A Multi-eletrodo Sistema patch-clamp assistida por computador

O objetivo geral deste procedimento é realizar gravações de patch clamp de até 12 células no modo de célula inteira. Isso é feito marcando primeiro a posição de cada célula de interesse e atribuindo uma pipeta a cada célula. O segundo passo é localizar a ponta de cada pipeta e mover automaticamente as pipetas ao lado de suas células atribuídas.

Em seguida, aproxime-se de cada célula com uma pipeta de cada vez. Para estabelecer vedações herméticas com a membrana celular, a etapa final é romper a membrana das células e realizar gravações de células inteiras. Em última análise, a gravação de grampo de patch de eletrodo múltiplo assistida por computador é usada para mostrar as propriedades de rede de pequenos circuitos neuronais com alta resolução.

A principal vantagem dessa técnica sobre os métodos existentes, como o patch clamp manual, é que o número de conexões que podem ser observadas em uma rede cresce com o quadrado do número de neurônios que estão sendo registrados. A demonstração visual dessa técnica é importante porque as etapas do patch clamp podem ser difíceis de aprender devido à complexidade e à velocidade com que precisam ser executadas. Comece este procedimento colocando uma fatia de cérebro com a região de interesse no centro da faixa de deslocamento do microscópio.

Em seguida, identifique as células de interesse. Em seguida, salve a posição das células com base no sistema de coordenadas do microscópio. A interface gráfica exibirá as células selecionadas, bem como as micropipetas para uma visão geral global, e o software adicionará um marcador na posição da célula que será sobreposto nas imagens.

Além disso, uma imagem da célula é capturada para referência futura. Depois de selecionar as células de interesse, atribua as pipetas que serão usadas para registrar as células individuais, definindo os controles de atribuição na interface gráfica. Visualize uma visualização da configuração final marcando a caixa de seleção mostrar posições finais.

Agora prepare as pipetas com solução intracelular e coloque-as em seus suportes. Coloque os estágios da cabeça em suas fixações, mas não os deslize para frente. Para evitar tocar no banho com a ponta da pipeta, ative o controle de pressão positiva e selecione todas as pipetas.

Para garantir que as pontas permaneçam limpas, deslize suavemente cada estágio da cabeça no lugar. Em seguida, posicione o microscópio em uma posição central com o foco de dois milímetros acima da fatia pressionando o botão R dois enquanto segura o botão A. Use a posição correspondente para cada manipulador armazenado no experimento anterior pressionando o botão L dois enquanto segura o botão A.At este ponto, deve haver uma sombra distinta da pipeta à vista ou um pequeno movimento ao longo do eixo da pipeta deve ser suficiente para observá-lo. A compensação das pequenas diferenças no formato da pipeta deve ser realizada manualmente.

Em seguida, coloque a ponta da pipeta em foco. Em seguida, coloque a ponta no ponto central vermelho da tela de vídeo. Sem mover o microscópio, informe ao software que a pipeta está no centro do visor pressionando o botão Z enquanto segura o botão C do controlador.

Depois que a ponta da pipeta individual for localizada, envie-a para trás para que a seguinte possa ser localizada pressionando o botão L um enquanto mantém pressionado o botão a. Uma vez que todas as ponteiras de pipeta tenham sido localizadas com precisão e cada pipeta seja atribuída a uma célula. Posicione automaticamente as pipetas próximas às suas respectivas células, simplesmente clicando com o botão direito do mouse no centro do grupo de células na janela de representação gráfica e selecionando a opção cluster no menu pop-up.

Na janela de opções do cluster, selecione todas as pipetas que deseja posicionar neste momento e clique em ir com as pipetas marcadas. Repita este procedimento para cada aglomerado de células de interesse. Para realizar a abordagem final, especifique a posição das pipetas em relação às células a 200 mícrons de distância da célula no eixo da pipeta e 200 mícrons acima dela na direção vertical, o que é suficiente para manter a ponta da pipeta fora do tecido.

Em seguida, aguarde até que o posicionamento das pipetas seja concluído. Em seguida, mova o microscópio em direção à pipeta pressionando o botão R um enquanto segura o botão C.Recalibre cada posição da pipeta focando o microscópio em sua ponta em qualquer lugar da tela de vídeo e pressionando o botão B enquanto segura o botão C.Uma grade quadrada deve aparecer brevemente indicando a posição identificada da pipeta. Se a posição não estiver correta, posicione a ponta no ponto central da tela de vídeo e pressione o botão Z enquanto segura o botão C do controlador.

Agora confirme se a célula de interesse para a pipeta atual está marcada corretamente, marcada ativamente. Caso contrário, mova o microscópio para combinar a célula de interesse com o ponto vermelho central marque a célula pressionando o botão Y enquanto segura o botão C.Em seguida, pressione o botão L dois enquanto segura o botão C.To posicione a pipeta a 200 mícrons de distância de sua célula atribuída, o microscópio se moverá automaticamente para a posição correspondente. Ajuste a posição da pipeta para que corresponda ao ponto vermelho.

Em seguida, ajuste o deslocamento da pipeta pressionando o botão R um. Enquanto segura o botão x. Ative o pulso de teste pressionando o botão L one enquanto segura o botão x.

Depois disso, mova lentamente a pipeta para a célula atribuída. Ao observar a formação de uma covinha na superfície da membrana da célula, aplique um breve pulso de pressão negativa pressionando o botão Y enquanto segura o botão Z para permitir que a pressão aplicada atinja a célula. Um potencial de retenção de cerca de 65 milivolts negativos deve ser estabelecido neste ponto pressionando o botão L dois enquanto segura o botão x.

Uma vez que um giga selo é formado para cada célula, comece a romper as membranas aplicando pressão negativa. Em seguida, use o sistema de aquisição de estimulação para realizar a gravação. Aplique pulsos ou trens de pulsos em células individuais, uma de cada vez, e observe as respostas das células restantes para mapear a conectividade entre essas células registradas.

Assim que as gravações terminarem, retire as pipetas lentamente do tecido clicando com o botão direito do mouse no botão de opção da mesa. Selecione pipetas recuadas de 500 mícrons para que as pipetas recuem uma curta distância ao longo de seus eixos. Em seguida, observe o desvio no potencial das células para recuar as pipetas até o fim.

Defina a velocidade de posicionamento para rápida e repita a mesma operação, mas escolha a opção todas. Remova as pipetas usadas deslizando suavemente para fora o cabeçote stages e desparafusando as pipetas dos suportes. Aqui está um exemplo de redes de conexões sinápticas diretas mapeadas em experimentos individuais.

Esses três diagramas de conectividade são conjuntos de 12 células parametálicas registradas na camada cinco com as respectivas distâncias interssomáticas. E aqui está o diagrama de conectividade sobreposto à coloração morfológica de células parametálicas registradas. Esta figura mostra o efeito do vizinho comum.

As colunas azuis indicam os pares de neurônios que estão conectados simultaneamente a pelo menos um outro neurônio na rede amostrada. Gráfico Uma probabilidade significativamente maior de estar interconectado. Aqui mostra que os pares de neurônios que compartilham vários vizinhos comuns ocorrem com mais frequência do que o esperado por acaso nas redes amostradas, a probabilidade de conexão dentro de pares de neurônios aumenta em função do número de vizinhos comuns compartilhados pelo pagador.

Essas propriedades, por sua vez, dão origem a pequenas redes agrupadas em mundos. Esta figura mostra a quantificação do recrutamento de células de Martin. Esta é uma representação gráfica de uma célula parametálica em vermelho que forma sinapses em uma célula Martin nty em azul, que por sua vez forma sinapses em uma segunda célula parametálica.

Em preto, a estimulação supra-limiar da célula parametálica leva ao recrutamento da célula Martin nty. Através da integração de potenciais pós-sinápticos excitatórios facilitadores, a célula Martin nty recrutada inibe a segunda célula parametálica. Este diagrama representa a estimulação de um número crescente de células parametálicas com patch clamped e os efeitos em outra célula parametálica.

Aqui estão os potenciais pós-sinápticos inibitórios médios registrados de uma célula parametálica em função do número de outras células parametálicas próximas que são estimuladas. A amplitude da inibição sináptica DYS em um circuito local tende a saturar quando nove ou mais células parametálicas são estimuladas e a fração de células que recebem inibição sináptica DYS aumenta rapidamente para um à medida que um número crescente de células parametálicas é estimulado. Ao tentar este procedimento, é importante manter as pontas das pipetas limpas e minimizar a distorção do tecido, evitando vasos sanguíneos e outras células durante a fase de aproximação.

Seguindo este procedimento, métodos adicionais podem ser empregados, como fotoestimulação, para abordar questões adicionais, como a inovação das células de grampo remendadas por outro tipo de célula. Depois de assistir a este vídeo, você deve ter uma boa compreensão de como acelerar e realizar o procedimento de fixação de patch para vários neurônios.