Controle quantitativo e temporal de oxigênio Microenvironment no Ilhéu Individual

O objetivo geral deste procedimento é aplicar hipóxia intermitente em escala de minutos a ilhotas pancreáticas em escala micro para investigar os efeitos de pré-condicionamento. Isso é realizado primeiramente fabricando um dispositivo microfluídico multimodal com uma membrana fina permeável a gases. O segundo passo é criar um sistema computadorizado de modulação de oxigênio.

Os olhinhos seguintes são cuidadosamente carregados no dispositivo, e então as microfluidicas de líquido e oxigênio são conectadas. O passo final consiste em coordenar a microscopia com as microfluidicas multimodais para visualizar os parâmetros dos olhinhos que são alterados durante a modulação de oxigênio. Em última análise, a técnica de olhinhos com hipóxia intermitente é utilizada para demonstrar que a resposta à glicose fica claramente prejudicada na hipóxia.

Embora modulações temporais da hipóxia possam treinar os olhos para responder com menor comprometimento. A principal vantagem desta técnica em relação aos métodos existentes, como oxigênio dissolvido ou o uso de câmara hipóxica, é que a concentração de oxigênio pode ser fornecida às pálpebras em intervalos de tempo rápidos e minúsculos, sem estresse de cisalhamento provocado por fluxos complicados.

Ele também permite o monitoramento em tempo real com microscopia de campo claro. Este método pode ajudar a responder perguntas fundamentais na área de transplante de Alli, como definir prejuízos provocados pela hipóxia em locais de transplante ou regimens de condicionamento prévio para melhorar os resultados do transplante. Assim, este método pode fornecer informações sobre a hipóxia em Alli.

Ele também pode ser aplicado a outros tecidos e sistemas, como o sistema nervoso central, tecidos cardíacos, o rim e outros órgãos para transplante. A demonstração em vídeo deste método é essencial, pois muitos dos procedimentos de fabricação do dispositivo e manuseio da argola são difíceis de aprender devido à natureza inovadora e interdisciplinar da técnica, mas inerentemente desafiadora ou que requer familiarização. Comece fabricando a camada superior do dispositivo microfluídico.

Para realizar isso, despeje as DGAs de PDMS pré-misturado em uma altura de 1,5 milímetro em uma placa de Petri vazia e cure-a a 80 graus Celsius por duas horas. Em seguida, fabrique a camada microfluídica de glicose com o molde da câmara de perfusão por meio do revestimento rotacional de duas camadas de 350 mícrons de espessura de SU 8 21 50 para formar uma única camada de 700 mícrons sobre uma pastilha de silício de quatro polegadas. Em seguida, exponha-a à luz UV utilizando a máscara fotolitográfica da camada microfluídica de glicose para transferir o padrão dos microcanais para a camada de SU 8.

Lave a área não exposta com o revelador SU eight. Em seguida, despeje o PDMS pré-misturado DGA sobre o MA até uma altura de três milímetros e polimerize a 80 graus Celsius por duas horas. Após a polimerização, corte a camada microfluídica de glicose no formato desejado e use um furador de dois milímetros para formar as portas de entrada e saída, bem como um furador de oito milímetros de diâmetro para a câmara principal.

Em seguida, fabrique o molde mestre de micropoços para imobilização das pálpebras aplicando, por rotação, uma camada de 100 mícrons de espessura de SU 8 2100 sobre um wafer de silício limpo de quatro polegadas e, depois, utilize litografia UV para transferir o padrão de micropoços para esta camada. Enxágue as áreas não expostas com revelador ao concluir o molde mestre de micropoços. Adicione duas camadas de 100 mícrons de PDMS por meio de revestimento por rotação a 900 RPM durante 30 segundos e, em seguida, cure por 10 minutos a 80 graus Celsius para produzir cada camada.

Uma vez concluído, perfure as portas de entrada e saída com diâmetro de dois milímetros. Finalmente, fabrique o molde microfluídico para gás girando o SU 8 2100 até uma espessura de 100 mícrons, como na camada anterior, e transfira novamente os padrões microfluídicos para gás utilizando litografia UV. Remova com enxágue a área não exposta com revelador.

Em seguida, despeje uma camada de 1,5 milímetro de espessura de PDMS sobre o molde mestre microfluídico a gás e polimerize a 80 graus Celsius por duas horas. Então, corte o PDMS na forma desejada com a lâmina de barbear. Em seguida, perfure orifícios de entrada e saída com diâmetro de dois milímetros na camada de cobertura, alinhando-os com as posições correspondentes nas demais camadas, para unir as múltiplas camadas.

Primeiro, prepare-os limpando as superfícies com fita adesiva, expondo-as a um arco de corona e, em seguida, alinhando manualmente as camadas na seguinte ordem. Primeiro, una a membrana à camada de gás inferior com os micropoços voltados para cima. Em seguida, una a camada microfluídica de glicose sobre a membrana com micropoços.

Por fim, una a camada de entrada e saída na parte superior, encapsulando todo o conjunto. Auxilie na formação de uma ligação firme adicionando um peso de um quilograma sobre o conjunto e aquecendo-o a 100 graus Celsius por três horas. Em seguida, verifique vazamentos.

Teste o dispositivo carregando água na camada aquosa, submergindo o dispositivo e fazendo passar ar pela camada gasosa com a seringa, observando a presença de vazamentos. Por fim, esterilize os dispositivos isentos de vazamentos passando etanol a 70% pela camada aquosa durante um a dois minutos. Configure os microdispensadores conectando primeiro os cabos de controle dos microdispensadores às unidades motoras incluídas.

Em seguida, conecte os controladores à placa de E/S digital nas portas correspondentes aos seus controles no LabVIEW. Depois, conecte as fontes de alimentação CC de cinco volts e 20 volts aos contatos correspondentes nas unidades de acionamento e conecte a E/S digital a um laptop para executar os códigos do LabVIEW para controle de gás, conforme descrito no apêndice do protocolo textual complementar. Em seguida, conecte um microdispensador ao nitrogênio e o outro ao ar comprimido, ambos contendo 5% de dióxido de carbono, e ajuste ambos os gases para dois PSI. Conecto as saídas dos dispensadores em uma junção em T antes de entrarem no dispositivo microfluídico.

Em seguida, fixe o dispositivo no estágio aquecido de um microscópio invertido com oxigênio a 0% e 21% conectado ao dispositivo. Depois, posicione um sensor de oxigênio de fibra óptica na saída de fluido do dispositivo para medir em tempo real o oxigênio dissolvido na saída. Em seguida, conecte o dispositivo a uma bomba peristáltica e inicie o fluxo de água através do dispositivo a 250 microlitros por minuto.

Caracterize a resposta transitória da modulação de oxigênio alternando os microdispensadores entre 5 e 21% de oxigênio. Conecte uma bomba peristáltica ao dispositivo microfluídico e posicione a tubulação sobre uma placa aquecedora de 37 graus Celsius para aquecer o fluido antes de ele entrar no dispositivo microfluídico. Além disso, conecte a porta de saída dos microfluídicos de glicose a um coletor de frações para iniciar a dissecção de camundongos C57 black six e isolar ilhotas pancreáticas por digestão com colagenase e separação em gradiente de densidade Ficoll, conforme descrito nos vídeos a seguir disponíveis no JoVE, uma vez isoladas.

Incube os fragmentos oculares em meio RPMI 1640 contendo 10% de FBS, 1% de penicilina-estreptomicina e 20 milimolares de HEPES em placas de Petri por 24 a 48 horas. Utilize os fragmentos oculares em até dois dias para garantir resultados consistentes. Em seguida, prepare tampão de Ringer-Krebs bicarbonato fresco conforme descrito no protocolo de texto associado, com uma solução contendo dois milimolares de glicose e outra contendo 14 milimolares de glicose.

Aqueça as soluções em tubos cónicos de 50 mililitros colocando-os em um banho-maria a 37 graus Celsius. Em seguida, prepare a coloração para os clipeletes isolados adicionando cinco micromolares de 4:02 AM e DMSO e 2,5 micromolares de RH 1 23 e etanol 100% a dois mililitros do tampão de Krebs contendo dois milimolares de glicose. A seguir, recolha os clipeletes com uma pipeta de 10 microlitros e incube-os na coloração por 30 minutos a 37 graus Celsius.

Uma vez coradas, carregue aproximadamente 20 placas oculares no dispositivo através da entrada do microcanal de glicose. Direcione as placas oculares para a câmara mediante tampão de condicionamento do efluente de volta para a entrada. Em seguida, perfunda as placas oculares e o tampão por 10 minutos para remover os corantes em excesso.

Primeiro, aspire o tampão bicarbonato de Ringer de dois milimolares pelo sistema durante cinco minutos para estabelecer uma linha de base normal do pulso. Em seguida, estimule a câmara com o tampão de glicose de 14 milimolares por 15 minutos, seguido por uma lavagem de 15 minutos com o tampão de glicose de dois milimolares. Durante esse processo, registre a emissão em 510 nanômetros excitando a 340 nanômetros e 380 nanômetros.

Além disso, registre a emissão em 530 de RH 1 23 excitando o corante em 480 nanômetros. Para minimizar distúrbios convectivos durante a modulação de oxigênio, aplique fluxo de tampão durante os passos de estimulação e lavagem, e certifique-se de interromper o fluxo nos demais passos durante o teste. Colete o efluente da saída de glicose em intervalos de um minuto para uso em análises adicionais. Usando a abordagem microfluídica mostrada neste vídeo, é possível regular rapidamente a porcentagem de oxigênio que flui próximo à membrana fina de PDMS utilizando microinjetores computadorizados.

Aqui está um exemplo dessa modulação variando de um minuto a seis minutos. Também é possível fornecer modulações quantitativas inferiores a um minuto de oxigênio entre dois e 8,5 partes por milhão, fornecendo oxigênio entre 5 e 21%. A linha azul mostra a porcentagem de oxigênio fornecido e a verde representa o oxigênio dissolvido resultante em partes por milhão. Quando esse ciclo é aplicado para criar hipóxia intermitente nos orifícios, pode-se observar os benefícios do condicionamento prévio dos orifícios contra a hipóxia, em comparação com um pulso normóxico irregular, ao observar a melhoria na razão for após o tratamento. Os efeitos da hipóxia e da hipóxia intermitente podem ser observados no overshoot e no amortecimento da oscilação dos transientes de cálcio, como mostrado aqui, em azul, a resposta normóxica.

Em vermelho está a resposta hipóxica, e a linha verde representa a resposta hipóxica condicionada. Aqui são mostradas as medidas de cálcio, potencial mitocondrial e insulina. São resultados de microscopia fluorescente em tempo real e ensaio off-chip EISA utilizando o efluente microfluídico do sistema. Juntos, esses dados começam a compor uma visão multimodal da resposta glicose-insulina sob hipóxia transitória.

Uma vez dominada, essa técnica pode ser concluída em dois dias, se realizada corretamente: um dia para a fabricação do dispositivo e para o isolamento das células da pálpebra e outro dia para os experimentos com a pálpebra propriamente ditos. Ao realizar este procedimento, é importante lembrar-se de verificar a concentração de oxigênio fornecida, casando o gás no ator do dispositivo após seu desenvolvimento. Essa técnica abriu caminho para pesquisadores na área de fisiologia microtissular fetal e de outros tecidos explorarem como a hipóxia e os padrões temporários de oxigênio podem afetar doenças como diabetes, cardiovasculares e distúrbios neurológicos.

Após assistir a este vídeo, você deverá ter uma boa compreensão de como controlar a modulação de oxigênio, manipular microtecidos e gerar medições repetíveis e significativas de hipóxia tecidual utilizando dispositivos microfluídicos multimodais.