Motor Nerve transecção e Time-lapso de Comportamentos de células gliais em Zebrafish ao vivo

O objetivo geral deste procedimento é obter imagens em lapso de tempo do comportamento das células gliais após lesão do nervo periférico em larvas vivas de peixe-zebra. Isso é realizado primeiramente montando larvas de peixe-zebra anestesiadas em agarose de ponto de fusão baixo em placas de Petri com fundo de vidro e posicionando-as com uma agulha de dissecação. Em seguida, as larvas montadas são colocadas no microscópio confocal.

Um nervo é selecionado para ablação e uma imagem é adquirida dos axônios e células gliais do nervo não lesionado. Em seguida, são selecionadas ROIs ao longo do nervo e o laser é disparado para ablar as áreas selecionadas, criando uma secção nervosa. Por fim, os axônios e as células gliais são submetidos a imagens de lapso de tempo após a secção nervosa.

No final, podem ser obtidos resultados que mostram o comportamento dinâmico de células gliais durante a degeneração e regeneração nervosas por meio de microscopia confocal com lapso de tempo. Este método pode ajudar a responder perguntas fundamentais nas áreas de regeneração e biologia das células gliais, como: como as células gliais respondem à lesão nervosa? E como diferentes subtipos de células gliais coordenam seu comportamento durante a degeneração e regeneração?

Após cruzar adultos de peixe-zebra contendo transgenes que marcam com fluorescência neurônios motores e tipos celulares gliais de interesse e incubarem os embriões por 24 horas pós-fertilização ou HPF, remova a água dos ovos e substitua por água com um inibidor de pigmentação, como PTU (1-fenil-2-tioureia), antes de devolver os embriões ao incubador. A partir desse momento até aproximadamente 96 HPF, utilize um microscópio estereoscópico com fluorescência para selecionar embriões que apresentem o gene fluorescente desejado. Transfira os embriões positivos para água de ovos fresca contendo PTU e devolva-os ao incubador.

Quando as larvas atingirem seis dias pós-fertilização ou DPF, selecione alguns embriões para montagem e transfira-os para um recipiente menor. Remova a água do recipiente e substitua imediatamente por água de ovo PTU com 0,02% de trica, incubando as larvas no anestésico por aproximadamente cinco minutos. Coloque um Eloqua de ágarose de baixo ponto de fusão a 0,8%, previamente preparado de acordo com o protocolo descrito no texto, em um béquer com água da torneira e aqueça no micro-ondas.

Durante 30 segundos ou até que o ágar derreta, deixe o béquer esfriar até que o tubo de ágar esteja morno ao toque. Em seguida, transfira uma larva anestesiada para um recipiente de vidro com fundo de 35 milímetros. Remova toda a água presente no recipiente.

Em seguida, cubra imediatamente as larvas com quantidade suficiente de aros morno para preencher a parte do prato com fundo de vidro. À medida que o agros endurece, use uma agulha de dissecação para posicionar as larvas de lado. Em seguida, incline levemente para as costas, certificando-se de que a larva montada esteja tocando o vidro na parte inferior do prato, o que é necessário para a lesão e a aquisição de imagens.

Use a agulha para manter as larvas em posição até que o ágar solidifique e as larvas fiquem imobilizadas. Em seguida, pipete lentamente água trica suficiente na placa para cobrir completamente os ágares e as larvas. Ligue todos os instrumentos do microscópio confocal, os lasers de diodo apropriados para excitar os transgenes de peixe-zebra e o laser de corante bombeado a nitrogênio.

Certifique-se de que o divisor de feixe em branco está no lugar e de que o coer de 435 nanômetros e a célula de corante estão posicionados. Abra completamente o atenuador do laser e, em seguida, abra o software de imagem com a objetiva de imersão em água de 63 x 1,2 na e uma lâmina de vidro com um lado espelhado. Utilize iluminação de campo claro para localizar e focar em um arranhão ou marca no espelho.

Usando o software de imagem, visualize e foque as marcações na tela do computador a partir da janela que controla a calibração do laser e as configurações de potência. Defina o número de pulsos para um e a atenuação para 3% de transmissão na barra de ferramentas principal. Selecione a ferramenta de elipse e clique na imagem na tela do computador.

Para criar uma única ROI circular, repita o processo mais três vezes até haver quatro ROI circulares distribuídas aleatoriamente pela imagem. Em seguida, dispare o laser. Se o laser estiver funcionando e calibrado corretamente, isso criará quatro pequenas marcações pontuais, uma dentro de cada ROI circular. Depois, remova a lâmina de vidro da platina do microscópio e limpe a objetiva.

Substitua o divisor de feixe em branco pelo divisor de feixe 100%ILL para seccionar um nervo motor utilizando ablação a laser. Aplique uma pequena gota de meio de imersão em água na objetiva e posicione o recipiente com a larva montada sobre o estágio apropriado, utilizando grampos para estabilizá-lo, com auxílio da ocular e da iluminação de campo claro. Foque as larvas e localize os neurônios motores.

Analise os nervos nos hemissegmentos de 10 a 20 e selecione um nervo motor para a secção. Em seguida, exiba uma visualização em tempo real do nervo na tela do computador. Selecione os planos Z e adquira uma imagem dos axônios e das células gliais do nervo não lesionado.

Em seguida, prepare as configurações de imagem em lapso de tempo para capturar projeções Z de todos os tipos celulares em intervalos de cinco a trinta minutos. Dependendo do experimento, remova o divisor de feixe 100%ILL e substitua-o pelo obturador. Retorne à visualização em tempo real do nervo e utilize o canal fluorescente apropriado para observar os axônios que serão seccionados.

Usando a ferramenta de elipse, crie uma ROI elíptica fina na área a ser ablacionada. Em seguida, crie ROIs menores dentro da região selecionada na janela que controla as configurações do laser. Defina o número de pulsos como dois e a placa de atenuação como 18% de transmissão.

Em seguida, dispare o laser dentro das ROI selecionadas. Aguarde 10 segundos ou mais e verifique novamente a área ablacionada quanto à fluorescência. Esteja ciente de que uma ROI pode inicialmente parecer ablacionada quando na verdade sofreu fotoesmaecimento, e as ROI podem precisar ser levemente modificadas durante o processo de ablação para obter uma secção completa.

Se a fluorescência retornar, aumente a potência do laser e dispare o laser. Repita novamente até que a fluorescência desapareça dentro da R OIS e não retorne dentro de 10 segundos. Uma vez concluída a ablação, inicie a aquisição de imagens em lapso de tempo quando o lapso de tempo estiver completo.

Utilize um software de imagem para compilar os dados e criar projeções Z em composição de cores para cada ponto temporal. Crie um filme rápido para analisar simultaneamente o comportamento dos axônios e das células gliais. O ensaio descrito aqui pode ser usado para avaliar a resposta das células gliais e de outras populações celulares associadas aos nervos frente à lesão axonal in vivo.

É apresentado aqui um exemplo de lesão nervosa criada usando este método e a resposta das células gliais ao redor. O experimento foi realizado em seis peixes-zebra transgênicos DPF que expressavam EGFP direcionado à membrana em ggl perineurais e DS vermelho citosólico em neurônios motores. A lesão foi feita ao longo da projeção rostral de um nervo motor do tronco, que foi então submetido à microscopia de lapso de tempo nos canais EGFP e DS vermelho.

Isso permitiu a visualização simultânea dos comportamentos dos axônios e das células gliais imediatamente após a lesão. Essas imagens são pontos temporais estáticos obtidos a partir do filme com lapso de tempo. A elipse tracejada mostra a região de interesse (ROI) que foi ablacionada utilizando o laser após um minuto.

Após a secção ou PDM, a área ablada não apresentava fluorescência e a zona de lesão media aproximadamente 3,5 micrômetros do coto proximal ao distal. O sucesso de uma secção pode ser confirmado por meio da imagem do coto nervoso distal e da busca por sinais de degeneração walleriana, incluindo fragmentação do axônio distal e eliminação rápida. A ausência de fluorescência axonal ao longo do coto distal aos 120 PDM indica que esses axônios realmente sofreram degeneração walleriana e que a secção foi bem-sucedida.

Ajustar a potência do laser a uma configuração ideal é essencial ao realizar experimentos de ablação a laser. Configurações ideais de potência do laser ablarão limpidamente o nervo apenas dentro da região de interesse (ROI) selecionada, e configurações de potência do laser que forem muito baixas ou muito altas produzirão resultados subótimos; aqui é mostrado um ferimento realizado com potência de laser muito baixa. A fluorescência permaneceu dentro da ROI após o disparo do laser, resultando em uma secção incompleta.

Por outro lado, como demonstrado nesta figura, uma potência de laser excessivamente alta produziu uma ablação extremamente grande. Após assistir a este vídeo, você deverá ter uma boa compreensão de como montar peixes-zebra para experimentos de transecção a laser. Realize uma transecção utilizando um laser de corante bombeado por nitrogênio e avalie a resposta das células circundantes por meio de imagens confocais com lapso de tempo.