Name: Controle quantitativo e temporal de oxigênio Microenvironment no Ilhéu Individual (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-11-17T14:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 49 s
Description: Aprenda a controlar oxigênio em ilhotas pancreáticas usando dispositivos microfluídicos multimodais. Este método permite modulação precisa e monitoramento em tempo real da resposta à glicose sob hipóxia.

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Este trabalho foi apoiado pelo National Institutes of Health Grants R01 DK091526 (JO), NSF 0852416(DTE) e Chicago Diabetes Project.

1. Preparando as ilhotas do rato
<ol>
	<li>Dissecar camundongos C57BL / 6 e isolar ilhotas por digestão de colagenase e separação de gradiente de densidade de Ficoll. (Consulte os artigos JOVE referenciados em2,3).</li>
	<li>Incubar ilhotas em meio RPMI-1640 contendo 10% de FBS, 1% de penicilina/estreptomicina e 20 mM de HEPES em placas de Petri (37 °C, 5% de CO2). Pós-isolamento, ilhotas de cultura por 24 horas antes do uso em experimentos. Use as ilhotas dentro de 1-2 dias para garantir resultados consistentes.</li>
</ol>
2. Fazendo a plataforma microfluídica
<ol>
	<li>Gere as geometrias da microestrutura em fotomáscaras de transparência para cada camada do dispositivo: 1) entrada e saída, 2) camada microfluídica de glicose com câmara de perifusão (8 mm de diâmetro x 3 mm, 150 μl), 3) membrana de 200 μm com micropoços (500 μm de diâmetro, 100 μm de profundidade) e 4) camadas microfluídicas de gás.</li>
	<li>Para fabricar a camada de entrada e saída, despeje PDMS desgaseificado e pré-misturado a uma altura de 1,5 mm em uma placa de Petri em branco e cure a 80 ° C por 2 horas. Perfure as portas de entrada / saída de 2 mm de diâmetro.</li>
	<li>Para fabricar a camada microfluídica de glicose, gire duas camadas de 350 μm de SU8-2150 para formar uma única camada de 700 μm em um wafer de silício de 4 pol.
	<ol>
		<li>Exponha a luz UV através da fotomáscara apropriada para transferir o padrão de microcanal para o SU8 após o desenvolvimento, produzindo um mestre de 700 μm de altura.</li>
		<li>Despeje o PDMS desgaseificado e pré-misturado neste mestre a uma altura de 3 mm e catalise a 80 °C por 2 horas. Corte este PDMS para moldar com uma lâmina de barbear.</li>
		<li>Perfure portas de entrada/saída de 2 mm de diâmetro, bem como a câmara de 8 mm de diâmetro.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Para fabricar a membrana de 200 μm com micropoços, gire SU8-2100 para 100 μm. Aplique a mesma litografia UV para transferir padrões de micropoços para este mestre de 100 μm de altura.
	<ol>
		<li>Gire o PDMS desgaseificado e pré-misturado neste mestre a 900 rpm por 30 segundos e cure a 80 ° C por 10 min. Gire uma segunda camada sobre a primeira usando as mesmas condições, resultando em uma membrana PDMS de 200 μm contendo padrões de micropoços.</li>
		<li>Perfure portas de entrada/saída de 2 mm de diâmetro através desta membrana</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Para fabricar a camada microfluídica de gás, gire SU8-2100 para 100 μm. Aplique a mesma litografia UV para transferir padrões microfluídicos de gás para este mestre de 100 μm de altura.
	<ol>
		<li>Despeje o PDMS desgaseificado e pré-misturado neste mestre a uma altura de 1.5 mm e catalise a 80 °C por 2 horas. Corte o PDMS no formato com uma lâmina de barbear.</li>
		<li>Perfure portas de entrada/saída de 2 mm de diâmetro através desta camada</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Para unir as várias camadas, prepare-as limpando com fita adesiva, expondo ao arco corona e, em seguida, alinhando-as manualmente na seguinte ordem.
	<ol>
		<li>Cole a membrana à camada de gás inferior com os micropoços voltados para cima.</li>
		<li>Cole a glicose microfluídica no topo da membrana do micropoço.</li>
		<li>Cole a camada de entrada e saída na parte superior, encapsulando todo o conjunto.</li>
		<li>Reforce a colagem adicionando 1 kg de peso por cima e assando a 100 °C por 3 horas.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Teste o dispositivo completo carregando água na camada aquosa e, em seguida, submergindo todo o dispositivo na água. Em seguida, flua o ar através da camada de gás com uma seringa vazia.</li>
	<li>Esterilizar os dispositivos sem fugas com etanol a 70% através da camada aquosa e, em seguida, lavar com tampão PBS, no qual o dispositivo é armazenado a 4 °C até à utilização.</li>
</ol>
3. Configuração do microdispensador
<ol>
	<li>Obtenha 2 microdispensadores, fontes de alimentação de 5 V e 20 V DC e uma placa de E/S digital para construir a configuração de mistura e entrega de oxigênio.
	<ol>
		<li>Conecte os cabos de controle dos microdispensadores às unidades de acionamento incluídas.</li>
		<li>Conecte os drivers à placa de E/S digital nas portas correspondentes aos controles do Labview.</li>
		<li>Conecte as fontes de alimentação de 5 V e 20 V aos contatos correspondentes nas unidades de acionamento.</li>
		<li>Conecte a E/S digital a um laptop para executar códigos Labview para controle de gás (Apêndice).</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Conecte um microdispensador ao nitrogênio enquanto outro ao ar comprimido, ambos com 5% de CO2. Defina ambos os gases para 2 psi. Conecte as saídas dos dispensadores em uma junção em T antes de entrar no dispositivo microfluídico.</li>
	<li>Usando um dispositivo testado contra vazamentos, caracterize a resposta transitória da modulação de oxigênio alternando os microdispensadores entre 5-21% de oxigênio, enquanto mede o oxigênio dissolvido na água com um sensor de oxigênio de fibra óptica (consulte a lista de equipamentos e os resultados representativos).</li>
</ol>
4. Configurando na microscopia
<ol>
	<li>Monte o dispositivo no aquecido stage no microscópio invertido.</li>
	<li>Conecte os gases 0% e 21% O2 ao dispositivo e calibre com o sensor de oxigênio.</li>
	<li>Conecte a porta de saída da microfluídica de glicose a um coletor de frações.</li>
	<li>Prepare o tampão de bicarbonato Krebs Ringer (KRB): 129 mM NaCl, 5 mM NaHCO3, 4.7 mM KCl, 1.2 mM KH2PO4, 1 mM CaCl2 · 2H2O, 1.2 mM MgSO4 · 7H2O, 10 mM HEPES pH 7.35-7.40, 2 mM de glicose basal e 5% de FBS.</li>
	<li>Preparar duas soluções-tampão contendo, respectivamente, 2 mM e 14 mM de glicose, em tubos cónicos de 50 ml, banhados em banho-maria a 37 °C.</li>
	<li>Conecte uma bomba peristáltica para extrair o tampão a 250 μl/min na tubulação. Flua a tubulação sobre uma placa de aquecimento a 37 °C antes de entrar no dispositivo microfluídico.</li>
	<li>Para corar as ilhotas, adicione Fura-2 AM em DMSO e Rh123 em etanol 100% a 2 ml de KRB para atingir concentrações finais de corante de 5 μM e 2,5 μM, respectivamente.</li>
	<li>Pegue ilhotas com uma pipeta de 10 μl e incube em corantes por 30 min a 37 ° C.</li>
	<li>Carregue aproximadamente 20 ilhotas no dispositivo através da entrada do microcanal de glicose. Direcione as ilhotas para a câmara preparando o tampão da saída de volta para a entrada.</li>
	<li>Perfunda as ilhotas em tampão por 10 min para lavar o excesso de corantes.</li>
</ol>
5. Executando a estimulação simultânea de oxigênio e glicose
<ol>
	<li>Forneça um pulso de estimulação de glicose com 5 min de linha de base estabelecida por KRB2, seguido por 15 min de estimulação de 14 mM e, em seguida, lave por 15 min em KRB2.</li>
	<li>Recorde o comprimento de onda de excitação de 340/380 nm para Fura-2 e 534 emissão para Rh123.</li>
	<li>Fazer medições de um pulso normal (14 mM normóxico) antes de cada experimento.</li>
	<li>Para modulação de oxigênio (hipóxia/hipóxia intermitente), aplique apenas fluxo tampão durante as etapas de estimulação e lavagem e nenhum fluxo em outras etapas, para minimizar distúrbios convectivos.</li>
	<li>Colete efluentes da saída de glicose em intervalos de 1 minuto para o ensaio de insulina ELISA.</li>
</ol>

<ol><li>Lo, J. F., Wang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Islet+Preconditioning+via+Multimodal+Microfluidic+Modulation+of+Intermittent+Hypoxia%5BTitle%5D)+AND+%22Anal.+Chem%22%5BJournal%5D)">Islet Preconditioning via Multimodal Microfluidic Modulation of Intermittent Hypoxia.</a> Anal. Chem. 84 (4), 1987-1993 (2012).</li>
<li>Qi, M., Barbaro, B., Wang, S., Wang, Y., Hansen, M., Oberholzer, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+Pancreatic+Islet+Isolation%3A+Part+I%3A+Digestion+and+Collection+of+Pancreatic+Tissue%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp.%22%5BJournal%5D)">Human Pancreatic Islet Isolation: Part I: Digestion and Collection of Pancreatic Tissue.</a> J. Vis. Exp.. , e1125(2009).</li>
<li>Qi, M., Barbaro, B., Wang, S., Wang, Y., Hansen, M., Oberholzer, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+Pancreatic+Islet+Isolation%3A+Part+II%3A+Purification+and+Culture+of+Human+Islets%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp.%22%5BJournal%5D)">Human Pancreatic Islet Isolation: Part II: Purification and Culture of Human Islets.</a> J. Vis. Exp.. , e1343(2009).</li>
<li>Shapiro, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Islet+Transplantation+in+Seven+Patients+with+Type+1+Diabetes+Mellitus+Using+a+Glucocorticoid-Free+Immunosuppressive+Regimen%5BTitle%5D)+AND+%22N.+Engl.+J.+Med%22%5BJournal%5D)">Islet Transplantation in Seven Patients with Type 1 Diabetes Mellitus Using a Glucocorticoid-Free Immunosuppressive Regimen.</a> N. Engl. J. Med. 343 (4), 230-238 (2000).</li>
<li>Adewola, A. F., Wang, Y., Harvat, T., Eddington, D. T., Lee, D., Oberholzer, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Multi-Parametric+Islet+Perifusion+System+within+a+Microfluidic+Perifusion+Device%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp.%22%5BJournal%5D)">A Multi-Parametric Islet Perifusion System within a Microfluidic Perifusion Device.</a> J. Vis. Exp.. , e1649(2010).</li>
<li>Mohammed, J. S., Wang, Y., Harvat, T. A., Oberholzer, J., Eddington, D. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microfluidic+device+for+multimodal+characterization+of+pancreatic+islets%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+Chip%22%5BJournal%5D)">Microfluidic device for multimodal characterization of pancreatic islets.</a> Lab Chip. 9, 97-106 (2009).</li>
<li>Carreras, A., Kayali, F., Zhang, J., Hirotsu, C., Wang, Y., Gozal, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Metabolic+Effects+Of+Intermittent+Hypoxia+In+Mice%3A+Steady+Versus+High+Frequency+Applied+Hypoxia+Daily+During+The+Rest+Period%5BTitle%5D)+AND+%22AJP+-+Regu+Physiol%22%5BJournal%5D)">Metabolic Effects Of Intermittent Hypoxia In Mice: Steady Versus High Frequency Applied Hypoxia Daily During The Rest Period.</a> AJP - Regu Physiol. 303 (7), 700-709 (2012).</li>
<li>Lee, E. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Time-dependent+changes+in+glucose+and+insulin+regulation+during+intermittent+hypoxia+and+continuous+hypoxia%5BTitle%5D)+AND+%22Eur.+J.+Appl.+Physiol%22%5BJournal%5D)">Time-dependent changes in glucose and insulin regulation during intermittent hypoxia and continuous hypoxia.</a> Eur. J. Appl. Physiol. , (2012).</li>
<li>Kane, B. J., Zinner, M. J., Yarmush, M. L., Toner, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Liver-specific+functional+studies+in+a+microfluidic+array+of+primary+mammalian+hepatocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Anal.+Chem%22%5BJournal%5D)">Liver-specific functional studies in a microfluidic array of primary mammalian hepatocytes.</a> Anal. Chem. 78, 4291-4298 (2006).</li>
<li>Lam, R. H. W., Kim, M. C., Thorsen, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Culturing+aerobic+and+anaerobic+bacteria+and+mammalian+cells+with+a+microfluidic+differential+oxygenator%5BTitle%5D)+AND+%22Anal.+Chem%22%5BJournal%5D)">Culturing aerobic and anaerobic bacteria and mammalian cells with a microfluidic differential oxygenator.</a> Anal. Chem. 81, 5918-5924 (2009).</li>
<li>Polinkovsky, M., Gutierrez, E., Levchenko, A., Groisman, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fine+temporal+control+of+the+medium+gas+content+and+acidity+and+on-chip+generation+of+series+of+oxygen+concentrations+for+cell+cultures%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+Chip%22%5BJournal%5D)">Fine temporal control of the medium gas content and acidity and on-chip generation of series of oxygen concentrations for cell cultures.</a> Lab Chip. 9, 1073-1084 (2009).</li>
<li>Mehta, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+measurement+and+control+of+oxygen+levels+in+microfluidic+poly%28dimethylsiloxane%29+bioreactors+during+cell+culture%5BTitle%5D)+AND+%22Biomed.+Microdev%22%5BJournal%5D)">Quantitative measurement and control of oxygen levels in microfluidic poly(dimethylsiloxane) bioreactors during cell culture.</a> Biomed. Microdev. 9 (2), 123-134 (2007).</li>
<li>Vollmer, A. P., Probstein, R. F., Gilbert, R., Thorsen, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+an+integrated+microfluidic+platform+for+dynamic+oxygen+sensing+and+delivery+in+a+flowing+medium%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+Chip%22%5BJournal%5D)">Development of an integrated microfluidic platform for dynamic oxygen sensing and delivery in a flowing medium.</a> Lab Chip. 5, 1059-1066 (2005).</li>
<li>Chen, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+oxygen+gradients+in+microfluidic+devices+for+cell+culture+using+spatially+confined+chemical+reactions%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+Chip%22%5BJournal%5D)">Generation of oxygen gradients in microfluidic devices for cell culture using spatially confined chemical reactions.</a> Lab Chip. 11, 3626-3633 (2011).</li>
<li>Lo, J. F., Sinkala, E., Eddington, D. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Oxygen+gradients+for+open+well+cellular+cultures+via+microfluidic+substrates%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+Chip%22%5BJournal%5D)">Oxygen gradients for open well cellular cultures via microfluidic substrates.</a> Lab Chip. 10, 2394-2401 (2010).</li>
</ol>

Os autores declaram que não têm interesses financeiros concorrentes.

As múltiplas modalidades integradas nesta técnica de hipóxia de ilhotas apresentam vários pontos observados aqui para solução de problemas. Primeiro, as ilhotas isoladas continuam a se degradar e se desintegrar em cultura devido às enzimas digestivas das células acinares. Padronizar experimentos para 1-2 dias após o isolamento das ilhotas é, portanto, fundamental para obter resultados consistentes. Em segundo lugar, o fluxo aquoso foi interrompido durante a hipóxia e a hipóxia intermitente para evitar a depuração convect...

A hipóxia dinâmica é importante em biologia, especificamente para transplantes de ilhotas
A hipóxia dinâmica é um importante parâmetro fisiológico e fisiopatológico em muitos tecidos biológicos. A mudança no oxigênio, por exemplo, é um potente sinal de desenvolvimento na angiogênese. Além disso, os padrões espaciais e temporais na hipóxia modulam o HIF1-alfa e desempenham papéis em doenças como o câncer de pâncreas. A hipóxia também é um fator de confusão que afeta os resultados do transplante de ilhotas. Recentemente, oscilações temporais de hipóxia, ou hipóxia intermitente (HI) demonstraram benefícios no "pré-condicionamento" das ilhotas1. No entanto, os efeitos da hipóxia estática e transitória na fisiologia das ilhotas ainda não foram bem compreendidos ou estudados, principalmente devido à falta de ferramentas apropriadas para controlar o microambiente das ilhotas.
As ilhotas são bem vascularizadas in vivo
As ilhotas pancreáticas são agregados esferoidais de 50-400 μm de células endócrinas, incluindo células beta e células alfa responsáveis pela homeostase da glicose. Quando as ilhotas são expostas à glicose estimuladora no sangue, a captação e a glicólise levam à produção de ATP, que abre os canais de potássio sensível ao ATP (KATP) e resulta no influxo de cálcio que desencadeia a exocitose dos grânulos de insulina. O oxigênio é importante para conduzir esse processo altamente metabólico e a secreção de insulina é significativamente influenciada pela dinâmica do fluxo sanguíneo e do suprimento de oxigênio, além dos gradientes de glicose. As ilhotas executam prontamente essa resposta glicose-insulina in vivo, pois são altamente perfundidas no pâncreas, cada uma dentro de um comprimento de célula de um vaso capilar. No entanto, a densa rede de capilares intrailhéus é removida pela colagenase durante o isolamento das ilhotas2,3. Consequentemente, os suprimentos de oxigênio e nutrientes são restritos a um perímetro de 100 μm devido a limitações de difusão.
As técnicas atuais têm sucesso limitado na recriação do microambiente das ilhotas
Recriar a dinâmica nativa de oxigênio e glicose das ilhotas, fundamental para modelar as condições fisiológicas e fisiopatológicas, é difícil de alcançar com câmaras hipóxicas padrão que requerem fluxo elaborado e carecem de monitoramento contínuo das funções das ilhotas. Além disso, as terapias de transplante para diabetes tipo I expõem ilhotas isoladas à hipóxia no sistema porta hepático4, que tem pO2 muito menor (<2%, 5-15 mmHg) em comparação com o pâncreas fisiológico (5,6%, 40 mmHg). Após o transplante, os enxertos de ilhotas levam duas semanas ou mais para serem revascularizados. Foi demonstrado que a exposição hipóxica prejudica o mecanismo de acoplamento glicose-insulina das ilhotas. Entre os fatores de acoplamento estímulo-secreção, a sinalização de cálcio, os potenciais mitocondriais e a cinética da insulina podem ser facilmente monitorados usando microfluídica. Nossa técnica microfluídica anterior demonstrou esse monitoramento em tempo real com modulação precisa do microambiente aquoso em torno de uma única ilhota5,6. No entanto, a quantificação do comprometimento hipóxico das ilhotas é frustrada pela falta de técnicas simultâneas de estimulação e monitoramento. Portanto, a combinação do controle microfluídico do oxigênio e do monitoramento das ilhotas pode melhorar os estudos de hipóxia das ilhotas.
A microfluídica pode recriar e modular o microambiente aquoso e de oxigênio
A técnica padrão para estudos de hipóxia de tecidos e cultura tem sido baseada em câmaras hipóxicas. Em geral, as câmaras hipóxicas fornecem concentrações únicas de oxigênio com tempos de equilíbrio em ~ 10-30 min, incompatíveis com a hipóxia dinâmica em escala de minutos. Dois estudos recentes usaram pequenas câmaras personalizadas para exposição intermitente à hipóxia em camundongos inteiros, com resultados conflitantes sobre a resposta à insulina induzida por glicose7,8. Tenha em mente que, no nível de todo o animal, o oxigênio respirado não é traduzido diretamente para o pO2 capilar das ilhotas, devido aos controles no sistema respiratório. Além disso, esses estudos não têm níveis padronizados de oxigênio, nem fornecem medidas em tempo real no nível do tecido das ilhotas.
Por outro lado, a microfluídica de oxigênio pode superar essas limitações controlando o oxigênio por meio de redes de canais de gás. Além disso, a microfluídica é compatível com imagens ao vivo durante a modulação do oxigênio, um feito atualmente não possível com câmaras hipóxicas padrão. Várias dessas novas abordagens microfluídicas utilizam a permeabilidade ao gás do polidimetilsiloxano para dissolver as concentrações de oxigênio em microcanais que fluem o meio sobre ascélulas-alvo 9-14. Esses dispositivos também integraram várias concentrações discretas de oxigênio, sensores de oxigênio baseados em fluorescência e até geração química de oxigênio no chip.
A microfluídica baseada em solvatação líquida tem dificuldade em manter gradientes estáveis e contínuos, pois depende da mistura convectiva, que é sensível às condições de fluxo. Em comparação, a técnica que usamos aqui se concentra em diminuir o caminho de difusão do fornecimento de oxigênio. A solvatação do gás e o fluxo de cisalhamento são eliminados pela difusão direta de oxigênio através de uma membrana semeada com células ou tecidos de ilhotas. Isso remove a microfluídica extra necessária para controlar a solvatação e evita tensão de cisalhamento desnecessária nas ilhotas, que por si só pode desencadear a liberação de insulina. Esta plataforma tem sido usada para demonstrar a regulação positiva de espécies reativas de oxigênio (ROS) em extremos hiperóxicos e hipóxicos (2-97% O2) em cultura de células1,15. Devido ao fornecimento direto de oxigênio e à remoção do fluxo de cisalhamento, nossa plataforma baseada em difusão fornece a solução microfluídica ideal para estudar a hipóxia das ilhotas.
Estimulação e monitoramento multimodal
A microfluídica baseada em difusão também traz benefícios adicionais quando adaptada para estudar a microfisiologia das ilhotas. Ao usar uma membrana como barreira de difusão, o líquido pode ser isolado das modulações de oxigênio, permitindo o controle de estímulos aquosos de glicose independentemente dos estímulos hipóxicos. Isso cria uma estimulação simultânea semelhante a um sanduíche que aponta espacialmente a entrega às ilhotas. Além disso, como o gás é modulado temporalmente por meio de microinjetores computadorizados, podemos modular a concentração de oxigênio de 21-0% digitalmente com tempo transitório inferior a 60 segundos. Os controles dinâmicos do microambiente de oxigênio e glicose no microscópio permitem um protocolo multimodal em tempo real que não seria possível ou extraordinariamente complicado usando câmaras hipóxicas padrão. Usando este dispositivo, a sinalização de cálcio (Fura-AM), os potenciais mitocondriais (Rodamina 123) e a cinética da insulina (ELISA) foram monitorados para fornecer uma imagem completa da resposta dinâmica glicose-insulina sob hipóxia.

<table><tr><tbody><td colspan = "4 ">< forte > reagente / material< / forte ></td></tr> <tr><td>Spinner</td><td>Laurell</td><td>WS-400</td><td></td></tr><tr><td>SU8</td><td>MicroChem</td><td>SU8-2150 / SU8-2100</td><td></td></tr><tr><td>Placa de aquecimento digital</td><td>PMC Dataplate</td><td>722A</td><td></td></tr><tr><td>Lâmpada de cura UV</td><td>OmniCure</td><td>S1000</td><td></td></tr><tr><td>PMDS</td><td>Dow Chemical</td><td>Sylgard 184</td><td></td></tr><tr><td>Câmara</td> de Vácuo <td>Corona Wand ETP</td><td>BD-20AC</td><td></td></tr><tr><td></td><td>Bel-Art</td><td>420220000</td><td></td></tr><tr><td>Microdispensadores</td><td>The Lee Company</td><td>IKTX0322000A</td><td></td></tr><tr>Rádio de<td>Energia 5 V e 20 V DC</td><td>Shack</td><td></td><td></td></tr><tr><td>NI USB</td><td>National Instrument</td><td>NI USB-6501</td><td></td></tr><tr><td>Termômetro</td><td>Omega Engineering, Inc.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Bomba Peristáltica</td><td>Gilson</td><td>Minipulse 2</td><td></td></tr><tr><td>Sensor de Oxigênio</td><td>Ocean Optics</td><td>NeoFox</td><td></td></tr><tr><td>Fraction Collector</td><td>Gilson</td><td>203</td><td></td></tr><tr><td>Pippette</td><td>Fisher Scientific</td><td>Finnpipette II 100&mu; l</td><td></td></tr><tr><td>Microscópio de Epifluorescência Invertida</td><td>Leica</td><td>DMI 4000B</td><td></td></tr><tr><td>Tubos Cônicos de 50 ml</td> Sondas Moleculares de Corante de Fluorescência Fura-2 <td>da Fisher Scientific</td><td></td><td></td></tr>, <tr><td>Sondas Moleculares</td> de<td>Corante de Fluorescência Rodamina 123</td> da Life Technologies, Meios de Cultura de Tecnologias <td></td><td></td>de</tr><tr><td></td><td></td> Vida Sigma-Aldrich RPMI-1640 <td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Sigma-Aldrich Glucose Sigma-Aldrich</td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Soro Bovino Albumina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td></td><td></td></tr><tr><td>30 in Tubos de Silicone</td><td>Cole-Parmer</td><td></td><td>1/16 in x 1/8 in 1.5 ml</td></tr><tr><td>Eppendorf Tubes</td><td>Fisher Scientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Y-connectors</td><td>Cole-Parmer</td><td></td><td>Conectores de Seringa de 1/16 in e 4 mm</td></tr><tr><td></td> Plugue Luer fêmea <td>Cole-Parmer</td><td></td> Conectores retos de <td>1/16 in</td></tr><tr>Conector<td>de</td><td>cotovelo Cole-Parmer</td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td>1/16 in</td></tr></tbody></table>

controle quantitativo e temporal de oxigênio microenvironment no ilhéu individual

Quantitative and Temporal Control of Oxygen Microenvironment at the Single Islet Level

Oxigenação simultânea e monitoramento de fatores de glicose no acoplamento estímulo-secreção em uma única técnica é fundamental para a modelagem de estados fisiopatológicos da ilhota hipóxia, especialmente em ambientes de transplantes. Técnicas de câmara de hipóxia padrão não pode modular os estímulos, ao mesmo tempo, nem fornecer monitoramento em tempo real dos fatores de glicose no acoplamento estímulo-secreção. Para superar estas dificuldades, aplicamos uma técnica de micro várias camadas de integrar tanto aquosa e modulações de fase gasosa através de uma membrana de difusão. Isto cria uma sanduíche estimulação em torno das ilhotas microscaled dentro do polidimetilsiloxano transparente dispositivo (PDMS), que permita o controlo dos factores de acoplamento acima mencionadas, através de microscopia de fluorescência. Além disso, a entrada de gás é controlado por um par de microdispensers, proporcionando, modulações quantitativos sub-hora de oxigénio entre 0-21%. Esta hipóxia intermitente é aplicada para investigar um novo fenômeno da ilhat pré-condicionamento. Além disso, armado com microscopia multimodal, fomos capazes de olhar para o cálcio detalhada e dinâmica do canal K ATP durante esses eventos hipóxicos. Nós encaramos hipóxia microfluídica, especialmente a técnica de dupla fase simultânea, como uma valiosa ferramenta no estudo de ilhotas, assim como muitos ex vivo tecidos.

Central para esta técnica de hipóxia de ilhotas é a capacidade de modular estímulos nas fases aquosa e gasosa na mesma câmara microfluídica com transientes em escala de minutos. Figura 1 mostra um resultado representativo das a) duplas estimulações e b) modulações rápidas medidas dentro da câmara de ilhotas. A modulação aquosa, demonstrada pela introdução de fluoresceína na câmara, atinge o equilíbrio em três a quatro minutos de mistura. Além disso, o oxigênio pode ser ajustado de 5 a 21% com transientes...

O controle microfluídico de oxigênio confere mais do que apenas conveniência e velocidade em relação às câmaras hipóxicas para experimentos biológicos. Especialmente quando implementado por difusão através de uma membrana, o oxigênio microfluídico pode fornecer modulações simultâneas de fase líquida e gasosa no nível de microescala. Esta técnica permite experimentos multiparamétricos dinâmicos críticos para o estudo da fisiopatologia das ilhotas.

Controle quantitativo e temporal de oxigênio Microenvironment no Ilhéu Individual

Simultaneous oxygenation and monitoring of glucose stimulus-secretion coupling factors in a single technique is critical for modeling pathophysiological ...

O objetivo geral deste procedimento é aplicar hipóxia intermitente em escala de minutos a ilhotas pancreáticas em escala micro para investigar os efeitos de pré-condicionamento. Isso é realizado primeiramente fabricando um dispositivo microfluídico multimodal com uma membrana fina permeável a gases. O segundo passo é criar um sistema computadorizado de modulação de oxigênio.Os olhinhos seguintes são cuidadosamente carregados no dispositivo, e então as microfluidicas de líquido e oxigênio são conectadas. O passo final consiste em coordenar a microscopia com as microfluidicas multimodais para visualizar os parâmetros dos olhinhos que são alterados durante a modulação de oxigênio. Em última análise, a técnica de olhinhos com hipóxia intermitente é utilizada para demonstrar que a resposta à glicose fica claramente prejudicada na hipóxia.Embora modulações temporais da hipóxia possam treinar os olhos para responder com menor comprometimento. A principal vantagem desta técnica em relação aos métodos existentes, como oxigênio dissolvido ou o uso de câmara hipóxica, é que a concentração de oxigênio pode ser fornecida às pálpebras em intervalos de tempo rápidos e minúsculos, sem estresse de cisalhamento provocado por fluxos complicados.Ele também permite o monitoramento em tempo real com microscopia de campo claro. Este método pode ajudar a responder perguntas fundamentais na área de transplante de Alli, como definir prejuízos provocados pela hipóxia em locais de transplante ou regimens de condicionamento prévio para melhorar os resultados do transplante. Assim, este método pode fornecer informações sobre a hipóxia em Alli.Ele também pode ser aplicado a outros tecidos e sistemas, como o sistema nervoso central, tecidos cardíacos, o rim e outros órgãos para transplante. A demonstração em vídeo deste método é essencial, pois muitos dos procedimentos de fabricação do dispositivo e manuseio da argola são difíceis de aprender devido à natureza inovadora e interdisciplinar da técnica, mas inerentemente desafiadora ou que requer familiarização. Comece fabricando a camada superior do dispositivo microfluídico.Para realizar isso, despeje as DGAs de PDMS pré-misturado em uma altura de 1,5 milímetro em uma placa de Petri vazia e cure-a a 80 graus Celsius por duas horas. Em seguida, fabrique a camada microfluídica de glicose com o molde da câmara de perfusão por meio do revestimento rotacional de duas camadas de 350 mícrons de espessura de SU 8 21 50 para formar uma única camada de 700 mícrons sobre uma pastilha de silício de quatro polegadas. Em seguida, exponha-a à luz UV utilizando a máscara fotolitográfica da camada microfluídica de glicose para transferir o padrão dos microcanais para a camada de SU 8.Lave a área não exposta com o revelador SU eight. Em seguida, despeje o PDMS pré-misturado DGA sobre o MA até uma altura de três milímetros e polimerize a 80 graus Celsius por duas horas. Após a polimerização, corte a camada microfluídica de glicose no formato desejado e use um furador de dois milímetros para formar as portas de entrada e saída, bem como um furador de oito milímetros de diâmetro para a câmara principal.Em seguida, fabrique o molde mestre de micropoços para imobilização das pálpebras aplicando, por rotação, uma camada de 100 mícrons de espessura de SU 8 2100 sobre um wafer de silício limpo de quatro polegadas e, depois, utilize litografia UV para transferir o padrão de micropoços para esta camada. Enxágue as áreas não expostas com revelador ao concluir o molde mestre de micropoços. Adicione duas camadas de 100 mícrons de PDMS por meio de revestimento por rotação a 900 RPM durante 30 segundos e, em seguida, cure por 10 minutos a 80 graus Celsius para produzir cada camada.Uma vez concluído, perfure as portas de entrada e saída com diâmetro de dois milímetros. Finalmente, fabrique o molde microfluídico para gás girando o SU 8 2100 até uma espessura de 100 mícrons, como na camada anterior, e transfira novamente os padrões microfluídicos para gás utilizando litografia UV. Remova com enxágue a área não exposta com revelador.Em seguida, despeje uma camada de 1,5 milímetro de espessura de PDMS sobre o molde mestre microfluídico a gás e polimerize a 80 graus Celsius por duas horas. Então, corte o PDMS na forma desejada com a lâmina de barbear. Em seguida, perfure orifícios de entrada e saída com diâmetro de dois milímetros na camada de cobertura, alinhando-os com as posições correspondentes nas demais camadas, para unir as múltiplas camadas. Primeiro, prepare-os limpando as superfícies com fita adesiva, expondo-as a um arco de corona e, em seguida, alinhando manualmente as camadas na seguinte ordem. Primeiro, una a membrana à camada de gás inferior com os micropoços voltados para cima. Em seguida, una a camada microfluídica de glicose sobre a membrana com micropoços.Por fim, una a camada de entrada e saída na parte superior, encapsulando todo o conjunto. Auxilie na formação de uma ligação firme adicionando um peso de um quilograma sobre o conjunto e aquecendo-o a 100 graus Celsius por três horas. Em seguida, verifique vazamentos.Teste o dispositivo carregando água na camada aquosa, submergindo o dispositivo e fazendo passar ar pela camada gasosa com a seringa, observando a presença de vazamentos. Por fim, esterilize os dispositivos isentos de vazamentos passando etanol a 70% pela camada aquosa durante um a dois minutos. Configure os microdispensadores conectando primeiro os cabos de controle dos microdispensadores às unidades motoras incluídas.Em seguida, conecte os controladores à placa de E/S digital nas portas correspondentes aos seus controles no LabVIEW. Depois, conecte as fontes de alimentação CC de cinco volts e 20 volts aos contatos correspondentes nas unidades de acionamento e conecte a E/S digital a um laptop para executar os códigos do LabVIEW para controle de gás, conforme descrito no apêndice do protocolo textual complementar. Em seguida, conecte um microdispensador ao nitrogênio e o outro ao ar comprimido, ambos contendo 5% de dióxido de carbono, e ajuste ambos os gases para dois PSI. Conecto as saídas dos dispensadores em uma junção em T antes de entrarem no dispositivo microfluídico.Em seguida, fixe o dispositivo no estágio aquecido de um microscópio invertido com oxigênio a 0% e 21% conectado ao dispositivo. Depois, posicione um sensor de oxigênio de fibra óptica na saída de fluido do dispositivo para medir em tempo real o oxigênio dissolvido na saída. Em seguida, conecte o dispositivo a uma bomba peristáltica e inicie o fluxo de água através do dispositivo a 250 microlitros por minuto.Caracterize a resposta transitória da modulação de oxigênio alternando os microdispensadores entre 5 e 21% de oxigênio. Conecte uma bomba peristáltica ao dispositivo microfluídico e posicione a tubulação sobre uma placa aquecedora de 37 graus Celsius para aquecer o fluido antes de ele entrar no dispositivo microfluídico. Além disso, conecte a porta de saída dos microfluídicos de glicose a um coletor de frações para iniciar a dissecção de camundongos C57 black six e isolar ilhotas pancreáticas por digestão com colagenase e separação em gradiente de densidade Ficoll, conforme descrito nos vídeos a seguir disponíveis no JoVE, uma vez isoladas.Incube os fragmentos oculares em meio RPMI 1640 contendo 10% de FBS, 1% de penicilina-estreptomicina e 20 milimolares de HEPES em placas de Petri por 24 a 48 horas. Utilize os fragmentos oculares em até dois dias para garantir resultados consistentes. Em seguida, prepare tampão de Ringer-Krebs bicarbonato fresco conforme descrito no protocolo de texto associado, com uma solução contendo dois milimolares de glicose e outra contendo 14 milimolares de glicose.Aqueça as soluções em tubos cónicos de 50 mililitros colocando-os em um banho-maria a 37 graus Celsius. Em seguida, prepare a coloração para os clipeletes isolados adicionando cinco micromolares de 4:02 AM e DMSO e 2,5 micromolares de RH 1 23 e etanol 100% a dois mililitros do tampão de Krebs contendo dois milimolares de glicose. A seguir, recolha os clipeletes com uma pipeta de 10 microlitros e incube-os na coloração por 30 minutos a 37 graus Celsius.Uma vez coradas, carregue aproximadamente 20 placas oculares no dispositivo através da entrada do microcanal de glicose. Direcione as placas oculares para a câmara mediante tampão de condicionamento do efluente de volta para a entrada. Em seguida, perfunda as placas oculares e o tampão por 10 minutos para remover os corantes em excesso.Primeiro, aspire o tampão bicarbonato de Ringer de dois milimolares pelo sistema durante cinco minutos para estabelecer uma linha de base normal do pulso. Em seguida, estimule a câmara com o tampão de glicose de 14 milimolares por 15 minutos, seguido por uma lavagem de 15 minutos com o tampão de glicose de dois milimolares. Durante esse processo, registre a emissão em 510 nanômetros excitando a 340 nanômetros e 380 nanômetros.Além disso, registre a emissão em 530 de RH 1 23 excitando o corante em 480 nanômetros. Para minimizar distúrbios convectivos durante a modulação de oxigênio, aplique fluxo de tampão durante os passos de estimulação e lavagem, e certifique-se de interromper o fluxo nos demais passos durante o teste. Colete o efluente da saída de glicose em intervalos de um minuto para uso em análises adicionais. Usando a abordagem microfluídica mostrada neste vídeo, é possível regular rapidamente a porcentagem de oxigênio que flui próximo à membrana fina de PDMS utilizando microinjetores computadorizados.Aqui está um exemplo dessa modulação variando de um minuto a seis minutos. Também é possível fornecer modulações quantitativas inferiores a um minuto de oxigênio entre dois e 8,5 partes por milhão, fornecendo oxigênio entre 5 e 21%. A linha azul mostra a porcentagem de oxigênio fornecido e a verde representa o oxigênio dissolvido resultante em partes por milhão. Quando esse ciclo é aplicado para criar hipóxia intermitente nos orifícios, pode-se observar os benefícios do condicionamento prévio dos orifícios contra a hipóxia, em comparação com um pulso normóxico irregular, ao observar a melhoria na razão for após o tratamento. Os efeitos da hipóxia e da hipóxia intermitente podem ser observados no overshoot e no amortecimento da oscilação dos transientes de cálcio, como mostrado aqui, em azul, a resposta normóxica.Em vermelho está a resposta hipóxica, e a linha verde representa a resposta hipóxica condicionada. Aqui são mostradas as medidas de cálcio, potencial mitocondrial e insulina. São resultados de microscopia fluorescente em tempo real e ensaio off-chip EISA utilizando o efluente microfluídico do sistema. Juntos, esses dados começam a compor uma visão multimodal da resposta glicose-insulina sob hipóxia transitória.Uma vez dominada, essa técnica pode ser concluída em dois dias, se realizada corretamente: um dia para a fabricação do dispositivo e para o isolamento das células da pálpebra e outro dia para os experimentos com a pálpebra propriamente ditos. Ao realizar este procedimento, é importante lembrar-se de verificar a concentração de oxigênio fornecida, casando o gás no ator do dispositivo após seu desenvolvimento. Essa técnica abriu caminho para pesquisadores na área de fisiologia microtissular fetal e de outros tecidos explorarem como a hipóxia e os padrões temporários de oxigênio podem afetar doenças como diabetes, cardiovasculares e distúrbios neurológicos.Após assistir a este vídeo, você deverá ter uma boa compreensão de como controlar a modulação de oxigênio, manipular microtecidos e gerar medições repetíveis e significativas de hipóxia tecidual utilizando dispositivos microfluídicos multimodais.

quantitative-temporal-control-oxygen-microenvironment-at-single-islet

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Bioengenharia

Um dispositivo perifusion microfluídicos ilhota foi desenvolvido para a avaliação dinâmica da secreção de insulina de ilhotas múltiplo e imagens de fluorescência simultânea de influxo de cálcio e mitocondrial possíveis mudanças.

A Multi-Parametric Sistema Perifusion Islet dentro de um dispositivo Perifusion microfluídicos

Ensaiando in vitro a função das células β usando o mouse ilhotas isoladas de Langerhans é um componente importante no estudo da fisiopatologia do diabetes e terapêutica. Embora muitas aplicações a jusante estão disponíveis, este protocolo descreve especificamente a medida da intracelular monofosfato cíclico de adenosina (AMPc) como um parâmetro essencial para definir a função das células β.

Um Método para Mouse ilhotas pancreáticas Isolamento e intracelular cAMP Determinação

O objetivo do presente protocolo é medir o efeito da glicose mediada por alterações de respiração mitocondrial na presença de compostos naturais intactos 832/13 beta células usando respirometria de alta resolução.

Respirometria de alta resolução para medir a função mitocondrial das células-Beta intacto na presença de compostos naturais

Aqui, apresentamos um protocolo para imagens e quantificar a dinâmica do cálcio em populações heterogêneas de células, como células de ilhotas pancreáticas. Os repórteres fluorescentes são entregues na camada periférica de células dentro da ilhota, que é então imobilizada e imagemda, e a análise por célula da dinâmica da intensidade da fluorescência é realizada.

Dinâmica de cálcio de imagem em subpopulações de células de ilhotas pancreáticas do rato

Aqui, nós apresentamos um protocolo para gerar de alta qualidade, dados do transcriptoma em grande escala das únicas pilhas das ilhotas pancreatic humanas isoladas usando uma tecnologia de sequenciamento microfluídico do RNA da único-pilha da gota-baseada.

Sequenciamento de RNA de célula única e análise de ilhotas pancreáticas humanas

Este protocolo demonstra a medida precisa e reproduzível do consumo de oxigênio em ilhotas pancreáticas de primatas não humanos. As técnicas de carregamento de ilhotas e revestimento da microplaca fornecem uma estrutura para a medição eficiente da respiração em outros tipos de esferóides cultivados.

Análise do consumo de oxigênio em ilhotas pancreáticas de primatas não humanos

O objetivo deste protocolo é monitorar continuamente a dinâmica do processo de engrafamento da ilhota pancreática humana e o acolhimento contribuinte versus células doadoras. Isso é feito transplantando ilhotas humanas na câmara anterior do olho (ACE) de um NOD. (Cg)-Gt(ROSA)26Sortm4-Rag2-/-receptor do mouse seguido de repetidas imagens de 2 fótons.

Imagem longitudinal in Vivo e quantificação de células hospedeiras pancreáticas humanas na câmara de olho anterior

Este protocolo descreve um método para a aquisição sincrônica e o co-registro de eventos de sinalização intracelular e a secreção de insulina e glucagon por pseudoilhotas humanas primárias usando a entrega adenoviral de um biossensor cíclico de adenosina monofosfato (AMPc), um detector de diferença de AMPc in situ (cADDis) e um sistema de microperfusão.

Sistema de Pseudoilhotas Humanas para Avaliação Síncrona da Dinâmica de Biossensores Fluorescentes e Perfis Secretores de Hormônios

Aqui, fornecemos detalhes sobre a realização da secreção de insulina estimulada por glicose (GSIS) via perfusão através da vasculatura de camundongos com um pâncreas intacto como uma técnica adicional para avaliar a função pancreática endócrina com redução de possíveis fatores de confusão.

Secreção de insulina estimulada por glicose via perfusão através da vasculatura de camundongos com pâncreas intacto

Este protocolo apresenta um método para fabricar um chip microfluídico de camada dupla e analisar o crescimento microbiano sob oscilações rápidas de oxigênio. O desempenho do dispositivo foi validado por meio de sensoriamento de oxigênio em canais de fluidos e cultivo microbiano.

Criando oscilações rápidas de oxigênio na análise de crescimento microbiano de célula única usando um dispositivo microfluídico de camada dupla

Este protocolo descreve um método padronizado para colheita cirúrgica, digestão enzimática e purificação por gradiente de densidade de ilhéus pancreáticos de rato Lewis, permitindo preparações de alto rendimento e alta pureza para uso direto em transplantes ou estudos in vitro .

Isolamento e purificação de ilhotas pancreáticas a partir de ratos Lewis usando digestão enzimática e separação por gradiente de densidade

Aprenda a controlar oxigênio em ilhotas pancreáticas usando dispositivos microfluídicos multimodais. Este método permite modulação precisa e monitoramento em tempo real da resposta à glicose sob hipóxia.

Controle quantitativo e temporal de oxigênio Microenvironment no Ilhéu Individual

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