Automatizados análises comportamentais de alto rendimento em larvas do peixe

O objetivo geral deste procedimento é identificar defeitos comportamentais em larvas de peixe-zebra após tratamento com tóxicos ou fármacos. Isso é feito primeiro coletando e tratando os embriões ou larvas com produtos químicos até os primeiros sete dias de desenvolvimento. O segundo passo é fazer pistas de natação agro usando moldes especialmente projetados.

Em seguida, as larvas tratadas são colocadas nas pistas agros para análise comportamental usando fotografia de lapso de tempo. A etapa final é importar as imagens para a imagem J e usar uma macro específica escrita internamente para coletar dados de coordenadas XY das larvas nas pistas. Em última análise, o ensaio comportamental de alto rendimento é usado para encontrar diferenças no comportamento da evitação e do eixo figma, bem como na velocidade de natação e repouso entre os grupos de tratamento.

A principal vantagem dessa técnica sobre os métodos existentes, como os disponíveis comercialmente, é que podemos usar nosso método para observar comportamentos mais complexos. Também é barato de construir e fácil de configurar. Este método pode ajudar a responder a questões-chave no campo da neurociência comportamental, como como os tóxicos afetam o desenvolvimento e o comportamento do cérebro durante a exposição embrionária precoce.

Também pode fornecer informações sobre defeitos cerebrais sutis em humanos, que não podem ser encontrados por outras telas de toxicidade atuais. Geralmente, indivíduos novos neste método terão dificuldades porque capturar as larvas pode ser difícil. A demonstração visual desse método é crítica, pois as etapas têm uma curva de aprendizado, pois o protocolo envolve sistemas personalizados.

Para iniciar este procedimento, insira pratos de pirex de vidro com grama falsa feita de fio verde nos tanques. Ao amanhecer, deixe os pratos nos tanques por duas horas para coletar embriões de peixe-zebra. Despeje os pratos de vidro contendo os embriões sobre uma peneira de mão com água deionizada.

Em seguida, cultive os embriões em água de ovo contendo 60 miligramas por litro de oceano instantâneo em água deionizada e 0,25 miligramas por litro de azul de metileno, que é usado como inibidor de mofo. Os embriões podem ser alojados em 50 a 60 larvas por 50 mililitros ou em tanques de reprodução maiores até que os embriões estejam prontos para serem tratados com tóxicos. Dependendo da hipótese do experimento individual, os embriões podem ser tratados imediatamente ou durante estágios específicos de desenvolvimento usando tóxicos ou produtos farmacêuticos, que geralmente são dissolvidos em DMSO e depois diluídos diretamente no meio de água de ovo.

A cor azul é usada para fins de demonstração em vídeo durante o tratamento embrionário e larva. As larvas e embriões podem ser alojados em placas de Petri profundas a uma densidade de cerca de 50 a 60 larvas por 50 mililitros até que a análise comportamental sete dias após a fertilização altere a solução de água do ovo pelo menos a cada dois dias para evitar o crescimento de fungos ou bactérias dos embriões mortos. Moldes de plástico foram fabricados para criar pistas usando aros, que é derramado em placas de plástico de poço único da Thermos Scientific.

Os moldes contêm cinco pistas nas quais os lados são inclinados a 60 graus. Veja o protocolo de texto que acompanha este vídeo para as dimensões dos moldes e das placas? Primeiro, prepare o aros derretendo 0,8% de aros em água deionizada com 60 miligramas por litro de oceano instantâneo.

Em seguida, gere as pistas despejando 50 mililitros do aros derretido em uma única placa de poço. Em seguida, coloque muito lentamente o molde em cima do aros líquido que elimina qualquer formação de bolhas. Remova o molde quando o aros esfriar.

As pistas aros podem ser armazenadas em temperatura ambiente com as tampas na louça por até 36 horas. Para análise comportamental de alto rendimento, os gabinetes de imagem são preparados com uma câmera digital de 15 megapixels conectada à parte superior do gabinete voltada para baixo na parte inferior do gabinete. Um laptop com tela de 15,6 polegadas é colocado com a tela voltada para cima.

Para evitar o superaquecimento das larvas, é melhor usar um laptop com temperatura de tela que não ultrapasse 28 graus Celsius. Coloque um difusor de plástico em cima da tela do laptop no qual as placas agros serão colocadas. O difusor evitará mais padrões nas imagens coletadas.

Para iniciar a captura de imagens, mova cuidadosamente as larvas da placa de Petri para a pista agros para ajudar a reduzir o estresse das larvas. Até 20 larvas podem ser colocadas em cada raia, mas cinco larvas por raia são normalmente usadas para facilitar o rastreamento mais preciso da velocidade de natação e para reduzir o número de larvas necessárias por experimento, encher as raias com água de ovo, com ou sem produtos farmacêuticos ou tóxicos, dependendo do experimento. Não encha as pistas até que sejam colocadas nos gabinetes de imagem para evitar transbordamento.

Aguarde 10 minutos para que as larvas se aclimatem após o período de aclimatação. Posicione quatro placas manualmente diretamente na parte superior da tela do laptop. Neste momento, as pistas podem ser completadas com ovo, água ou tratamento químico para que fique nivelado com o topo da pista para eliminar sombras nas bordas das pistas.

Nas imagens, programe o computador para fotografia com lapso de tempo, tirando fotos a cada seis segundos para um total de 300 imagens por experimento. Defina a câmera para uma resolução mais baixa para imagens em velocidade de vídeo. Enquanto a resolução mais baixa limita as gravações a uma única placa de vários poços.

As gravações de vídeo são apropriadas para imagens de eventos de natação rápida. Use uma apresentação em PowerPoint como um estímulo aversivo para as larvas nesta demonstração. O PowerPoint começa com um fundo branco em branco por 15 minutos, seguido por 15 de uma barra vermelha em movimento na metade superior da placa.

Para evitar a evaporação do líquido dentro das pistas aros, mantenha o tempo máximo de imagem abaixo de uma hora. Abra as imagens com a imagem J nesta demonstração. Uma macro interna para análise larval de cinco pistas é usada e pode ser disponibilizada para qualquer usuário.

Use os prompts na macro para definir os parâmetros, como número de imagens e cor a serem subtraídas. A macro divide automaticamente o canal de cores para que a cor vermelha possa ser removida. Subtrai o fundo, aplica um limite e identifica as larvas por análise de partículas.

Depois que todas as imagens forem executadas na imagem J Macro, um arquivo de resultados será exibido e conterá as coordenadas XY das larvas individuais para cada imagem, juntamente com o número da imagem e o número da pista. Salve o arquivo de resultados em um formato Excel e classifique com base no plano de fundo em branco versus o plano de fundo da barra móvel e, em seguida, o número do poço. Use um modelo do Excel que tenha equações integradas para determinar automaticamente a colocação das larvas nos poços, a distância entre as larvas, a velocidade do movimento e a quantidade de repouso.

O modelo Excel mais atual criado no laboratório Cretin está disponível mediante solicitação para criar gráficos mostrando vários grupos de tratamento na planilha do Excel, juntamente com o teste T para comparação entre grupos de tratamento e controles. Outras análises estatísticas podem ser realizadas usando o programa estatístico SPSS. Os resultados são mostrados para larvas tratadas com água de ovo e DMSO como controles e concentrações variáveis de um pesticida organofosforado comumente encontrado em alimentos não orgânicos.

Aqui, as barras brancas mostram dados de larvas expostas a um fundo em branco e as barras vermelhas mostram dados das larvas expostas à barra vermelha em movimento. Controle. As larvas cultivadas em água com ovo mostram uma preferência maior por estar no prato depois de serem apresentadas à barra vermelha em movimento. Resultados semelhantes são obtidos quando as larvas são cultivadas em água de ovo contendo um micrograma por mililitro de DMSO, um solvente que é comumente usado para dissolver vários produtos farmacêuticos e tóxicos como 1000 x soluções de estoque.

Os gráficos indicam as medidas que podem ser obtidas a partir da análise comportamental, incluindo porcentagem de larvas na pista, porcentagem de larvas no final da pista, porcentagem de larvas na borda da pista, distância entre a velocidade de natação dos peixes das larvas e porcentagem de tempo em que as larvas estão em repouso. Os resultados mostrados são uma amostra de um experimento. No entanto, quando repetidos, os resultados indicam que a velocidade de natação e o comportamento da figma são alterados por baixas concentrações de pesticidas organofosforados, que mimetizam os níveis na alimentação humana Uma vez dominados, os exames de imagem e análise de imagem podem ser feitos em uma hora e meia se forem realizados corretamente.

O aspecto mais importante desse procedimento é lembrar de manter o meio cultural limpo, substituindo-o por um novo meio diariamente.