Motor Nerve transecção e Time-lapso de Comportamentos de células gliais em Zebrafish ao vivo

Embora o sistema nervoso periférico (SNP) é capaz de reparação significativa após a lesão, pouco se sabe sobre os mecanismos celulares e moleculares que governam este fenómeno. Usando vivo, zebrafish transgênicos e um teste de secção do nervo reprodutível, podemos estudar os comportamentos de células gliais dinâmicas durante a degeneração do nervo e regeneração.

O objetivo geral deste procedimento é fazer uma imagem de lapso de tempo do comportamento das células gliais após lesão de nervo periférico em larvas vivas de peixe-zebra. Isso é feito primeiro montando larvas de peixe-zebra anestesiadas em aros de baixo ponto de fusão em placas de Petri com fundo de vidro e posicionando-as com uma agulha de dissecação. Em seguida, as larvas montadas são colocadas no microscópio confocal.

Um nervo é selecionado para ablação e uma imagem é adquirida dos axônios e células gliais do nervo não lesionado. Em seguida, as ROIs são selecionadas ao longo do nervo e o laser é disparado para ablação das áreas selecionadas, criando uma transecção do nervo. Finalmente, os axônios e as células gliais são visualizados com lapso de tempo após a transecção do nervo.

Em última análise, podem ser obtidos resultados que mostram o comportamento dinâmico das células gliais durante a degeneração e regeneração nervosa por meio de microscopia confocal de lapso de tempo. Este método pode ajudar a responder a questões-chave nos campos da regeneração e biologia celular glial, como como as células gliais respondem à lesão nervosa? E como os subtipos gliais distintos coordenam seu comportamento durante a degeneração e a regeneração?

Depois de cruzar o peixe-zebra adulto contendo transgenes que marcam fluorescentemente os neurônios motores e os tipos de células gliais de interesse e incubar os embriões até 24 horas após a fertilização ou HPF, remova a água do ovo e substitua-a por um dente de pH threa ou PTU em água do ovo antes de retornar os embriões à incubadora. A partir deste ponto de tempo até cerca de 96 HPF, use um escopo de dissecação fluorescente para rastrear os embriões quanto à presença do gene fluorescente desejado. Transfira os embriões positivos para água fresca com ovo de PTU e devolva-os à incubadora.

Quando as larvas atingirem seis dias após a fertilização ou DPF, selecione alguns embriões para montagem e transfira-os para um prato menor. Retire a água do prato e substitua-a imediatamente por 0,02%trica Na água com ovo de PTU, incube as larvas em anestésico por aproximadamente cinco minutos. Coloque um Eloqua de 0,8% de agros de baixo ponto de fusão previamente preparado de acordo com o protocolo de texto em um copo com água da torneira e um micro-ondas.

Por 30 segundos ou até que o agros derreta, deixe o copo esfriar até que o tubo de agros fique morno ao toque. Em seguida, transfira uma larva anestesiada para um prato com fundo de vidro de 35 milímetros. Remova a água do prato.

Em seguida, cubra imediatamente as larvas com aros quentes o suficiente para encher a parte do prato com fundo de vidro. À medida que o agros endurece, use uma agulha de dissecação para posicionar as larvas de lado. Em seguida, incline-o levemente de costas, certificando-se de que as larvas montadas estejam tocando o vidro no fundo do prato, o que é necessário para lesões e imagens.

Use a agulha para manter as larvas em posição até que o agro solidifique e as larvas sejam imobilizadas. Em seguida, pipete lentamente água trica suficiente no prato para cobrir completamente os agros e as larvas. Ligue toda a instrumentação do microscópio confocal, lasers de diodo apropriados para excitar transgenes de peixe-zebra e o laser de corante bombeado por nitrogênio.

Certifique-se de que o divisor de feixe em branco esteja no lugar e que a coer e a célula de corante de 435 nanômetros estejam no lugar. Abra totalmente o atenuador a laser e, em seguida, abra o software de imagem com a lente de imersão em água de 63 x 1,2 na e uma lâmina de vidro com um lado espelhado. Use a iluminação de campo claro para encontrar e focar um arranhão ou gravação no espelho.

Usando o software de imagem, visualize e foque as gravações na tela do computador a partir da janela que controla a calibração do laser e as configurações de energia. Defina o número de pulsos para um e a atenuação para 3%transmissão na barra de ferramentas principal. Selecione a ferramenta de reticências e clique na imagem na tela do computador.

Para criar um único ROI circular, repita o processo mais três vezes até que haja quatro RI circulares espaçadas aleatoriamente sobre a imagem. Em seguida, dispare o laser. Se o laser estiver funcionando e calibrado corretamente, isso criará quatro pequenas gravuras pontuais, uma dentro de cada ROI circular Em seguida, remova a lâmina de vidro do microscópio stage e limpe a objetiva.

Substitua o divisor de feixe em branco pelo divisor de feixe 100% ILL para transeccionar um nervo motor usando ablação a laser. Aplique uma pequena gota de meio de imersão em água na objetiva e coloque o prato com a larva montada no apropriado stage usando clipes para estabilizá-lo usando a ocular e a iluminação de campo amplo. Concentre-se nas larvas e localize os neurônios motores.

Examine os nervos nos hemisegmentos 10 a 20 e selecione um nervo motor para a transecção. Em seguida, abra uma visão ao vivo do nervo na tela do computador. Selecione os planos Z e adquira uma imagem dos axônios e células gliais do nervo não lesionado.

Em seguida, prepare as configurações de imagem de lapso de tempo para capturar projeções Z de todos os tipos de células em intervalos de cinco a 30 minutos. Dependendo do experimento, remova o divisor de feixe 100%ILL e substitua pelo blank. Retorne à visualização ao vivo do nervo e use o canal fluorescente apropriado para visualizar os axônios que serão seccionados.

Usando a ferramenta de elipse, crie um ROI elíptico fino na área a ser ablacionada. Em seguida, crie ROIs menores dentro da região selecionada na janela que controla as configurações do laser. Defina o número de pulsos para dois e a placa de atenuação para 18% de transmissão.

Em seguida, dispare o laser dentro das ROIs selecionadas. Aguarde 10 ou mais segundos e verifique novamente se há fluorescência na área da ablação. Esteja ciente de que uma ROI pode inicialmente parecer ablacionada quando na verdade é fotobranqueada e as ROIs podem precisar ser ligeiramente modificadas durante o curso da ablação para obter uma transecção completa.

Se a fluorescência retornar, aumente a potência do laser e dispare o laser. Novamente, repita isso até que a fluorescência desapareça dentro do R OIS e não retorne em 10 segundos. Quando a ablação estiver concluída, inicie a imagem de lapso de tempo quando o lapso de tempo estiver completo.

Use o software de imagem para compilar dados e criar projeções Z compostas coloridas para cada ponto de tempo. Crie um filme em tempo rápido para analisar o comportamento das células gliais dos axônios simultaneamente. O ensaio descrito aqui pode ser usado para avaliar a resposta das células gliais e outras populações de células associadas ao nervo à lesão axonal in vivo.

Aqui é mostrado um exemplo de uma lesão nervosa criada usando este método e a resposta das células gliais circundantes. O experimento foi realizado em seis peixes-zebra transgênicos DPF que expressaram um EGFP direcionado à membrana em ggl perineural e DS vermelho citosólico em neurônios motores. A lesão foi feita ao longo da projeção rostral de um nervo motor do tronco que foi então fotografado com lapso de tempo nos canais vermelhos EGFP e DS.

Isso permitiu a visualização simultânea dos comportamentos dos axônios e das células gliais imediatamente após a lesão. Estas imagens são pontos de tempo estáticos retirados do filme time-lapse. A elipse pontilhada mostra a ROI que foi ablacionada usando o laser em um minuto.

Após a transecção ou MPT, a área ablacionada não apresentava fluorescência e a zona de lesão media aproximadamente 3,5 micrômetros do coto proximal ao distal. O sucesso de uma transecção pode ser confirmado por meio de imagens do coto do nervo distal e da procura de sinais de degeneração walleriana, incluindo fragmentação do axônio distal e depuração rápida. A ausência de fluorescência axonal ao longo do coto distal a 120 MPT indica que esses axônios realmente sofreram degeneração walleriana e a transação foi bem-sucedida.

Ajustar a potência do laser para uma configuração ideal é fundamental ao realizar experimentos de ablação a laser. As configurações ideais de potência do laser ablação limpará o nervo apenas dentro do ROI selecionado e as configurações de potência do laser que são muito baixas ou muito altas produzirão resultados abaixo do ideal, visto aqui é uma lesão que foi realizada com a potência do laser muito baixa. A fluorescência permaneceu dentro da ROI após o disparo do laser, resultando em uma transecção incompleta.

Por outro lado, como demonstrado nesta figura, uma potência de laser muito alta produziu uma ablação extremamente grande. Depois de assistir a este vídeo, você deve ter uma boa compreensão de como montar peixe-zebra para experimentos de transecção a laser. Crie uma transecção usando um laser de corante de bomba de nitrogênio e avalie a resposta das células circundantes usando imagens confocais de lapso de tempo.