2.10: Purificação de Gel

A purificação em gel é um procedimento padrão realizado para recuperar fragmentos de DNA desejados de géis de agarose após a separação eletroforética. Depois de dissolver o fragmento de gel e passá-lo por um filtro especializado, esse procedimento produz DNA livre de impurezas, como sais, nucleotídeos livres e enzimas, adequado para aplicações a jusante.

O princípio básico por trás da recuperação do DNA do gel de agarose envolve uma sequência de etapas de ligação, lavagem e eluição. Uma vez que o gel está no tampão solubilizante, ele é aplicado em uma "coluna de rotação", que, após centrifugação, permite que as moléculas de DNA se liguem seletivamente a um filtro de sílica enquanto as impurezas fluem para um tubo de coleta.

O DNA é capaz de se ligar à sílica graças a uma alta concentração de sal no tampão de solubilização do gel. Acredita-se que esse tampão interrompa a estrutura de hidratação ao redor do filtro e crie uma ponte salina catiônica entre as fortes cargas negativas no filtro e as cargas negativas no DNA. As impurezas residuais são removidas por lavagem com etanol.

Água ou tampão com baixo teor de sal é adicionado à coluna e irá "eluir," ou livre, o DNA dele, presumivelmente interrompendo a ponte catiônica. O DNA agora é purificado do gel.

A primeira etapa no procedimento de purificação do gel envolve a fundição do gel de agarose e a realização da eletroforese das amostras de DNA. Uma vez concluída a execução do gel, os fragmentos de DNA desejados são visualizados contra a luz ultravioleta e os fragmentos são selecionados após a comparação com um padrão de peso molecular.

Se o gel não estiver corado, a localização da banda pode ser determinada aproximadamente com base em uma comparação com a escada de DNA. Ao cortar o gel com uma lâmina de barbear, deve-se ter o cuidado de recuperar o máximo de DNA possível com o mínimo de agarose possível.

Ao manusear géis manchados com brometo de etídio e trabalhar na frente da luz ultravioleta, luvas e óculos de proteção devem ser usados. Depois de cortar o DNA desejado do gel, descarte o gel e o tampão de corrida adequadamente, em conformidade com os protocolos de segurança institucionais.

Uma vez isolado, o pedaço de gel é colocado em um tubo de microcentrífuga e pesado em uma balança. Usando a aproximação de que 100 mg de gel ocupam 100 l, um volume de tampão de solublilização que é 4X o peso do gel é adicionado à peça de gel. Depois de ser colocado em tampão, o pedaço de gel é incubado a cerca de 50 C para derreter a agarose.

Uma vez derretido, o gel solubilizado é adicionado a uma coluna giratória e a solução é centrifugada, o que fará com que todo o DNA e outras partículas grudem no filtro.

Em seguida, o DNA ligado é lavado adicionando etanol a 70% ao filtro, seguido de centrifugação, que removerá as impurezas residuais do filtro. O fluxo é descartado e essa etapa de lavagem é geralmente repetida até três vezes. O filtro vazio é girado novamente para remover o etanol residual e o filtro de sílica é deixado secar à temperatura ambiente. Água ou tampão de eluição é adicionado ao filtro e, com outra rodada de centrifugação, o DNA purificado é coletado no fundo do tubo.

O método que você acabou de ver se aplica à purificação de gel com filtros de coluna de rotação de sílica. Existem outros métodos que fazem uso dos mesmos princípios básicos de ligação do DNA à sílica, seguidos de etapas de lavagem e eluição. Por exemplo, a sílica pode ser misturada com DNA em uma suspensão chamada "leite de vidro", que pode ser peletizado e lavado, e posteriormente eluído. Além disso, a sucção pode ser usada para puxar o DNA através de filtros de sílica e, posteriormente, eluí-lo. Certifique-se de entender os procedimentos de purificação de gel do seu laboratório.

Agora que você aprendeu como recuperar DNA de géis de agarose, vamos examinar algumas aplicações a jusante que usam DNA obtido da purificação em gel.

Por exemplo, a purificação em gel é uma etapa intermediária na Imunoprecipitação da Cromatina, uma técnica que visa isolar as proteínas reguladoras que agrupam o DNA genômico, a fim de identificar quais sequências estão sendo reguladas. Os fragmentos isolados são purificados em gel e sequenciados, a fim de serem mapeados nas regiões cromossômicas individuais.

A subclonagem - o processo de mover um gene de um vetor para outro - pode envolver a purificação do gel. Por exemplo, sequências de genes de um vetor podem ser digeridas de uma construção e montadas em sequências quiméricas via PCR, após o que são purificadas em gel e colocadas em outras construções.

Talvez a aplicação mais simples da purificação em gel seja seu uso após armazenamento de longo prazo a -80? C de bandas de DNA excisadas após eletroforese.

Agora você aprendeu como extrair fragmentos de DNA do gel de agarose, as variações dos procedimentos de ligação, lavagem e eluição seguidos de acordo com a preferência individual do usuário e, finalmente, algumas das possíveis aplicações a jusante desse método. Como sempre, obrigado por assistir.