Isolamento e Caracterização química do lípido A de bactérias Gram-negativas

O objetivo geral do experimento a seguir é isolar lipopolissacarídeo da superfície externa de bactérias gram-negativas e caracterizar estruturalmente a porção de lipídio A com o uso de protocolos de espectrometria de massas em tandem. Isso é alcançado por meio da extração química de lipopolissacarídeo da superfície celular bacteriana e posterior hidrólise ácida suave para liberar o lipídio A da porção polissacarídica do lipopolissacarídeo e subsequente hidrólise ácida suave para liberar o lipídio A da porção polissacarídica do lipopolissacarídeo. Como segundo passo, uma solução de lipídio A é analisada por espectrometria de massas em tandem com ionização por spray eletrostático.

No nosso procedimento, o lipídio A é analisado por espectrometria de massas em tandem com dissociação induzida por colisão ou por dissociação fotoinduzida com luz ultravioleta para caracterização estrutural. Os resultados mostram diferenças nos padrões de fragmentação nos espectros de massas gerados pelos protocolos de espectrometria de massas em tandem com dissociação induzida por colisão ou com dissociação fotoinduzida por luz ultravioleta, em que a UVPD produz um padrão de fragmentação mais informativo. A principal vantagem dessa técnica em relação aos métodos existentes é que a espectrometria de massas em tandem permite a elucidação dos analitos-alvo com base na interpretação de padrões diagnósticos de fragmentação.

Fotos ultravioletas, em particular a dissociação, é um método de MS/MS de alta energia que produz íons fragmento mais diversos do que técnicas existentes, como a dissociação induzida por colisão. A demonstração visual deste método é essencial, já que o método de espectrometria de massa por PUVD (dissociação por radiação ultravioleta) utilizado ainda não foi comercializado. Além disso, o método utiliza um laser que foi integrado a um espectrômetro de massas mediante modificações personalizadas antes do início deste procedimento.

Colete as células de um cultivo bacteriano de 250 mL, centrifugue as células a 10.000 × g durante 10 minutos a quatro graus Celsius. Em seguida, despreze o sobrenadante do meio, lave o pellet celular com 50 mL de PBS 1X. Após nova centrifugação para reprecipitar as células, remova o sobrenadante.

Em seguida, re-suspenda as células em 40 mil de um XPBS e divida-as entre 2 tubos de centrífuga de teflon de 250 mil. Adicione 25 mil de clorofórmio e 50 M de metanol a cada tubo para obter uma mistura trifásica. Misture por inversão e incube à temperatura ambiente por pelo menos 20 minutos.

Para garantir a lise celular completa, centrifugue a mistura a 2000 vezes G durante 20 minutos à temperatura ambiente e descarte o sobrenadante. Lave o pellet de LPS com aproximadamente 100 mil de uma mistura monofásica de Bly dire. Centrifugue a 2000 vezes G durante 20 minutos e descarte o sobrenadante.

Adicione 27 mil do tampão de hidrólise ácida suave ao pellet de LPS e misture por pipetagem para cima e para baixo até que apenas pequenas partículas permaneçam; sonique com uma ponteira de sonicação para ressuspender homogeneamente. Suspenda o pellet de LPS em solução com um ciclo de trabalho constante por 20 segundos a 50% da potência. Repita a sonicação da amostra duas vezes, com 20 segundos por pulso e aproximadamente cinco segundos entre os pulsos.

Em seguida, aqueça as amostras em banho-maria por 30 minutos. Retire os tubos do banho-maria e deixe a amostra esfriar até a temperatura ambiente. Antes de prosseguir com a extração de lipídio A após a hidrólise, converta a solução de SDS em uma mistura bifásica BLY dire adicionando 30 mil de clorofórmio e 30 mil de metanol, para obter uma mistura tampão de clorofórmio-metanol com hidrólise ácida suave, misturada por inversão e centrifugada.

Centrifugue a amostra por 10 minutos a 2000 ×g. Usando uma pipeta de vidro, extraia a fase inferior para um tubo de centrífuga limpo de teflon. Em seguida, realize uma segunda extração adicionando 30 mL da fase inferior de uma mistura bifásica de bly dire previamente equilibrada à fase superior no tubo da amostra, misture por inversão e centrifugue a 2000 ×g por 10 minutos. Extraia a fase inferior com uma pipeta de vidro e reúna com a fase inferior extraída anteriormente.

Lave as fases inferiores reunidas adicionando 114 mil da fase superior pré-equilibrada de bly dire para criar uma mistura bifásica de bly dire, misturada por inversão e centrifugada a 2000 vezes G por 10 minutos com uma pipeta de transferência de vidro. Transfira a fase inferior para um frasco limpo de evaporador rotativo de vidro e seque a amostra utilizando evaporação rotativa.

Em seguida, adicione cinco mililitros de uma mistura de clorofórmio e metanol ao frasco rotativo e sonique em banho por pelo menos 30 segundos, para auxiliar na suspensão do lipídio A das paredes do frasco. Utilize uma pipeta de transferência de vidro para transferir o lipídio para um tubo de vidro limpo com tampa rosqueável fenólica revestida com A-P-T-F-E.

Seque a amostra sob uma corrente de nitrogênio utilizando um secador de nitrogênio. Re-suspenda o lipídio seco em um mililitro de uma mistura de clorofórmio e metanol. Após a adição do solvente, agite a mistura em vórtex para garantir a completa re-suspensão.

Transfira para um pequeno frasco de vidro e seque usando um secador de nitrogênio. Armazene a amostra seca a menos 20 graus Celsius até a análise subseqüente por TLC ou MS. A amostra pode ser armazenada a menos 20 graus Celsius até a análise subseqüente.

Uma vez que a amostra tenha sido preparada, misture 200 microlitros de metanol grau HPLC com 200 microlitros de clorofórmio grau HPLC em um pequeno frasco de vidro vazio; transfira 200 microlitros da mistura solvente de clorofórmio e metanol para o frasco contendo o lipídio A e sonique o conteúdo do frasco por cinco minutos ou até que todo o material tenha se dissolvido. Em seguida, prepare o espectrômetro de massas para ionização por eletrasspray em modo negativo e preencha uma seringa de 250 microlitros com a solução de lipídio A.

Insira a seringa em uma bomba de seringa e infunda diretamente o lipídio diluído. Um exemplo com uma taxa de fluxo de 2,0 a 3,5 microlitros por minuto. Otimize e aumente o sinal iônico do lipídio ajustando a óptica iônica.

Colete o espectro de massa do lipídio. Isole e ative o lipídio alvo A selecionando CID como o método de MSM. Em seguida, aumente a tensão de CID ou a energia de colisão normalizada até o lipídio precursor.

Uma espécie possui cerca de 10% de abundância relativa em comparação com o íon produto de maior intensidade adquirido, e média-se os espectros até que uma relação sinal-ruído suficiente seja alcançada. Para os íons produtos, prepare a amostra e o espectrômetro de massas conforme descrito na seção anterior. Ligue o laser conectado ao espectrômetro de massas.

Consulte o protocolo em texto para os detalhes de MS: configure o software do instrumento para que o laser dispare o laser de excímero quando os íons entrarem na célula HCD; em seguida, ligue o gerador de pulso de modo que o laser emita um pulso a cada dois milissegundos. Isole o íon precursor do lipídio A selecionando HCD como o método de MS/MS e ajuste a energia de colisão para 1% de energia de colisão normalizada; ative o íon lipídico isolado aumentando a energia do laser e ajustando o número de pulsos do laser, o que normalmente corresponde a dez pulsos de seis milijoules. Finalmente, adquira e médie os espectros até que uma relação sinal-ruído suficiente seja alcançada.

Para os íons produtos UVPD. O espectro de massas no modo negativo por MALDI TOF de lipid A proveniente da cepa E Coli K 12 W 3 110 apresenta a espécie desprotonada única na razão massa/carga de 1796,2 como a espécie majoritariamente observada. Os detalhes da análise por MALDI TOF são discutidos no protocolo descrito no texto.

Alternativamente, a mesma amostra de lipídio submetida à ESI em modo negativo produz predominantemente íons lipídicos duplamente desprotonados na razão de carga principal de 898,1; íons lipídicos desprotonados na razão de carga principal de 1796,20 são observáveis, mas com abundância relativa menor em comparação com as espécies duplamente desprotonadas. A fragmentação por CID ou UVPD em 193 nanômetros foi realizada no íon lipídico simplesmente desprotonado. Essas técnicas podem ser utilizadas para melhor atribuir estruturas químicas, particularmente de lipídios.

Uma espécie contendo combinações complexas de modificações ou modificações químicas previamente não caracterizadas. Os perfis de fragmentação são mostrados com linhas tracejadas representando os sítios de clivagem e são comparados com os valores da razão de carga principal abaixo de cada estrutura fornecida. Os valores da razão de carga principal e os sítios de clivagem destacados em vermelho representam íons produto únicos associados ao lípido marcado com 32 P por UVPD.

Um isolado de duas cepas diferentes de E. coli K-12 foi analisado por TLC. O protocolo para este procedimento está detalhado no protocolo textual. A cepa K-12 W3110 contém principalmente lipid A bis e tris fosforilado, ou um padrão de TLC mais complexo é observado com lipid A marcado com 32P.

Um isolado da linhagem de E. coli WD 1 0 1. WD 1 0 1 produz lipídio A fortemente modificado com rabino e fosfoetanolamina.

Como os fosfatos na posição um e quatro primos estão disponíveis para modificação, o lipídio A de WD 1 0 1 pode ser descrito como simplesmente modificado, contendo apenas um el aminoarabinose ou fosfoetanolamina em um dos fosfatos, ou duplamente modificado, onde ambos os fosfatos são modificados de maneira combinatória. Além da modificação nos fosfatos um e quatro primos, também é observada a adição de palmitato, o que aumenta o valor de RF das espécies de lipídio A neste sistema de solvente. Este protocolo abriu caminho de forma única para pesquisadores na área de microbiologia explorarem mais profundamente as relações estrutura-função com respeito a como as modificações do lipídio A impactam a biologia de bactérias gram-negativas.

Também estamos muito interessados e demonstramos o poder da espectrometria de massas baseada em dissociação por ultravioleta (UVPD) para caracterizar as estruturas de moléculas biologicamente importantes, como glicanos, proteínas, ácidos nucleicos e outros lipídios complexos. Não se esqueça de que trabalhar com solventes orgânicos, materiais biologicamente perigosos e lasers pode ser extremamente perigoso. É importante enfatizar que os solventes devem ser manipulados em capelas de exaustão química ventiladas.

Equipamentos de proteção adequados, como luvas e óculos de proteção, devem sempre ser utilizados, e o laser empregado para UVPD deve estar devidamente protegido.