Protocolos otimizados para

O objetivo deste trabalho é demonstrar como preparar uma suspensão lipídica de micobactéria altamente viável. Para injeção em camundongos nu. Manteremos a vida do bass a partir de um camundongo infectado, preferencialmente durante o estágio inicial da infecção.

Para garantir rendimentos altamente viáveis de árias, eutanizar o animal dentro da câmara de segurança biológica. Segurar o pulso traseiro com pinças hemostáticas. Cortá-los com tesouras e imergir em iodo 2% durante 20 minutos para descontaminação. Manter a posição do ponto com a almofada da pata voltada para cima.

Colete o tecido mole. Usando uma lâmina de bisturi, remova os ossos da primeira e da quinta falanges para facilitar a homogeneização do tecido. Coloque o tecido em uma placa de Petri estéril. Remova a epiderme.

Corte o tecido granulomatoso em pequenos pedaços com uma tesoura e aguarde o cálculo posterior do rendimento do tecido. Transfira os pequenos pedaços para um tubo contendo um mL de solução salina balanceada de Hank. Adicione mais um mL de Hank's e homogeneíze o tecido três vezes, por 15 segundos cada vez, na velocidade quatro.

Coloque um filtro celular em um tubo cônico estéril de 50 ml. Pipete a suspensão sobre o filtro e deixe a solução passar por gravidade. Para eliminar os detritos, adicione mais dois mL de Hanks à suspensão e homogeneíze-a novamente.

Usando o mesmo ciclo, passe a suspensão por esta peneira. Encaixe a peneira adicionando alças. Para atingir o volume total da suspensão de nove ml, adicione um ml de solução de tripsina a 0,5% à suspensão para obter uma concentração final de 0,05%.

Misture invertendo suavemente o tubo incubado a 37 graus Celsius por 60 minutos. Após a incubação, ajuste o volume da suspensão a quatro mL adicionando solução salina estéril, centrifugue a 1700 ×g por 30 minutos a quatro graus Celsius, descarte o sobrenadante e ressuspenda o pellet batendo levemente no tubo. Adicione um mL de solução salina sérica e misture.

Transfira a suspensão para um novo tubo. Homogeneíze a suspensão vascular utilizando uma seringa de insulina de um ml com agulha de 26 graus enquanto transfere a suspensão para um novo tubo. Realize o controle microbiológico da suspensão colocando duas gotas do meio 18, sete H nove infusão cerebral cardíaca.

Incubar 11 Stein Genesen a 37 graus Celsius. Em seguida, seguir os procedimentos rotineiros de controle microbiológico. Para coloração com código Z.

Prepare uma diluição de um para 10 e uma para cem da suspensão S em solução salina. Homogeneíze cada diluição antes de preparar essas lâminas para contagem; prepare três lâminas desenhando três círculos de diâmetro interno de 10 milímetros sobre a superfície de cada lâmina, utilizando uma caneta permanente.

Agora circunde os círculos com uma caneta de imunohistoquímica. Rotule essas lâminas usando um lápis número dois, preparando-as para as três concentrações de soro: sem diluição, 1:10 e 1:100.

Pipete cinco microlitros da solução de soro fenólica e 10 microlitros da suspensão salivar em cada círculo, homogeneíze e espalhe a suspensão uniformemente por toda a área do círculo. Utilizando o cabo de um alça descartável, coloque essas lâminas sobre uma mesa nivelada para secar após a secagem. Fixe-as passando essas lâminas três vezes pela chama azul com as suspensões salivares voltadas para cima.

Realize um código Zuni sustentado. Examine esses lâminas. As três diluições.

Escolha a diluição mais apropriada para a contagem de sários. Prepare 200 microlitros de suspensão de sários mortos por autoclavagem da suspensão vascular durante 30 minutos a 121 graus Celsius. Utilize o kit de viabilidade bacteriana com contraluz viva/morta L 7 0 0 7 para coloração fluorescente do lipídio microbacteriano.

Prepare uma diluição de 1 para 10 da solução A e uma diluição de 1 para 20 da solução B imediatamente antes do uso. A cada 200 microlitros da suspensão vascular original não diluída e inativada, adicione 3,6 microlitros da solução A diluída e seis microlitros da solução B diluída. Após 15 minutos de incubação no escuro, centrifugue a suspensão a 10.600 ×g durante cinco minutos a quatro graus Celsius. Remova o sobrenadante com a pipeta.

Suspenda o pellet em 50 microlitros de glicerol a 10%, homogeneíze-o por pipetagem para cima e para baixo. Coloque oito microlitros de cada suspensão em uma lâmina de vidro e cubra com uma lamínula pequena. Proteja-a da luz.

Observe as suspensões ao microscópio fluorescente. Prepare uma suspensão com uma concentração de 10 a sete BA lip por ml, que um ml do meio de congelamento em cada criovial. Em seguida, adicione 150 microlitros da suspensão S a um ml do meio de congelamento e homogeneíze-a invertendo o tubo.

Coloque o tubo criogênico dentro do recipiente de congelamento. Mantenha o recipiente a menos 80 graus Celsius por pelo menos 24 horas. Transfira os tubos para uma caixa de armazenamento e mantenha-os a menos 80 graus Celsius para descongelamento.

Descongele a suspensão congelada em banho-maria ajustado a 37 graus Celsius. Transfira a suspensão para um tubo cônico contendo 20 mL de solução salina estéril. Centrifugue para concentrar.

A balina seguiu o protocolo Z de sustentação para contagem e o protocolo de coloração fluorescente para determinação de variabilidade. Prepare uma suspensão contendo de 10 a oito BA por refeição, homogeneíze a suspensão antes de inocular cada animal. Retire cem microlitros com uma seringa de insulina e inocule trinta microlitros nas almofadas plantares traseiras de cada animal na determinação de viabilidade.

A fluorescência verde é observada em todos os BAI e a fluorescência vermelha apenas naquele bai. Quando esses BAI são o controle sem mancha, observa-se a mesma intensidade de luz verde e vermelha de BAI. A inoculação de M Lepar congelado por períodos diferentes resulta em um aumento de 10 a 1000 vezes no número de BAI recuperados após sete meses.

Como observação final, gostaríamos de acrescentar que, como o IL leid não cresce in vitro, este protocolo permite uma maneira rápida e fácil de manter o yl Leid viável disponível para usos posteriores no laboratório.