado para criar hipóxia intermitente nos ilhós, pode-se observar os benefícios do pré-condicionamento dos ilhós contra a hipóxia em comparação com o pulso normóxico irregular, observando a melhora da relação após o tratamento efeitos da hipóxia e hipóxia intermitente podem ser observados no amortecimento de overshoot e oscilação de transientes de cálcio, como mostrado aqui em azul é a resposta normóxica.

Em vermelho está a resposta hipóxica e a linha verde é a resposta hipóxica condicionada. A medida de cálcio, potencial mitocondrial e insulina são mostradas aqui. Eles são os resultados da microscopia fluorescente em tempo real e do ensaio EISA fora do chip usando o efluente microfluídico do sistema juntos, estes começam a construir uma visão multimodal da resposta da insulina glicose sob transiente hipóxico.

Uma vez dominada, essa técnica pode ser concluída em dois dias se executada corretamente, um dia para a fabricação do dispositivo e para isolar as células da pálpebra e um dia para os próprios experimentos da pálpebra. Ao tentar este procedimento, é importante lembrar de verificar a concentração de oxigênio fornecida casando com o gás do dispositivo após o desenvolvimento. Essa técnica abriu caminho para pesquisadores na saída fetal e outras microfisiologias teciduais explorarem como a hipóxia e os padrões temporários de oxigênio podem afetar doenças como diabetes, distúrbios cardiovasculares e neurológicos.

Depois de assistir a este vídeo, você deve ter uma boa compreensão de como controlar a modulação do oxigênio, manipular microtecidos e gerar medições repetíveis e significativas de hipóxia tecidual usando dispositivos microfluídicos multimodais.