Name: Estabelecimento de um In vitro Sistema para estudar o comportamento intracelular de Candida glabrata Em humanos THP-1 macrófagos (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-12-10T20:15:00.000+00:00
Duration: 13 min 47 s
Description: Aprenda a estabelecer um modelo in vitro para estudar o comportamento intracelular de Candida glabrata em macrófagos THP-1 humanos. Este protocolo permite avaliar mecanismos de virulência fúngica.

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Este trabalho foi apoiado pelo Inovador Jovem Biotechnologist Award BT/BI/12/040/2005 e concessão BT/PR13289/BRB/10/745/2009 do Departamento de Biotecnologia, Governo da Índia e os fundos centrais do Centro de Impressões Digitais de DNA e Diagnóstico, Hyderabad. MNR e GB são os destinatários de júnior e sênior de pesquisa Bolsas de Estudo do Conselho de Pesquisa Científica e Industrial para a busca de um doutorado da Universidade Manipal. SB é o destinatário de Júnior e Sociedade do Departamento de Biotecnologia de Pesquisa Sênior para a busca de um doutorado da Universidade Manipal.

Recomenda-se a realizar C. experimentos de infecção glabrata em um laboratório com nível de contenção de biossegurança 2 (BSL-2). <ol><li> Preparação de células THP-1 monocamada de macrófagos. </li><li> Preparação de C. suspensão de células glabrata. </li><li> A infecção de células THP-1 com os macrófagos C. células glabrata. </li><li> A medição da taxa de fagocitose e replicação intracelular através do ensaio de formação de colónias unidade. </li><li> Monitoramento da replicação intracelular por microscopia confocal a laser. </li></ol> 1. Preparação de células THP-1 macrófago monocamada <ol><li> THP-1 é uma linha celular monocítica humana derivada a partir do sangue periférico de um menino de 1 ano de idade, sofrendo de leucemia monocítica aguda 14. THP-1, uma linha de células em suspensão, é habitualmente mantida a 37 ° C em humidade a 5% de CO 2 em meio de cultura RPMI-1640 suplementado com 10% FBS (soro fetal bovino). O tratamento com forbol 12-myristate 13-acetato (PMA, um éster de forbol) resulta na diferenciação terminal de células THP-1 monocitárias em macrófagos. É importante ressaltar que o tratamento PMA não afeta a viabilidade das células e células diferenciadas não se dividem. </li><li> Semente de aproximadamente 1,5 x 10 6 monócitos THP-1 em placas de 100 mm de cultura em meio RPMI-1640 completo (meio RPMI-1640 suplementado com 10% de soro, 2 mM de glutamina e antibióticos 1x, 10 mL / prato) e deixar crescer as células a 37 ° C em 5% de CO 2 durante 2 dias. </li><li> Uma vez que as células THP-1 chegaram a uma densidade de 8 x 10 5 células / ml, transferir a placa de cultura para a cultura de células de fluxo laminar vertical e agitar suavemente para ressuspender as células que se estabeleceram. </li><li> Pipetar a suspensão de células para fora, colocar num tubo de 15 ml estéril e centrifugar a 1000 rpm (130 x g) durante 4 min. Elimine o sobrenadante e suspender de THP-1 sedimento celular em 5 ml, pré-aquecido, de meio completo RPMI-1640 fresco. </li><li> Enumerar as células com um hemocitômetro e diluir o cell suspensão para uma densidade final de 10 6 células / ml com meio completo pré-aquecido RPMI-1640 </li><li> Adicionar 1 ml de estoque de 160 mM PMA (12-miristato de solução de 13-acetato de forbol preparada em dimetil-sulfóxido) para 10 ml de THP-1 de suspensão celular (concentração final 16 nM) e misture bem. Repartir 1 ml de suspensão celular em cada poço de uma placa de cultura de tecidos de 24 cavidades e incubar placa na incubadora mantida a 37 ° C com 5% de CO 2 durante 12 horas. </li><li> Remover o meio velho, adicionar 1 ml de pré-aquecido de RPMI-1640 completo e permitir que as células recuperar durante 12 horas a 37 ° C em 5% de CO 2. </li><li> Observar células sob um microscópio invertido para garantir que células THP-1 monocítica ovais em suspensão foram diferenciadas em macrófagos achatados, em forma de fuso e aderentes. Estas células diferenciadas estão agora prontos para conduzir C. estudos de infecção glabrata. </li></ol> 2. Preparação de C. glabrata &amp; #Suspensão celular; 160 C. glabrata estirpe selvagem Bg2 será utilizado para infectar células THP-1 macrófagos. C. glabrata células são rotineiramente cultivadas em meio YPD líquido (extracto de levedura (1%), peptona (2%), dextrose (2%)) médio. Meio YPD sólida é preparada por adição de 2% de agar antes da autoclavagem médio. <ol><li> Para preparar uma cultura de C. glabrata, escolhe-se uma única colónia da placa de agar com um lacete estéril, descartável e inocular em 10 ml de meio YPD líquido e incubar durante 14-16 horas, com agitação (200 rpm) a 30 ° C. </li><li> Centrífuga esta cultura (1 ml) a 4000 rpm (1800 xg) durante 5 min, em cima de uma mesa de microcentrífuga, lavar as células três vezes com PBS (solução salina tamponada com fosfato, pH 7,4) estéril e suspender sedimento celular em 1 ml de PBS. </li><li> Medida OD600 de C. suspensão de células glabrata e dilui-se com um volume adequado de PBS estéril para obter uma densidade de 2 x 10 6 células / ml (DO600= 0,1). Em alternativa, a densidade de células desejada pode ser conseguida por meio da contagem de células de levedura usando um hemocitómetro. </li></ol> 3. A infecção de células THP-1 de macrófagos C. Células glabrata <ol><li> Adicionar 50 ul C. suspensão de células glabrata THP-1 nos macrófagos (10 6 células semeadas por poço de uma placa de cultura de 24 poços) para obter um MOI (multiplicidade de infecção) de 0,1 e Incubar a placa a 37 ° C com 5% de CO 2. </li><li> Para determinar as contagens de levedura viáveis, diluir 50 ul C. glabrata de células em suspensão de 100 vezes em PBS estéril e placa 100 uL de meio sólido de YPD. Incubar as placas a 30 ° C, e contar manualmente o número de colónias de levedura que aparecem após 1-2 dias. Esses números serão, doravante, ser referido como 0 hr C. glabrata UFC (unidades formadoras de colônia). </li><li> Depois de 2 horas coculturing de células THP-1 com C. células glabrata, meio de cultura de descarte invertendo placa de 24 poços de cultura de tecidos ina reservatório e lavar cuidadosamente três vezes com PBS estéril pré-aquecido para remover C. extracelular nonphagocytosed células glabrata. Lavagens gentil com PBS são absolutamente essenciais para realizar a remoção completa de todo o fermento extracelular, sem causar qualquer dano ao THP-1 macrófagos monocamada. </li></ol> 4. Medição de fagocitose e Taxa de replicação intracelular via Colony Forming Assay Unit <ol><li> Lyse C. glabrata infectadas THP-1, macrófagos, em 1 ml de H 2 O estéril durante 2 min, raspe para remover os detritos de macrófagos do poço e recolher o lisado celular num tubo de microcentrífuga. Verificação microscópica da lise dos macrófagos completo é fundamental para a recuperação de todas as leveduras internalizadas. </li><li> Prepara-se uma diluição de 100 vezes do lisado em PBS estéril, placa de 100 ul de meio sólido de YPD e incubar as placas a 30 ° C. </li><li> Após 1-2 dias, a contagem manual do número de C. glabrata colônias que apreceu em meio YPD, multiplique com o fator de diluição (2 horas UFC) e calcular a taxa de fagocitose, que se refere à percentagem de C. glabrata células que são ingeridas por THP-1, macrófagos, após co-incubação de 2 horas com a seguinte fórmula. Fagocitose% = [(UFCs em 2 h) / (CFU em 0 h)] X 100 </li><li> Para medir a taxa de replicação intracelular de C. glabrata células THP-1 em macrófagos, recolher levedura intracelular em diferentes momentos pós ie infecção. 4, 6, 8, 10, 12, e 24 horas, repetindo os passos 3,3-4,3. </li><li> Calcule vezes sobrevivência / replicação de C. glabrata em células THP-1, macrófagos, dividindo o total de UFC em qualquer ponto no tempo, com os de 2 horas (de levedura fagocitado). </li></ol> 5. Monitoramento de replicação intracelular Usando confocal Laser Microscopia <ol><li> Seguindo os passos descritos na secção 1, as sementes tratadas com PMA 5 x 10 5 células THP-1 em cada poço de dois lâminas de câmara de quatro poços e incuba-se a 37 ° C com 5% de CO 2 durante 12 horas. </li><li> Substituir meio velho pré-aquecido com meio RPMI-1640 completo e permitir que as células se recuperar a partir do tratamento de PMA durante 12 horas. </li><li> Prepare GFP (proteína fluorescente verde)-marcado C. suspensão de células glabrata, conforme descrito na Seção 2 e infectar a THP-1 macrófagos para um MOI de 1. Se C. glabrata estirpes expressando GFP não está disponível, as células de levedura marcado com FITC (isotiocianato de fluoresceína) pode ser utilizado para monitorar eventos precoces pós infecção viz. taxa de fagocitose e maturação phagolysosomal em 2 horas. </li><li> Incubar durante 2 horas a 37 ° C com 5% de CO 2, inverte-los cuidadosamente para descartar meio e lavar 3x com estéril, pré-aquecido PBS. </li><li> Adicionar 500 mL pré-aquecido RPMI-1640 completo medihum para cada câmara de uma corrediça e incube-a 37 ° C com 5% de CO 2 durante 22 horas. </li><li> Para corrigir 2 horas C. glabrata infectadas THP-1, macrófagos, adicionar 500 mL de 3,7% de formaldeído (em PBS) a cada uma das câmaras da outra corrediça e incubar-la à temperatura ambiente durante 20 min no escuro. </li><li> Lavar deslizar três vezes com PBS, adicionar 500 ul de Triton-X (0,7%), e incuba-se à temperatura ambiente durante 5 min no escuro. </li><li> Lavar 3x slides com PBS, remova câmara de cultura de slides e ar seque-o por 3-5 min no escuro. </li><li> Monte cuidadosamente uma lamela utilizando meio Vectashield montagem contendo DAPI (4 &#39;,6-diamidino-2-phenylindole) no slide evitando a formação de bolhas. Remova suavemente o excesso de líquido com Kimwipe e selar bordas lamela com unha polonês. Slides loja no escuro a 4 ° C até o uso. </li><li> Repita os passos 5,4 e 5,6-5,9 para processar células THP-1 24 horas após a infecção. </li><li> Células de imagem usando um confo de varredura a lasermicroscópio cal (objetiva 60X de imersão em óleo, a excitação a 405 nm e 488 nm para DAPI e GFP mancha, respectivamente). </li></ol>

<ol><li>Pfaller, M. A., Diekema, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Epidemiology+of+Invasive+Candidiasis%3A+a+Persistent+Public+Health+Problem%5BTitle%5D)+AND+%22Clin.+Microbiol.+Rev%22%5BJournal%5D)">Epidemiology of Invasive Candidiasis: a Persistent Public Health Problem.</a> Clin. Microbiol. Rev. 20 (1), 133-163 (2007).</li>
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<li>Gross, O., Poeck, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Syk+kinase+signalling+couples+to+the+Nlrp3+inflammasome+for+anti-fungal+host+defence%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Syk kinase signalling couples to the Nlrp3 inflammasome for anti-fungal host defence.</a> Nature. 459, 433-436 (2009).</li>
<li>Auwerx, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+human+leukemia+cell+line%2C+THP-1%3A+a+multifacetted+model+for+the+study+of+monocyte-macrophage+differentiation%5BTitle%5D)+AND+%22Experientia%22%5BJournal%5D)">The human leukemia cell line, THP-1: a multifacetted model for the study of monocyte-macrophage differentiation.</a> Experientia. 47 (1), 22-31 (1991).</li>
<li>Tsuchiya, S., Kobayashi, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Induction+of+maturation+in+cultured+human+monocytic+leukemia+cells+by+a+phorbol+diester%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">Induction of maturation in cultured human monocytic leukemia cells by a phorbol diester.</a> Cancer Res. 42 (4), 1530-1536 (1982).</li>
<li>Castaño, I., Kaur, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tn7-based+genome-wide+random+insertional+mutagenesis+of+Candida+glabrata%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Res%22%5BJournal%5D)">Tn7-based genome-wide random insertional mutagenesis of Candida glabrata.</a> Genome Res. 13 (5), 905-915 (2003).</li>
</ol>

Os autores declaram que não têm interesses financeiros concorrentes.

Sistema imune inata desempenha um papel importante no controle de infecções causadas por fungos oportunistas. Os macrófagos contribuem para antifúngicos defesa por ingestão e destruição do patógeno. Assim, a elucidação de fatores que são necessários para a sobrevivência e / ou neutralizar as funções antimicrobianas de macrófagos permitirão uma melhor compreensão das estratégias de virulência de fungos. Neste contexto, nós estabelecemos um sistema in vitro de modelo de cultura celular, utilizando macrófagos deri...

Espécies de Candida são a principal causa de infecções fúngicas invasivas risco de vida em pacientes imunocomprometidos 1. Candida glabrata, um patógeno nosocomial emergente, é o segundo ou terceiro mais frequentemente isoladas espécies de Candida de pacientes unidade de terapia intensiva, dependendo da localização geográfica 1-3. Filogeneticamente, C. glabrata, uma levedura de brotamento haplóides, é mais estreitamente relacionado com os Saccharomyces não modelo levedura patogênica cerevisiae do que patogênica Candida spp. incluindo C. albicans 4. Coerente com isso, C. glabrata carece de algumas características de virulência de fungos-chave, incluindo o acasalamento, a actividade proteolítica secretada e plasticidade morfológica 4-5. Embora C. O glabrata não formam hifas, pode sobreviver e replicar-se em macrófagos de ratinho e humanos 6-8 sugerindo que desenvolveu mecanismos de patogénese únicas. Não existe informação suficiente sobre as estratégias que C. glabrata emprega para sobreviver ambiente intracelular de macrófagos pobres em nutrientes e neutralizar respostas do hospedeiro não oxidativos montados por células do sistema imunológico do hospedeiro 5 oxidativo e. Um sistema modelo de macrófagos pertinente é um pré-requisito para delinear a interação de C. glabrata com células fagocíticas do hospedeiro através de abordagens de genômica e proteômica funcional. As células mononucleares do sangue periférico (PBMC) e os macrófagos derivados da medula óssea (BMDMs) de origem humana e de murino, respectivamente, têm sido anteriormente utilizados para estudar a interacção de C. glabrata com células do sistema imunológico do hospedeiro 7,9. No entanto, a dificuldade na obtenção de PBMC e BMDMs, a sua duração de vida limitada e variação intrínseca entre diferentes doadores de mamíferos restringir a utilização destas células como sistemas modelo versáteis. Aqui, descrevemos um método para o estabelecimento de um sistema in vitro para estudar a intracellulcomportamento de ar C. células glabrata em macrófagos derivados da linha celular monocítica humana THP-1. O objetivo geral deste protocolo foi a promulgar um sistema modelo de cultura de células simples, barato, rápido e reprodutível, que pode ser facilmente manipulado para estudar diferentes aspectos da interação patógeno-hospedeiro. Células THP-1 foram anteriormente usadas para decifrar a resposta imune do hospedeiro contra uma vasta gama de agentes patogénicos, incluindo as bactérias, vírus e fungos 10-12. Monocíticas THP-1, as células são fáceis de manter e podem ser diferenciados, após tratamento do éster de forbol, para os macrófagos, que imitam os macrófagos derivados de monócitos de ser humano e expressam marcadores de macrófagos adequados 13. As principais vantagens do THP-1, do sistema modelo de macrófagos são a facilidade de utilização e a falta de equipamento sofisticado requisito. O protocolo aqui apresentado é facilmente adaptável para estudar a interação de outros fungos patógenos humanos com hosAs células T do sistema imunológico. O processo actual pode também ser empregue para identificar os factores de virulência para o agente patogénico de interesse, utilizando telas de mutantes de elevada capacidade. Esta prova de conceito foi exemplificado pelo uso bem sucedido de THP-1 sistema de modelo de cultura para identificar um conjunto de 56 genes que são necessários para a sobrevivência de C. glabrata em macrófagos humanos 8.

<table><tbody><tr><td>Coleção de Cultura THP-1</td><td>American Type TIB</td><td>202</td><td>Linha celular de leucemia monocítica aguda humana</td></tr><tr><td>RPMI-1640</td><td>Hyclone</td><td>SH30096.01</td><td>Para manter células THP-1</td></tr><tr><td>Phorbol 12-miristato 13-acetato</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P 8139</td><td>Cuidado: YPD perigoso</td></tr><tr><td>&nbsp;</td><td>BD-Difco</td><td>242710</td><td>Para células Candida glabrata em crescimento</td></tr><tr><td>Formaldeído</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F8775</td><td>Para fixação de macrófagos THP-1 infectados com C. glabrata</td></tr><tr><td>Tampão salino tampolado com fosfato (PBS)</td><td></td><td></td> <td>Tampão (137 mM NaCl, 10 mM Fosfato, 2.7 mM KCl,&nbsp; pH 7.4) para lavagens</td></tr><tr><td>Citrato salino-sódico (SSC)&nbsp;</td><td></td><td></td><td>Tampão (3 M NaCl, 0,3 M citrato de sódio para concentração de 20x) para lavagens</td></tr><tr><td>Tampão</td><td></td><td></td> de pré-hibridização <td>Tampão (50% formamida, 5x Denhardt' s solução, 5x SSC, 1% SDS) para hibridização</td></tr><tr><td>Meio de montagem VECTASHIELD</td><td>Vector Labs</td><td>H-1200</td><td>Para montagem de lâminas para microscopia confocal</td></tr><tr><td>32P-labeled &alpha;-dCTP</td><td>JONAKI-BARC</td><td>LCP-102</td><td>Para radiomarcação de etiquetas de assinatura Placas de cultura de</td></tr><tr><td>tecidos de 100 mm</td><td>Corning</td><td>430167</td><td>Para cultura de células THP-1</td></tr><tr><td>Placa de cultura de tecidos de 24 poços</td><td>Corning</td><td>3527</td><td>Para realizar estudos de infecção por C. glabrata em macrófagos THP-1</td></tr><tr><td>Lâmina de vidro tratada com cultura de tecidos de 4 câmaras</td><td>BD Falcon</td><td>REF354104</td><td>Para imagem C. glabrata macrófagos THP-1 infectados</td></tr><tr><td>Hemocitômetro</td><td>Rohem Índia</td><td></td><td>Para enumeração de células</td></tr><tr><td>Microcentrífuga de mesa</td><td>Beckman Coulter</td><td>Microfuge 18</td><td>Para centrifugação de células em microtubos</td></tr><tr><td>Centrífuga de mesa</td><td>Remi</td><td>R-8C</td><td>Para centrifugação de células em tubos de 15 ml</td></tr><tr><td>Espectrofotómetro</td><td>Amersham Biosciences</td><td>Ultraspec 10</td><td>Para monitorizar a absorvância de células de levedura</td></tr><tr><td>Incubadora de placas</td><td>Labtech</td><td>Refrigerado</td><td>Para cultivar células C. glabrata</td></tr><tr><td>Incubadora Shaker</td><td>New Brunswick</td><td>Innova 43</td><td>Para cultivar células C. glabrata</td></tr><tr><td>Incubadora de CO2&nbsp; Thermo</td><td>Electron Corporation</td><td>Forma série 2</td><td>Para cultura de células THP-1</td></tr><tr><td>Microscópio confocal</td><td>Carl Ziess</td><td>Ziess LSM 510 meta</td><td>Para observar macrófagos THP-1 infectados com C. glabrata</td></tr><tr><td>Microscópio composto</td><td>Olympus</td><td>CKX 41</td><td>Para observar a máquina de PCR de macrófagos C. glabrata e THP-1</td></tr><tr><td></td><td>BioRad</td><td>DNA Engine</td><td>Para amplificar tags únicas de entrada e saída de DNA genômico</td></tr><tr><td>Forno de hibridização</td><td>Labnet</td><td>Problot 12S</td><td>Para hibridização&nbsp;</td></tr><tr><td>PhosphorImager</td><td>Fujifilm</td><td>FLA-9000</td><td>Para escanear membranas hibridizadas</td></tr><tr><td>Thermomixer</td><td>Eppendorf</td><td>Thermomixer Comfort</td><td>Para desnaturação de etiquetas de assinatura radiomarcadas Unidade de documentação de</td></tr><tr><td>gel</td><td>Alphainnontech</td><td>Alphaimager</td><td>Para visualizar DNA corado com brometo de etídio em géis de agarose</td></tr></tbody></table>

estabelecimento de um<em&gt; in vitro</em&gt; sistema para estudar o comportamento intracelular de<em&gt; candida glabrata</em&gt; em humanos thp-1 macrófagos

Establishment of an In vitro System to Study Intracellular Behavior of Candida glabrata in Human THP-1 Macrophages

Um sistema de modelo de cultura de células, se um mímico de perto as condições ambientais do hospedeiro, pode servir como uma alternativa barata, reprodutível e facilmente manipulável para sistemas de modelo animal para o estudo de um passo específico de uma infecção patogénica microbiana. Uma linha celular monocítica humana THP-1, o qual, após tratamento do éster de forbol, subdivide-se em macrófagos, anteriormente tem sido utilizado para estudar as estratégias de virulência de vários agentes patogénicos intracelulares, incluindo o Mycobacterium tuberculosis. Aqui, discutimos um protocolo para adoptar um modelo in vitro de cultura de células sistema usando THP-1 macrófagos para delinear a interação de um oportunista levedura Candida glabrata patógeno humano com células fagocíticas host. Este sistema modelo é simples, rápido, passíveis de telas de mutantes de alto rendimento, e não requer equipamentos sofisticados. A THP-1 experiência típica a infecção dos macrófagos leva aproximadamente 24 horas, com um adicional de 24-48 horas para permitir intracelular recuperadolevedura de crescer em meio rico para formadoras de colônia análise de viabilidade com base em unidade. Como outros sistemas in vitro do modelo, uma possível limitação dessa abordagem é a dificuldade em extrapolar os resultados obtidos para um circuito de célula imunológica altamente complexo existente no hospedeiro humano. No entanto, apesar disso, o protocolo atual é muito útil para elucidar as estratégias que um fungo pode empregar para evitar / neutralizar resposta antimicrobiana e sobreviver, adaptar e proliferar no ambiente pobre em nutrientes das células do sistema imunológico do hospedeiro.

Analisa Infecção tratados com PMA THP-1 macrófagos com C. tipo selvagem glabrata (em peso), as células revelaram que as células wt foram fagocitados por macrófagos, a uma taxa de 55-65%, após co-incubação de 2 horas. Além disso, C. glabrata células foram capazes de resistir a morte por THP-1 macrófagos e passou por uma moderada 5 - para aumento de 7 vezes no UFC após 24 horas de coculturing com THP-1 macrófagos 8. Replicação intracelular de células de tipo selvagem, transfo...

O presente artigo descreve um protocolo para estabelecer um sistema modelo de cultura de células in vitro para estudar a interação de um patógeno humano intracelular facultativo de fungos Candida glabrata com macrófagos humanos, que será uma ferramenta útil para aumentar o nosso conhecimento dos mecanismos de virulência de fungos.

Estabelecimento de um<em&gt; In vitro</em&gt; Sistema para estudar o comportamento intracelular de<em&gt; Candida glabrata</em&gt; Em humanos THP-1 macrófagos

A cell culture model system, if a close mimic of host environmental conditions, can serve as an inexpensive, reproducible and easily manipulatable ...

O objetivo geral deste procedimento é estabelecer um sistema de modelo de cultura in vitro para estudar o comportamento intracelular de um patógeno fúngico oportunista humano. Candida lab ratta em macrófagos derivados de uma linhagem celular mononuclear humana TP um. Para isso, os monócitos THP um são primeiramente tratados com quatro éster para diferenciá-los em macrófagos.Em seguida, macrófagos THP-1 são infectados com células canida GTA duas horas após a infecção. Células canida GTA não fagocitadas são removidas por lavagens com PBS e células intracelulares são recuperadas para estudos posteriores por osmose dos macrófagos infectados. Este protocolo pode ser utilizado para avaliar tanto a entrada de células canida GTA nos macrófagos quanto a maturação fagossomal e a resposta de citocinas em macrófagos THP-1 após infecção por canida GTA.Além disso, este protocolo pode ser ampliado para triar a biblioteca de mutantes do colaborador Candida quanto a perfis alterados de sobrevivência em macrófagos TSP-1 de maneira semiaberta de alto rendimento. A principal vantagem deste protocolo é que ele é relativamente barato, altamente reprodutível e facilmente adaptável a diferentes células im

establishment-an-vitro-system-to-study-intracellular-behavior-candida

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Imunologia e Infecção

Source: Montefusco-Pereira, C. V. et al. P. aeruginosa Infected 3D Co-Culture of Bronchial Epithelial Cells and Macrophages at Air-Liquid Interface for Preclinical Evaluation of Anti-Infectives. J. Vis. Exp.(2020)This video demonstrates a co-culture model of bronchial epithelial cells and macrophage-like cells at the air-liquid interface to study host-pathogen interactions. Pathogenic bacterial infection compromises epithelial membrane integrity, triggering macrophage-like cell activation and...

Establishing a Co-Culture Model to Study Host-Pathogen Interactions at the Air-Liquid Interface

Source: Lê-Bury, G., et al. Phagosome Migration and Velocity Measured in Live Primary Human Macrophages Infected with HIV-1. J. Vis. Exp. (2016)This video demonstrates live confocal imaging of HIV-1-infected human macrophages to visualize and quantify phagosome migration using GFP fluorescence and bright field tracking, providing insights into how HIV alters intracellular trafficking during Fc receptor–mediated phagocytosis.

Live Imaging of Phagosome Migration in HIV-1-Infected Human Macrophages

Neste vídeo, realizamos o ensaio de fagocitose microglial para neuroblastoma usando células-tronco pluripotentes induzidas. O ensaio ajuda a avaliar o comprometimento da função microglial em doenças neurodegenerativas.

Ensaio de fagocitose microglial: um ensaio in vitro para estabelecer o modelo de fagocitose microglial para células de neuroblastoma usando macrófagos iPSC

Neste vídeo, demonstramos o ensaio de eferocitose para estudar a depuração de células apoptóticas usando microscopia confocal. A eferocitose é um processo de várias etapas em que as células apoptóticas são engolidas por fagócitos e degradadas dentro de vesículas chamadas eferrossomos. Este protocolo fornece um método para visualizar porções internalizadas e não internalizadas de células apoptóticas individuais e quantificar a eferocitose.

Ensaio de Eferocitose de Células Fixas: Um Método para Estudar a Captação Eferocítica de Células Apoptóticas por Macrófagos Usando Microscopia de Fluorescência

Este vídeo demonstra um ensaio para quantificar o crescimento intracelular de parasitas em macrófagos derivados da medula óssea (BMMs). As células de macrófagos estão infectadas com os estágios invasivos móveis e imóveis de Leishmania, promastigotas metacíclicos e amastigotas, respectivamente. Os parasitas invadem os macrófagos, internalizando-se em um vacúolo parasitóforo e se multiplicando em seu interior. O crescimento do parasita intracelular é quantificado usando um microscópio após a...

Um ensaio in vitro para quantificar o crescimento intracelular do parasita em macrófagos

Descrevemos métodos para live-célula vídeo de...

Live-célula Microscopia vídeo de Fagocitose patógeno fúngico

Efferocytosis, a remoção fagocitária das células apoptóticas, é necessário para manter a homeostase e é facilitado por receptores e vias de sinalização que permitem o reconhecimento, a duração e internalização de pilhas apoptotic. Neste documento, apresentamos um protocolo de microscopia de fluorescência para a quantificação dos efferocytosis e a atividade das vias de sinalização de efferocytic.

Quantificação de Efferocytosis por microscopia de fluorescência de célula única

Apresentado aqui é um protocolo para detectar a produção de armadilha extracelular de macrófagos (MET) na cultura celular ao vivo usando microscopia e mancha de fluorescência. Este protocolo pode ser estendido para examinar marcadores específicos da proteína met por coloração de imunofluorescência.

Estimulação e visualização in vitro da liberação extracelular da armadilha em macrófagos humanos monocyte-derivados diferenciados

O mecanismo associado à fagocitose na infecção por Leishmania permanece mal compreendido. Aqui, descrevemos métodos para avaliar os primeiros eventos ocorridos durante a interação da Leishmania com as células hospedeiras.

Investigando a Faagocytose da Leishmania usando Microscopia Confocal

A técnica envolvendo a fagocitose de conídios fúngicos por macrófagos é amplamente utilizada para estudos avaliando a modulação da resposta imune contra fungos. O objetivo deste artigo é apresentar um método para avaliar a fagocitose e a capacidade de depuração de macrófagos mononucleares de sangue periférico humano estimulados com conídios de Trichoderma stromaticum .

Ensaio de viabilidade de conídios de Trichoderma stromaticum dentro de macrófagos mononucleares derivados do sangue periférico humano

Monócitos e macrófagos são células imunes muito plásticas e reprogramáveis, cruciais para a saúde e a doença. Eles sentem e respondem a uma ampla gama de estímulos adotando programas de diferenciação e fenótipos específicos. Padronizamos um modelo in vitro para estudar a polarização e reprogramação de macrófagos, fornecendo uma ferramenta valiosa para pesquisa.

Modelo de reprogramação de macrófagos derivados de monócitos humanos para ensaios in vitro

Aprenda a estabelecer um modelo in vitro para estudar o comportamento intracelular de Candida glabrata em macrófagos THP-1 humanos. Este protocolo permite avaliar mecanismos de virulência fúngica.

Estabelecimento de um In vitro Sistema para estudar o comportamento intracelular de Candida glabrata Em humanos THP-1 macrófagos (Vídeo) | JoVE Journal

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