Estabelecimento de um

O objetivo geral deste procedimento é estabelecer um sistema de modelo de cultura in vitro para estudar o comportamento intracelular de um patógeno fúngico oportunista humano. Candida lab ratta em macrófagos derivados de uma linhagem celular mononuclear humana TP um. Para isso, os monócitos THP um são primeiramente tratados com quatro éster para diferenciá-los em macrófagos.

Em seguida, macrófagos THP-1 são infectados com células canida GTA duas horas após a infecção. Células canida GTA não fagocitadas são removidas por lavagens com PBS e células intracelulares são recuperadas para estudos posteriores por osmose dos macrófagos infectados. Este protocolo pode ser utilizado para avaliar tanto a entrada de células canida GTA nos macrófagos quanto a maturação fagossomal e a resposta de citocinas em macrófagos THP-1 após infecção por canida GTA.

Além disso, este protocolo pode ser ampliado para triar a biblioteca de mutantes do colaborador Candida quanto a perfis alterados de sobrevivência em macrófagos TSP-1 de maneira semiaberta de alto rendimento. A principal vantagem deste protocolo é que ele é relativamente barato, altamente reprodutível e facilmente adaptável a diferentes células imunes, bem como a patógenos fúngicos. Para iniciar o procedimento, dois dias antes da infecção, plante as células monocíticas THP-1 a 80% de confluência no dia um, retire o meio de cultura e adicione cuidadosamente, de forma lenta e suave, para colocar todas as células aderentes em suspensão.

Transfira a suspensão de células mononucleares DHP para um tubo cônico de 15 ml. Centrifugue a suspensão celular à temperatura ambiente durante quatro minutos a 1000 RPM. Remova o meio para um recipiente de resíduos e adicione cinco ml de meio pré-API ao tubo e re-suspenda. Re-suspenda o pellet de células THV pipetando suavemente o meio três a quatro vezes.

Retire 10 microlitros da suspensão celular para determinar a densidade celular utilizando um hemocitômetro e ajuste a densidade celular para 1 milhão de células por ml. Adicione um microlitro de uma solução estoque de PMA a 60 micromolar à suspensão celular, de modo que a concentração final seja de 16 nanomolar, e misture bem. Distribua um ml de suspensão celular, correspondente a 1 milhão de células, em cada poço de uma placa de cultura tecidual de 24 poços e transfira para uma incubadora ajustada a 37 graus Celsius e 5% CO₂.

Após 12 horas de incubação, descarte o meio antigo. Adicione 1 ml de meio pré-RPI a cada poço e incube a placa por mais 12 horas. Essas células serão usadas para infecção no Canadá, que será mostrada posteriormente.

Utilizando práticas microbiológicas adequadas, inocular uma única colônia EA em um frasco contendo meio YPD ML. Incubar o frasco por 14 a 16 horas em um incubador ajustado a 30 graus Celsius. Após a incubação, centrifugar um cultivo de 1 mL a 4.000 RPM durante cinco minutos.

Descarte o sobrenadante e lave as conchas três vezes com PBS estéril. Após descartar o tampão de lavagem, suspenda a camada celular em um mL de PBS estéril por pipetagem suave. Em seguida, meça a absorbância da suspensão celular em um espectrofotômetro a 600 nanômetros e ajuste a densidade celular para 2 milhões de células por mL com PBS.

Retire 50 microlitros da suspensão celular e dilua cem vezes em PBS. Plaque cem microlitros do cultivo em meio YPD AGA. Incube a placa a 30 graus Celsius e conte o número de colônias que aparecerem na placa YPD após um ou dois dias; multiplique esse número pelo fator de diluição apropriado para calcular as unidades formadoras de colônias no tempo zero. Esse número de unidades formadoras de colônias de Canada Reta será usado para infectar DHE em macrófagos.

No próximo passo, adicione 50 µL de suspensão de células clonadoras do Canadá à monocamada de macrófagos em uma placa de cultura de 24 poços. Agite suavemente a placa para distribuir uniformemente as células e incube-a a 37 °C. Após duas horas de incubação, descarte o meio invertendo a placa de cultura em um recipiente. Lave cada poço da placa de cultura cuidadosamente com PBS tampão, adicionando-o ao longo da parede dos poços, e descarte o tampão.

Repita este passo mais duas vezes. Em seguida, exceto para o primeiro poço, adicione um mL de meio RPI a todos os outros poços, que pode ser usado para monitorar a replicação intracelular de células de candida nas horas 4, 6, 12 e 24 após a infecção, para recuperar células intracelulares após duas horas de infecção por macrófagos, adicione um mL de água de cereal ao poço. Após dois minutos, raspe suavemente o poço com a ponta de pipeta de um mL para remover os detritos de macrófagos do poço.

Lave o poço e colete o lisado em um tubo de centrífuga macro. Prepare uma diluição de cem vezes do lisado de células microFIT em PBS e plaque cento microlitros em meio YPD AGA. Incube a placa a 30 graus Celsius por um a dois dias e conte o número de unidades formadoras de colônias.

Multiplicar esse número pelo fator de diluição apropriado para enumerar o número de células de canida ator fagocitadas por T dois e macrófagos após duas horas de infecção. Da mesma forma, o número de células de canida ator intracelulares pode ser determinado em diferentes pontos de tempo. A pós-infecção e a replicação intracelular podem ser representadas como um aumento no tempo de 24 horas em comparação com as UFC internalizadas após duas horas, conforme mostrado aqui.

Outros resultados de um experimento típico no qual o número total de células de canida gator infectadas por TV um macrófagos é seis vezes 10, dois por quatro. O número de células recuperadas após duas horas é 3,7, seis vezes 10,4. Ilustrando, assim, que as células e são fagocitadas a uma taxa de 62,66% durante o período de co-incubação de 24 horas.

Podem al células outras que não uma replicação de 5,2 vezes conforme o número de células e intracelulares aumentou de 3,76 vezes 10,4 para 1,96 vezes 10,5. Neste experimento, a replicação intracelular de células TER canida também pode ser avaliada utilizando células E que expressam GFP, enquanto se usa microscopia confocal para isso. Prepare e infecte THV e macrófagos em uma lâmina de quatro câmaras usando o protocolo descrito anteriormente para a placa de cultura de 24 poços.

Duas horas após a infecção. Descarte o meio invertendo a lâmina em um recipiente de resíduos e adicione 500 microlitros de PBS em cada câmara da lâmina. Enxágue bem e descarte o PBS.

Repita este passo mais duas vezes com 500 microlitros de formaldeído a 3,7% para fixar as células. Incube o lâmina à temperatura ambiente por 20 minutos e descarte o formaldeído. Lave cada poço com 500 microlitros de PBS para permeabilizar os macrófagos com 500 microlitros de Triton X; após cinco minutos de incubação, remova o Triton X e lave o poço com PBS.

Desmonte cuidadosamente o lâmina de câmara utilizando um removedor de câmara e uma lâmina com dispositivo de transporte aéreo. Coloque uma gota de meio de montagem Vector Shield contendo DPI em cada setor da lâmina, monte uma lamínula e selar as bordas com esmalte de unha. Visualize as células sob um microscópio confocal. São mostradas aqui imagens confocais representativas de macrófagos TP1 infectados com laboratório canida que expressa tipo selvagem GFE; um aumento de cerca de seis vezes no número de células intracelulares entre duas e 24 horas indica a replicação do laboratório canida em macrófagos TP1. A abordagem de mutagênese com marcadores de sequência é amplamente utilizada para identificar fatores de virulência em patógenos microbianos, na qual um grande número de mutantes é simultaneamente analisado quanto a defeitos de crescimento por meio de uma etiqueta de sequência oligonucleotídica única.

Aqui descrevemos nosso protocolo para a triagem STM da Biblioteca Canadá e da biblioteca de mutantes, que consiste nas três etapas a seguir. Primeiro, 96 plasmídeos, cada um contendo uma sequência única de oligonucleotídeos, são imobilizados em uma membrana de náilon.

No segundo passo, um conjunto de 96 mutantes de CANIDA ator é analisado quanto a perfis de sobrevivência alterados em macrófagos THV um, seguido pela recuperação de células mutantes internalizadas em macrófagos cultivadas em YPD, que serão denominadas amostras de entrada e saída, respectivamente. Por fim, as marcas genéticas de DNA são amplificadas por PCR e marcadas com radiação a partir das amostras de DNA genômico de entrada e saída. O produto de PCR é hibridizado com marcas únicas e os sinais radioativos na membrana são quantificados e analisados.

Para montar o aparelho de placa 96 por 12 pontos, coloque uma membrana de náilon úmida sobre um papel absorvente úmido e aperte os parafusos da unidade. Lave a membrana com água estéril, seguido por uma lavagem com hidróxido de sódio 0,4 µ. Transfira 200 nanogramas de solução de PLA BDNA da placa 96 por 12 para os poços correspondentes do aparelho de ponto, após uma lavagem com hidróxido de sódio 0,4 molar.

Remova a membrana do aparelho de sangue em gotas após uma diferença em duas XXSC cruzando o plasma BDNA transferido para a membrana em um cruzador UV. Incube as membranas em tampão de pré-hibridização antenal e frascos UNE por duas horas a 42 graus Celsius. Prepare sondas radiomarcadas por PCR usando DNA genômico extraído das paletas de células de entrada e saída e iniciadores contra a região flanqueadora invertida das marcas únicas.

Desnaturar as sondas com marcação radioativa a 99 graus Celsius por cinco minutos e resfriar rapidamente em gelo. Transferir as sondas desnaturalizadas para os frascos de entrada e saída e incubar por 14 a 16 horas a 42 graus Celsius. Pós-hibridização.

Lave as membranas de entrada e saída conforme descrito no protocolo. Retire as membranas das garrafas, seque ao ar e exponha-as a uma tela de imagem de fósforo. Após duas a três horas, escaneie a tela de fósforo e adquira as imagens.

Neste exemplo, são mostrados dois filtros de membrana hibridizados, representando a triagem de um pool de 96 mutantes de Canida Gatory para detecção de sobrevivência alterada. Na quantificação em macrófagos e na determinação da razão entre a intensidade do sinal de cada ponto na membrana de saída e a de entrada, observou-se que os números das marcas 13, 26, 75 e 85 estão sub-representados na saída. Essas colônias estão circundadas em vermelho e refletem o crescimento de quatro mutantes diferentes.

Em contraste, mutantes com as sequências únicas 11 e 81 destacadas em verde estão superrepresentados na amostra de saída. Em outras palavras, a partir desta triagem, entre um grupo de 96 mutantes, dois mutantes devem aumentar a sobrevivência, enquanto quatro exibem crescimento em macrófagos. Os fenótipos alterados de sobrevivência identificados em uma triagem desse tipo devem ser verificados em ensaios de infecção individual.

Após assistir a este vídeo, você deverá ter uma boa compreensão de como implementar um sistema oral in vitro para estudar o perfil de crescimento intra-hídrico do patógeno fúngico de seu interesse. Além disso, deverá ser capaz de realizar triagens em larga escala de pools de mutantes utilizando agora esse sistema.