Geração e quantificação 3-Dimensional de Arterial lesões em ratos por meio de tomografia óptica de Projeção

O objetivo geral deste procedimento é demonstrar como a tomografia de projeção óptica pode ser usada para visualização e quantificação tridimensional de lesões ateroscleróticas e neointimais no camundongo. Isso é feito primeiro gerando lesões arteriais em camundongos, cirurgicamente ou alimentando uma dieta rica em colesterol a camundongos com predisposição para desenvolver aterosclerose. O próximo passo é isolar a artéria alvo e escaneá-la usando tomografia de projeção óptica.

As etapas finais são realizar a reconstrução da imagem, identificar a lesão e medir o volume da lesão. Em última análise, os resultados podem mostrar reconstruções anatômicas da lesão e quantificação do volume da lesão e estreitamento arterial por meio da análise de imagens. Nosso grupo está interessado em entender os mecanismos subjacentes à formação de lesões que causam estreitamento arterial levando a complicações com risco de vida, como ataque cardíaco e acidente vascular cerebral.

Esta aplicação da tomografia de projeção óptica foi desenvolvida em nosso grupo pelo Dr. Nicholas Kirkby, trabalhando com a Dra. Lucy Lowe, e será demonstrada pelo Dr. Jung Shi Wu, que é um cientista de pós-doutorado que trabalha em nossos laboratórios. A principal vantagem dessa técnica sobre os métodos existentes, como histologia e imuno-histoquímica, é que ela é menos trabalhosa e permite análises tridimensionais em vez de bidimensionais. Esta técnica para induzir lesões da artéria femoral é modificada a partir daquelas por R e companhia e Sada e companhia.

O protocolo de texto explica como induzir lesões ateroscleróticas por manipulação dietética. Comece com um camundongo C 57 preto de 10 a 12 semanas pesando entre 25 e 30 gramas. Uma vez anestesiado, coloque o mouse em uma almofada quente para manter a temperatura corporal e fornecer isde flúor de dois a 3% por meio de um cone nasal.

Quando o camundongo não responder a um beliscão no dedo do pé, administre buprenorfina a 0,1 miligramas por quilograma. Em seguida, coloque o mouse de costas e raspe a superfície ventral do membro posterior esquerdo. Em seguida, faça uma incisão para expor os músculos do membro posterior superior entre a bifurcação da artéria poplítea e a parede abdominal.

Faça uma dissecção romba para isolar o nervo femoral da artéria e veia femoral durante todo o procedimento. Mantenha os tecidos úmidos com 1% de peso em volume licanino. Em seguida, coloque ligaduras de seda Mers temporárias 6.0 ao redor da artéria e veia femoral perto da parede abdominal e imediatamente abaixo do ramo com a artéria poplítea.

Estes são para controlar o fluxo sanguíneo. Em seguida, isole a artéria poplítea, dois a cinco milímetros distal ao ramo com a artéria femoral, e ligue a artéria poplítea sob a artéria poplítea. Coloque uma segunda ligadura.

Agora, faça uma pequena incisão para a inserção do fio na artéria poplítea imediatamente distal ao ramo com a artéria femoral. Aplique pressão na ligadura temporária proximal para evitar sangramento através da incisão e na artéria femoral em direção à parede abdominal. Insira um fio G de 0.014 polegadas com cerca de um a 1.5 centímetros.

Deixe-o no lugar por 30 segundos e remova-o. Em seguida, usando as ligaduras ligam, a artéria poplítea acima da incisão. Tenha cuidado para evitar a oclusão da artéria femoral.

Agora remova as ligaduras temporárias. Feche a ferida com suturas contínuas descontínuas usando 5.0 mercal. Em seguida, aplique o creme EMLA.

Permita que o animal recupere a consciência e o movimento na gaiola de recuperação antes de devolvê-lo à gaiola de casa. Espera-se que a perna mostre claudicação por dois ou três dias, mas isso não significa que o camundongo deva ser isolado. Para OPT, o camundongo deve ser sacrificado, induzir anestesia terminal de pentobarbital.

Em seguida, faça uma fixação de perfusão transcardíaca com exsanguinação. Agora isole as artérias femorais ou o arco aórtico e seus ramos. Remova qualquer material perial estranho no processo.

Em seguida, fixe o tecido em formalina tamponada a 10% neutra durante a noite. No dia seguinte, armazene o tecido em etanol a 70% ou prossiga incorporando as artérias em aeros filtrados a 1,5% de LMP. Abaixe suavemente o tecido nos aeros fundidos a cerca de 40 graus Celsius.

Apare os aeros para fazer uma forma cônica. Agora desidrate esta preparação em 100% de metanol por pelo menos 12 horas. Uma vez desidratado, limpe os vasos em uma mistura de um a dois de álcool benzo e benzoato de benzoato.

Deixe os vasos incubarem nesta solução por 12 a 24 horas. No dia seguinte, coloque a amostra limpa no tomógrafo, que deve ser pré-calibrado. A resolução é fixada em 1024.

Por 1024 pixels. Defina a ampliação para a área de interesse. O eixo Z será definido automaticamente para a mesma resolução.

O tamanho do voxel será de cerca de 200 mícrons. Em seguida, usando o canal Campo claro, posicione a amostra para que ela gire em torno de seu próprio eixo no centro do campo de visão. Usando o canal de emissão de um filtro GFP, defina o foco e ajuste a exposição para maximizar a faixa dinâmica da imagem.

Evite a supersaturação. Agora escaneie o vaso no GFP um canal de emissão apenas com passos de 0,9 graus. As amostras devem então ser devolvidas ao metanol a 100% por pelo menos 24 horas antes de serem incorporadas à cera.

Para análise histológica, abra as imagens adquiridas no software de reconhecimento n ou software similar usando o software visualizador de dados. Verifique a qualidade da reconstrução da imagem, melhore a qualidade da imagem, ajuste a intensidade da imagem e faça com que o software compense qualquer desalinhamento da amostra em relação ao seu eixo rotacional ideal. Para cada varredura, defina a região vertical de interesse que contém a lesão.

Em cada 50ª linha de varredura, trace a borda entre o meio e a posição da lâmina elástica interna. O software pode então interpolar a borda em todas as outras varreduras, verificar manualmente essas interpolações e corrigi-las conforme necessário. Agora produza um conjunto de imagens binárias com os pixels brancos representando a neoíntima e os pixels pretos representando o lúmen patente.

Isso é feito definindo os limites de intensidade. Feito isso, o volume do objeto é o volume total da lesão e o volume luminal é o volume total, menos o volume do objeto. Assim, avalia-se a distribuição da lesão e do lúmen ao longo do comprimento axial.

As artérias femorais murinas foram colhidas 28 dias após a lesão induzida por fio ou ligadura. O espessamento neointimal foi evidente nas projeções de emissão em lâminas bidimensionais reconstruídas. Lesões neointimais concêntricas podiam ser distinguidas.

Imagens de emissão de tomografia de projeção óptica de todo o arco aórtico de um camundongo deficiente em APOE identificaram as lesões esperadas na curvatura menor do arco aórtico, na artéria braquiocefálica e nas origens das artérias carótida esquerda e subclávia. A mesma lesão foi segmentada e apresentada em vermelho. Para enfatizar a distribuição das placas quando sobrepostas à imagem original, a média e o lúmen puderam ser distinguidos em imagens transversais mostrando que se tratava de lesões excêntricas.

Aqui, à medida que a varredura se move distalmente ao longo desses ramos, as lesões gradualmente se reduzem e desaparecem primeiro na artéria subclávia, depois na carótida e, finalmente, na artéria braquiocefálica. Curiosamente, essa lesão na artéria braquiocefálica passa para o divisor de fluxo à medida que esse vaso se divide nas artérias carótida direita e subclávia direita. Após o procedimento OPT, outros métodos como histologia e imuno-histoquímica podem ser realizados para responder a perguntas adicionais, como qual é a composição da lesão?

Assim, após seu desenvolvimento, essa técnica abriu caminho para os cientistas que trabalham no campo da pesquisa vascular investigarem o papel dos receptores endoteliais, lectinas e enzimas metabolizadoras de esteróides no desenvolvimento de lesões neointimais e ateroscleróticas. Depois de assistir a este vídeo, você deve ter uma boa compreensão de como obter e analisar lesões de artérias rine usando tomografia de projeção óptica.