Um protocolo para indução genética e Visualização de tumores benignos e invasoras em Cephalic Complexos de Drosophila melanogaster
11 de setembro de 2013
Cooperação entre um oncogene ativado como RAS V12 e mutações em genes de polaridade celular como íntima, resultar em crescimento do tumor em Drosophila, onde as células tumorais também exibem comportamentos invasivos. Aqui, um protocolo simples para a indução e observação dos tumores benignos e invasoras é apresentado.
O objetivo geral deste procedimento é induzir tumores benignos e invasivos em drosófilas e, em seguida, visualizá-los dissecando o complexo cefálico larval. Isso começa com a configuração entre as cepas desejadas e o isolamento da progênie larval, portadora de tumores invasivos ou benignos. O próximo passo é dissecar as larvas selecionadas.
Expor o complexo cefálico primeiro cortando-os dois terços do caminho, prendendo-os e depois virando-os do avesso. Em seguida, os tecidos adiposos do corpo e do intestino são limpos e, em seguida, todos os nervos ainda ligados ao cordão nervoso ventral e à epiderme larval também são quebrados. A etapa final é criar imagens do complexo cefálico ou corrigi-lo para aplicações downstream.
Em última análise, os resultados podem mostrar tumores invasivos ou benignos marcados com GFP por meio do uso de microscopia de fluorescência. Este método pode ajudar a responder a algumas das questões-chave na biologia do câncer. Por exemplo, você pode querer entender quais genes podem inibir a progressão de tumores em um organismo intacto.
Uma vez obtidas as reservas genéticas necessárias, preparar uma cultura inicial da estirpe de teste. Preparar também uma cultura inicial para a massa testada. Cruze 10 virgens do estoque do testador com 10 machos do estoque testado.
Deixe as moscas acasalarem e botarem ovos por 24 a 48 horas a 25 graus Celsius e, em seguida, transfira-as para um frasco fresco para produzir mais progênie. Monitore os frascos cruzados para ovos e larvas de primeiro ínstar. Configure uma nova cruz.
Se os frascos coletados apresentarem baixa deposição de ovos. Se os frascos coletados começarem a secar, adicione apenas três a quatro gotas de água destilada em autoclave para manter a cultura úmida. Continue monitorando os frascos até vagar.
As larvas do terceiro ínstar estão presentes. Em seguida, prossiga com o monitoramento sob um microscópio estéreo de fluorescência. Usando o mesmo procedimento, colete moscas com tumores invasivos usando os estoques listados até o quinto ou sexto dia de cultura, larvas de terceiro ínstar errantes estarão disponíveis nas culturas de tumores benignos.
No entanto, eles não estarão disponíveis até o dia 10 nas culturas de tumores invasivos. Para coletar as larvas do terceiro ínstar, molhe um pincel fino com água destilada e raspe-as da parede do frasco. Coloque as larvas em uma lâmina de depressão com um XPBS frio e, em seguida, usando um pincel úmido.
Raspe qualquer material alimentar de sua epiderme. Por alguns minutos de imobilização, coloque a larva no prato a menos 20 graus Celsius por 30 minutos. Para um tempo de imobilização mais longo, coloque as larvas em um frasco de cultura com apenas cochilo de mosca em uma varinha.
Tampe o frasco de cultura e deixe repousar por 40 minutos. Em seguida, transfira as larvas imobilizadas para uma lâmina de vidro. Adicione uma gota de óleo de carboidrato halo leve e cubra as larvas com uma lamínula.
Agora, observe as larvas sob um microscópio estéreo fluorescente. Para a expressão de GFP, selecione as larvas fluorescentes verdes e prossiga com a dissecção. As larvas portadoras de tumores benignos fluorescem em verde na região anterior onde o complexo cefálico está presente.
Os tumores invasivos também fluorescem em verde na região anterior das larvas no complexo cefálico. Se possível, certifique-se de documentar com foto os tumores fluorescentes. Portanto, a epiderme translúcida da larva dificulta a observação da extensão da migração dos tumores, e é por isso que devemos dissecar os tumores.
Comece usando uma pinça para transferir uma larva fresca com qualquer um dos tumores. Digite para um poço de uma placa de dissecação contendo um mililitro de um XPBS frio. Segure as larvas usando um par de pinças a cerca de dois terços da distância da extremidade anterior.
Usando outro par de pinças, separe inteligentemente o terço posterior das larvas e descarte-o. Em seguida, soltou os dois terços anteriores. À medida que a pressão dentro das larvas é liberada, seu conteúdo escorre para fora da cavidade corporal.
Usando uma pinça, remova os tecidos que vazaram da cavidade corporal. Em seguida, segure o gancho da boca da larva e empurre-o para a epiderme da larva. Usando o outro par de pinças, inverta completamente as larvas.
Agora, com a pinça, com cuidado e cuidado, remova as glândulas salivares do corpo adiposo, o intestino, o complexo do disco da asa e quaisquer tubos traqueais. O complexo cefálico agora pode ser visível preso ao gancho da boca. Os hemisférios cerebrais e o VNC ainda estão conectados à epiderme larval por meio de nervos que emanam do VNC.
Com uma pinça, quebre suavemente essas conexões. Em seguida, remova qualquer excesso de gordura, corpo ou outros tecidos para que o complexo cefálico se torne claramente visível. Anexado à epiderme larval nos ganchos da boca.
Deixe o complexo cefálico como está para processamento adicional antes da visualização. Caso contrário, para visualizar diretamente o complexo cefálico, separe-o da epiderme e coloque-o em uma gota de mídia de montagem à base de glicerol, como o escudo vetorial. Usando o protocolo descrito, os tumores foram induzidos no olho.
Anin disc, tumores benignos permaneceram localizados no olho anin disc onde são induzidos. Observe que o tecido marcado com GFP não migrou para órgãos contíguos como o cordão nervoso ventral no complexo cefálico com tumores invasivos de um dia 10 larva de crescimento excessivo de tecido tumoral foi observado. Além disso, como apontado pela seta vermelha, os tumores invadiram órgãos contíguos como o VNC e os ganchos da boca.
Depois de assistir a este vídeo, você deve ter uma boa compreensão de como induzir geneticamente tumores benignos e invasivos e, em seguida, visualizá-los dissecando o complexo cefálico intra ano gastro.
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Visão Geral
Este artigo apresenta um protocolo para induzir e observar tumores benignos e invasivos em Drosophila, com foco na cooperação entre oncogenes ativados e mutações em genes de polaridade celular. O procedimento inclui a dissecação do complexo cefálico larval para visualizar as características do tumor.
Componentes Principais do Estudo
Área da Ciência
- Oncologia
- Genética
- Biologia do Desenvolvimento
Contexto
- Oncogenes ativados, como RAS V12, contribuem para o crescimento tumoral.
- Mutações em genes de polaridade celular, como scribbled, desempenham um papel no comportamento tumoral.
- Drosophila atua como organismo modelo para o estudo da dinâmica tumoral.
- Compreender a invasividade tumoral é essencial para a pesquisa sobre câncer.
Objetivo do Estudo
- Induzir tumores benignos e invasivos em Drosophila.
- Visualizar características tumorais por meio de dissecação de larvas.
- Explorar as interações entre oncogenes e mutações na polaridade celular.
Métodos Utilizados
- Cruzar cepas desejadas de Drosophila para isolar prole larval.
- Dissecar larvas para expor o complexo cefálico.
- Remover tecidos de corpo gorduroso e intestino das larvas dissecadas.
- Imagem do complexo cefálico para análises posteriores.
Resultados Principais
- Indução bem-sucedida de tumores benignos e invasivos em Drosophila.
- Visualização das características tumorais por meio de dissecação de larvas.
- Compreensão do papel de oncogenes e mutações na polaridade celular no comportamento tumoral.
- Implicações potenciais para o entendimento da biologia do câncer.
Conclusões
- O protocolo fornece um método confiável para estudar a dinâmica tumoral em Drosophila.
- Os achados contribuem para a compreensão da invasividade tumoral.
- Pesquisas futuras podem explorar alvos terapêuticos com base nessas interações.
Perguntas Frequentes
Relevância Executiva para a Indústria
Este protocolo permite a desmistificação mecanicista de vias de invasão tumoral por meio da modelagem da progressão de benigna a maligna em um sistema geneticamente manipulável. Ele apoia a validação de alvos por meio da análise funcional das interações entre oncogenes e genes de polaridade. A abordagem fornece confiança preditiva para a priorização de modificadores genéticos do comportamento tumoral na fase inicial de descoberta.
Aplicações Estratégicas em P&D de Biotecnologia Farmacêutica
Descoberta Inicial e Validação de Alvo
- Valor Científico: Avalia hipóteses terapêuticas por meio da análise da cooperação entre a proteína RasV12 ativada e a perda dos genes scribble, discs large ou lethal giant larvae.
- Valor Operacional: Permite a desmistificação biológica de vias de invasão por meio do progresso tumoral quantificável, desde o crescimento localizado até a sobreposição em tecidos contíguos.
Triagem e Desenvolvimento de Ensaios
- Valor Científico: Prepara complexos cefálicos portadores de tumor validados para triagem fenotípica subsequente de supressores ou potenciadores genéticos.
- Valor Operacional: Padroniza protocolos de dissecação e visualização para garantir leituras quantitativas reprodutíveis da localização e invasão tumoral.
Pesquisa Translacional e Pré-clínica
- Valor Científico: Alinha-se a sistemas relevantes para doenças ao modelar interações genéticas conservadas na invasividade tumoral, aplicáveis a vias do câncer humano.
- Valor Operacional: Apoia o alinhamento translacional de biomarcadores ao permitir a análise dos padrões de dissociação e migração de tecido tumoral marcado com GFP.
Integração de Pipeline e Fluxo de Trabalho
O método se insere no continuum de descoberta, desde a hipótese baseada em alvo até a identificação de compostos promissores, ao fornecer uma plataforma escalonável para genômica funcional na biologia tumoral.
- Biologia da Descoberta: Apoia a clarificação de vias ao visualizar a expansão tumoral em complexos cefálicos intactos para avaliar modificadores genéticos da invasão.
- Triagem: Permite a preparação do ensaio mediante o isolamento padronizado de tecido tumoral marcado com GFP para avaliação de compostos ou supressores genéticos.
- Análises: Gera medidas quantitativas do crescimento excessivo do tumor e da invasão orgânica para comparar condições em diferentes origens genéticas.
- Pesquisa Translacional: Conecta a descoberta à continuidade pré-clínica ao modelar etapas conservadas na progressão tumoral relevantes para sistemas de mamíferos.
- Reutilização Corporativa: Estabelece uma capacidade reutilizável para validação cruzada de alvos em pipelines de descoberta em oncologia.
Impacto Operacional e Empresarial
- Valor Científico: Reduz a ambiguidade mecanicista em modelos de invasão tumoral ao associar perturbações genéticas definidas a resultados fenotípicos observáveis.
- Valor Operacional: Aumenta a reprodutibilidade por meio do dissecção padronizada de larvas e preparação do complexo cefálico para imagem.
- Valor Estratégico: Melhora decisões de avanço ou interrupção ao fornecer confiança fenotípica em estágio inicial sobre candidatos a supressores tumorais ou oncogenes.
- Impacto no Portfólio: Orienta a priorização ajustada ao risco ao distinguir fenótipos tumorais benignos de invasivos em telas funcionais.
Considerações sobre a Implementação
- Exige experiência em genética de Drosophila, microscopia fluorescente e técnicas de dissecação microcirúrgica.
- Depende de microscopia estereoscópica de fluorescência e sistemas de anestesia a frio para imobilização de larvas e manipulação de tecidos.
- Necessita padronização entre equipes nos protocolos de manutenção de linhagens, cronometragem de cruzamentos e estadiamento larval.
- Envolve considerações de adaptação ao aplicar o modelo a outros tipos de tumores ou fundos genéticos além da origem no disco olho-antenal.
- Limitado pela necessidade de estadiamento preciso (dia 5–6 para tumores benignos, dia 10 para tumores invasivos) para garantir janelas comparáveis de progressão tumoral.
