Análise do conteúdo de ácidos graxos e composição em Microalgas

O objetivo geral deste procedimento é medir o teor total e a composição de ácidos graxos em microalgas. Isso é realizado primeiramente preparando uma amostra contendo uma quantidade conhecida de biomassa de algas liofilizadas. O segundo passo é romper a biomassa microalgal.

Em seguida, os componentes lipofílicos são extraídos e isolados. O passo final é a transesterificação dos lipídios da ACell em ésteres metílicos de ácidos graxos. Em última análise, a cromatografia gasosa é utilizada para quantificar os ácidos graxos.

A principal vantagem desta técnica em relação a métodos existentes, como as determinações de tric, é que este método é muito preciso e mede especificamente todos os ácidos graxos e todos os outros componentes lipofílicos. Demonstrará o procedimento NDI Afer, um técnico do nosso laboratório. Antes de iniciar este procedimento, determine a concentração de peso seco de algas em gramas por litro no caldo de cultura, conforme detalhado na referência listada. Transfira um volume de caldo de cultura que contenha de cinco a 10 miligramas de peso seco de algas para um tubo de centrífuga de vidro.

Calcule a quantidade exata de biomassa transferida utilizando a concentração de biomassa determinada anteriormente, centrifugue a amostra por cinco minutos a 1200 Gs. Descarte parte do sobrenadante, deixando aproximadamente 0,25 mililitros no tubo. A seguir, re-suspenda as algas no sobrenadante remanescente pipetando suavemente o precipitado para cima e para baixo, e transfira a mistura celular para um tubo do homogeneizador de esferas.

Usando uma pipeta de 200 microlitros, enxágue o tubo de centrífuga e a ponteira com mais ou menos 0,15 mililitros de água milli Q e transfira o líquido para o tubo do homogeneizador de esferas. Centrifugue o tubo do homogeneizador de esferas por um minuto à velocidade máxima em RPM para garantir que não permaneçam bolhas de ar no fundo do tubo. Ao finalizar, liofilize o material no tubo seguindo este procedimento.

Prepare uma solução de 50 miligramas por litro de tripenta deano em uma proporção volumétrica enriquecida de clorofórmio para metanol. Usando uma pipeta de deslocamento positivo, adicione um mililitro da solução de tripé ao tubo de microesferas. Verifique se não há microesferas remanescentes dentro da tampa do tubo agitador, pois isso resultará em vazamento das microesferas do tubo.

Bata o tubo do agitador de esferas oito vezes a 2.500 RPM durante 60 segundos cada vez, com um intervalo de 122º entre cada agitação. Em seguida, transfira a solução com as esferas do tubo do agitador de esferas para um tubo de centrífuga de vidro resistente ao calor, limpo, de 15 mililitros, com tampa rosqueável de inserção em teflon. Lave o tubo do agitador de esferas com um mililitro da solução de tripé, sem solução, e transfira a lavagem para o tubo de centrífuga de vidro.

Repita mais duas vezes. Vortexe a amostra por cinco segundos e, em seguida, sonique-a por 10 minutos. Após a sonicação, adicione 2,5 mililitros de uma solução aquosa com pH 7 contendo 50 milimolar de triss e cloreto de sódio 1 molar ao tubo de centrífuga.

Após o vortex e uma segunda sonicagem da amostra, centrifugue-a por cinco minutos a 1200 ×g. Ao finalizar, transfira cuidadosamente a fase inferior de clorofórmio para um tubo de vidro limpo usando uma pipeta de vidro, repetindo a extração com um mililitro de clorofórmio. Após a conclusão, colete a fase de clorofórmio utilizando uma pipeta de vidro e reúna-a com a primeira fração de clorofórmio.

Evapore o clorofórmio usando um fluxo de gás nitrogênio para obter os lipídios extraídos secos. Em seguida, adicione três mililitros de metanol contendo 5% de ácido sulfúrico ao tubo contendo os lipídios extraídos secos e feche-o bem. Agite a amostra em vórtex por cinco segundos.

Incube as amostras por três horas a 70 graus Celsius em um aquecedor de bloco. Periodicamente, verifique se as amostras não estão entrando em ebulição e vortexie o tubo após cada verificação. Uma vez que a amostra seja resfriada à temperatura ambiente, adicione três mililitros de água millicúbica e três mililitros de n-heano ao tubo, seguido de mistura vortex.

Agite a amostra durante 15 minutos com um rotador de tubos de ensaio. Após remover as amostras do rotador de tubos de ensaio, centrifugue-as por cinco minutos a 1200 Gs. Usando uma pipeta de vidro Pasteur, colete dois mililitros da fase superior de hexano e transfira para um tubo de vidro limpo. Para lavar a fase de hexano coletada, adicione dois mililitros de água milli Q ao tubo de vidro.

Em seguida, agite a amostra em vórtex por cinco segundos e centrifugue por cinco minutos. A 1200 Gs, transfira a fase de hexano do tubo de vidro para um frasco de CG usando uma pipeta de vidro Pasteur. Em seguida, coloque uma tampa no frasco de CG e aperte bem para evitar a evaporação do solvente.

Coloque o frasco da amostra no amostrador automático do instrumento de GC. Por fim, analise a amostra no instrumento com uma coluna nova, utilizando uma vazão total de 20 mililitros por minuto e um volume de injeção de um microlitro. Consulte o protocolo descrito no texto para as especificações da coluna e condições cromatográficas.

Um cromatograma típico obtido por meio desse processo é mostrado aqui. Os ésteres metílicos de ácidos graxos são separados por tamanho e grau de saturação pela coluna de CG, e o protocolo utilizado indica que ácidos graxos de cadeia mais curta e com maior saturação possuem tempos de retenção mais curtos. A coluna de CG e o protocolo utilizados não têm a finalidade de separar isômeros de ácidos graxos, mas isso poderia ser alcançado usando uma coluna de CG e um protocolo diferentes.

O teor e a composição de ácidos graxos de C Desus UEX 3 93 sob condições de suficiência e privação de nitrogênio são apresentados aqui. Os teores totais de ácidos graxos foram de 8,6 ± 0,5% e 44,7 ± 1,7% sob condições de cultivo com nitrogênio suficiente e com privação de nitrogênio, respectivamente. Esses valores demonstram que a composição e o teor de ácidos graxos são altamente afetados pela privação de nitrogênio.

Em ESBL, o ácido palmítico e o ácido oléico são os dois ácidos graxos mais abundantes. Veja o protocolo no texto para obter detalhes sobre o cálculo do teor e da composição de ácidos graxos. O teor e a composição de ácidos graxos de Odum Trico UEX 6 4 0 em condições de suficiência e privação de nitrogênio são mostrados aqui.

De forma semelhante às UUs oblíquas, o teor e a composição de ácidos graxos são fortemente afetados pela privação de nitrogênio. Em condições de nitrogênio suficiente e deficiente, os teores totais de ácidos graxos foram de 11,7 ± 0,9% e 30,5 ± 1,1%, respectivamente. P. trium também produz quantidades consideráveis de ácidos graxos altamente insaturados, como I csap e ácido penta IC.

Além disso, ácidos graxos de cadeia muito longa, como o ácido língero, também podem ser detectados por este método. Este procedimento pode ser estendido mediante inclusão de uma etapa de separação do coágulo lipídico entre a extração de lipídios e uma etapa de transesterificação para obter informações adicionais sobre a composição das classes lipídicas do micro LG, conforme descrito nas referências no texto do protocolo.