Name: A Multi-eletrodo Sistema patch-clamp assistida por computador (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-10-18T18:30:00.000+00:00
Duration: 11 min 1 s
Description: Aprenda a automatizar gravações patch-clamp multi-eletrodo para neurociência, permitindo registrar até 12 células simultaneamente. Este método computadorizado melhora a eficiência e qualidade no estudo de circuitos neurais.

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Gostaríamos de agradecer a Gilad Silberberg, Michele Pignatelli, Thomas K. Berger, Luca Gambazzi e Sonia Garcia para conselhos valiosos sobre melhorias para a automação de processo patch-clamp. Agradecemos Rajnish Ranjan para aconselhamento e assistência com implementação de software valioso. Este trabalho foi financiado em parte pelo projeto Synapse UE e, em parte, pelo Programa Ciência Fronteiras Humanos.

1. Preparação Equipamento <ol><li> Manipuladores de controle de um computador <ol><li> Conecte cada caixa controlador micromanipulador para um computador através de portas seriais (RS-232). </li><li> Implementar os comandos para posicionamento, consulta e ajustar as configurações para ser enviado através da porta serial. Problemas de velocidade e compatibilidade de hardware Dado C / C + + é recomendada como a linguagem de programação. </li><li> Padronizar o sistema de referência de modo a que os manipuladores de zero é a posição mais próxima possível no que diz respeito aos motores e movimento positivo é dirigido para fora a partir dos motores. </li><li> Posicione o microscópio em sua posição central de 2 mm acima da amostra de plano focal (coordenadas [0, 0, 2000]). </li><li> Loja, para cada manipulador, as coordenadas do local que permita que a ponta de uma pipeta a ser observada no centro do campo de visão do microscópio. Este é o ponto de referência inicial para cada eletrodo. </li></ol></li><li> Visuaposições dos eletrodos Lize. Ele é muito útil para ser capaz de controlar a posição de cada eletrodo durante um experimento. A representação gráfica é a forma mais intuitiva de realizar isto. Para o efeito os sistemas de referência de cada eletrodo e que do microscópio deve ser correspondido. Uma maneira simples de fazer isso é: <ol><li> Traga a ponta de um eléctrodo para o centro do campo de visão. </li><li> Guardar a posição de cada eixo do manipulador e cada eixo do microscópio. </li><li> Executar com o eixo x do manipulador de um movimento relativamente grande (1 mm). </li><li> Localize a ponta mais uma vez movendo-se apenas ao microscópio. </li><li> Calcula-se a diferença na posição do microscópio, uma vez que foi passado medido. Estas são as projeções do movimento do eixo do eletrodo sobre o eixo do microscópio. </li><li> Repita os passos de 2,3-2,5 para o Y e Z do manipulador eletrodo. Isto permite que uma matriz de projecções com o microscópio eixos a ser determinado (&lt;strong&gt; Figura 2) também chamada matriz de co-seno: <img alt="Equação 1" src="/files/ftp_upload/50630/50630eq1.jpg"></li><li> Inverter esta matriz para torná-lo possível calcular os movimentos, em três dimensões, necessários pelo manipulador eléctrodo para atingir uma dada posição no microscópio sistema de coordenadas: <img alt="Equação 2" src="/files/ftp_upload/50630/50630eq2.jpg"></li><li> Usando o ponto inicial de referência e a matriz de co-seno determinar a posição de cada eléctrodo no microscópio coordenadas. </li><li> Apresentar graficamente, com base no microscópio coordenadas, a posição de cada um dos eléctrodos em intervalos regulares. Optamos por usar C / C + + bibliotecas desenho (GDI +) para desenhar posições dos eletrodos a cada 40 milissegundos. </li><li> Repita os passos 1.2.1 - 1.2.7 cada vez ângulos do manipulador são alteradas ou se são necessárias mudanças de posição de vários milímetros, por exemplo, quando o tipo de eletrodo é alterado. </li></ol></li><li> Ativar o armazenamento do positions de características relevantes no tecido, como as células ou pontos de referência anatômicos, em microscópio coordena. </li><li> Adquirir vídeo e sobrepor informações relevantes. <ol><li> Mecanicamente alinhar o eixo-x de movimento do microscópio, com o eixo horizontal da câmara do microscópio. </li><li> Instale no computador um framegrabber com vídeo ao vivo e capacidade de sobreposição e um kit de desenvolvimento de software (SDK). </li><li> Implementar a operação de exibição de vídeo ao vivo com o SDK. </li><li> Converter o sistema de coordenadas do microscópio para o sistema de referência da câmara pela tradução adequada e escamação. </li><li> Desenhe as características relevantes em coordenadas de câmera e sobreposição no vídeo ao vivo a imagem resultante em intervalos regulares de cerca de 40 ms (Figura 3). </li></ol></li><li> Amplificadores de controle. <ol><li> Use o software amplificador para controlar as configurações do amplificador da interface. </li></ol></li><li> Control osciloscópios. <ol><li> Conecte os osciloscópios ao PC usando portas seriais. </li><li> Determine a escala do osciloscópio, acoplamento e resolução temporal para as diferentes etapas do processo de patch-clamp em tensão-clamp (por exemplo, eletrodo na banheira, formação de selo, a configuração de célula inteira) e corrente-clamp. </li><li> Envie os comandos de configuração do osciloscópio apropriadas sempre que os comandos de amplificação são emitidos a partir da interface. </li></ol></li><li> Pressão pipeta de controle. <ol><li> Montar um sistema de controlo de pressão de acordo com a Figura 4. <ol><li> Use uma fonte de alimentação de 12 V / 5 V para fornecer a cada componente eletrônico de forma adequada. </li><li> Ligue a saída de uma bomba de membrana para o buffer de pressão positiva (um recipiente de 100 ml). </li><li> Ligar a entrada de uma bomba de membrana para o buffer de pressão negativa (um recipiente de 100 ml). </li><li> Ligue o tubo porta-pipeta para um sensor de pressão no pressure sistema de controlo e uma válvula pneumática, que liga para o compartimento de pressão principal. </li><li> Ligar cada um dos tampões de pressão para uma válvula ligada ao compartimento de pressão principal. </li><li> Conectar uma válvula de pressão entre o compartimento principal e a atmosfera. </li><li> Conectar um sensor de pressão para o compartimento de pressão principal. </li><li> Conectar um sensor de pressão de cada tampão. </li><li> Ligar o sistema de controlo de pressão de uma placa de aquisição de dados. </li><li> Conecte cada sensor de pressão para uma entrada analógica. </li><li> Conecte cada válvula para uma saída digital. </li></ol></li><li> Retirar deslocamento de todos os sensores, abrindo as válvulas excepto as ligar às bombas de membrana e subtraindo a medida de pressão à pressão atmosférica. </li><li> Implementar o controle da pressão <ol><li> Definir na interface de um controle para ativar ou de-ativar o controle de pressão positiva para cada pipeta. </li><li> Definir uma pressão positiva mínima para a pipetas de cerca de 70 mbar. </li><li> Periodicamente (a cada 0,5 seg) detectar sempre que a pressão em pipetas sob controle de pressão ativo cai abaixo do limiar definido. </li><li> Após a passagem da cabeceira abrir o tampão de pressão positiva para o compartimento de pressão principal e esse compartimento para a pipeta em questão durante períodos breves (20 ms) até que a pressão nas pipetas é acima do limiar. Feche todas as outras válvulas. </li><li> De-ativar ainda mais o controle da pressão, como a aproximação final para uma célula de interesse é iniciada. </li></ol></li><li> Aplique uma pressão negativa para a formação selo <ol><li> Feche todas as válvulas e abra a válvula tampão pressão negativa em relação à pressão do compartimento principal e esse compartimento para a pipeta em questão para a duração do experimentador requer por manter um botão pressionado. </li></ol></li></ol></li><li> Centralize comandos para um dispositivo de interface humana. <ol><li> Conecte um wirele disponível comercialmentess gamepad para o PC. </li><li> Implementar leitura de status de joystick. Por exemplo, usar as bibliotecas do DirectX para C / C + + para realizar leituras a cada 5 ms. </li><li> Compare o estado atual com o estado anterior para detectar quais botões foram pressionado, liberado ou permanecer pressionado desde passo última vez. </li><li> Atribuir funções a cada botão no gamepad. Um exemplo deste mapeamento é mostrado na Figura 5. </li></ol></li></ol> 2. Patch-clamp Procedimento <ol><li> Preparar as fatias de cérebro da região de interesse. </li><li> Coloque uma fatia do cérebro de interesse, com a região de interesse no centro da faixa de deslocamento do microscópio. </li><li> Seleção celular <ol><li> Identificar células de interesse por navegar com o microscópio. Guarde a posição das células com base no microscópio sistema de coordenadas com um direito do mouse clique sobre o monitor de vídeo ao vivo na parte superior da célula de interesse. </li> A interface gráfica apresenta as células seleccionadas, assim como as micropipetas para uma visão geral e global do software irá adicionar um marcador na posição de célula que vai ser revestida sobre as imagens. Além disso uma imagem do celular é capturado para referência futura no arquivo 'celular #. Jpg'. </ol></li></ol><li> Atribuição de células para pipetas <ol><li> Depois de selecionar as células de interesse, atribuir pipeta que irá gravar cada célula. A interface gráfica fornece controles de atribuição que deve ser definido. Visualize uma prévia da configuração final selecionando a opção 'Mostrar posições finais. </li><li> Selecione cada pipeta para que a pré-visualização posição final é desejado ou marque a caixa 'Selecionar tudo'. Desativar a exibição de posição atual para melhor visualização, se necessário. </li></ol></li><li> Prepare as Pipettes <ol><li> Encha as pipetas (6-8 mohms são geralmente melhor se muitas pipetas são usados) wiª solução intracelular e carregá-los em seus titulares. Coloque os headstages em suas fixações, mas não deslizar para a frente para evitar tocar o banho com a ponta da pipeta. </li><li> Ativar o controle de pressão positiva e selecione todas as pipetas para garantir que as dicas permanecerá limpo. Deslize com cuidado cada headstage no lugar. </li></ol></li><li> Localizando as pontas de pipeta <ol><li> Posicione o microscópio para uma posição central, com foco três milímetros acima da fatia, premindo o botão R2, mantendo o botão 'A'. Use a posição correspondente para cada manipulador como armazenado a partir da experiência anterior, premindo o botão L2, mantendo o botão A. Nota: Neste ponto não deve ser uma sombra distintivo de uma pipeta em vista ou um pequeno movimento ao longo do eixo da pipeta deve ser suficiente para observá-lo na maioria dos casos. Compensação para as pequenas diferenças na forma pipeta tem de ser realizada manualmente. </li><li> Traga a ponta da pipeta em foco. Coloque a ponta no ponto central de vermelho da exibição de vídeo, sem mover o microscópio (que ainda deve estar na posição [0, 0, 2000]). </li><li> Informar o software que a pipeta está no centro da tela, pressionando o botão Z, mantendo o botão C. Após cada ponta da pipeta está localizado, enviar essa pipeta para trás de modo que o seguinte pode ser localizado, premindo o botão L1, mantendo o botão A. </li></ol></li><li> Aproximando-se as células <ol><li> Uma vez que todas as pontas de pipetas foram localizados com precisão e cada pipeta é atribuída a uma célula, posicionar automaticamente as pipetas perto das suas respectivas células. Simplesmente clique com o botão direito no centro do grupo de células e selecione a opção 'cluster' no menu pop-up. Na janela de opções do cluster que irá aparecer, selecione todas as pipetas que deseja posicionar neste momento e clique em 'Vá com todas as pipetas verificados. Repita esta operação para cada conjunto de células de interesse. </li><li> Perform a aproximação final manualmente. A posição das pipetas relativos às células podem ser especificados de forma diferente, mas normalmente é simplesmente de 200 mM para longe da célula do eixo da pipeta e 200 um acima dela, em sentido vertical, o que é suficiente para manter a ponta da pipeta de fora do tecido . Aguarde até que o posicionamento das pipetas está acabado e mover o microscópio no sentido de uma pipeta, premindo o botão R1 enquanto pressiona o botão C. </li><li> Recalibrar cada posição pipeta, concentrando-se o microscópio sobre a sua ponta em qualquer lugar do monitor de vídeo e pressionando o botão B enquanto segura o botão C. A grade quadrada deve aparecer brevemente indicando a posição identificada da pipeta. Se a posição não está correta, posicione a ponta no ponto central da exibição de vídeo e pressione o botão Z, mantendo o botão C. </li></ol></li><li> Estabelecer a configuração anexado à célula <ol><li> Confirme se a célula de interesse para a pipeta atual é corretamentemarcado. Caso contrário, se mover ao microscópio para coincidir com a célula de interesse, com o ponto central vermelho. Marcar a célula pressionando o botão Y, mantendo botão C. Pressione L2, mantendo o botão C para posicionar a pipeta de 200 mM de distância de sua célula atribuído, o microscópio passará automaticamente para a posição correspondente. </li><li> Ajuste a posição da pipeta para que coincida com o ponto vermelho. Ajustar o deslocamento pressionando o botão R1 enquanto pressiona o botão X. pipeta </li><li> Ative o pulso de teste pressionando o botão L1, mantendo o botão X. aproximar lentamente a pipeta para sua célula atribuído. </li><li> Ao observar a formação de uma depressão na superfície da membrana da célula aplicam-se um breve pulso de pressão negativa, premindo o botão Y, mantendo o botão Z para permitir que a pressão aplicada para alcançar a célula. Um potencial de realização de cerca de-65mV deve estabelecida neste ponto pressionando o botão L2, mantendo o botão X. </li></ol></li><li> A configuração de célula inteira<ol><li> Uma vez que um Giga-selo é formado, para cada célula, começa ruptura das membranas pela aplicação de pressão negativa. </li></ol></li><li> Realize gravações <ol><li> Use o sistema de estimulação / aquisição para realizar as suas gravações. Aplicar pulsos ou trens de pulsos em uma célula individual em um tempo e observar as respostas sobre as células restantes para mapear a conectividade entre as células gravadas. </li></ol></li><li> Recede pipetas <ol><li> Uma vez que as gravações terminarem, recuar pipetas lentamente do tecido clicando com o botão direito do mouse no botão de rádio de mesa. Selecione "Recede-&gt; Pipettes 500 mm 'para ter as pipetas recuar a uma curta distância ao longo de seus eixos. Observe a deriva no potencial das células (limpar as pontas, aplicando um pouco de pressão positiva pode ajudar). </li><li> Para diminuir pipetas todo o caminho de volta, definir a velocidade de posicionamento para 'Fast' e repetir a mesma operação, mas escolha a opção 'Todos'. Remover o usadopipetas, deslizando suavemente os headstages e desapertando as pipetas dos respectivos detentores. É útil para evitar torções titulares em suas órbitas pois isso pode interferir muito com a posição da ponta da pipeta. </li></ol></li>

<ol><li>Perin, R., Berger, T. K., Markram, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+synaptic+organizing+principle+for+cortical+neuronal+groups%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">A synaptic organizing principle for cortical neuronal groups.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 108, 5419-5424 (2011).</li>
<li>Berger, T. K., Silberberg, G., Perin, R., Markram, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Brief+Bursts+Self-Inhibit+and+Correlate+the+Pyramidal+Network%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Biol%22%5BJournal%5D)">Brief Bursts Self-Inhibit and Correlate the Pyramidal Network.</a> PLoS Biol. 8, e1000473(2010).</li>
<li>Fino, E., Yuste, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dense+inhibitory+connectivity+in+neocortex%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Dense inhibitory connectivity in neocortex.</a> Neuron. 69, 1188-1203 (2011).</li>
<li>Packer, A. M., Yuste, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dense%2C+Unspecific+Connectivity+of+Neocortical+Parvalbumin-Positive+Interneurons%3A+A+Canonical+Microcircuit+for+Inhibition%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Dense, Unspecific Connectivity of Neocortical Parvalbumin-Positive Interneurons: A Canonical Microcircuit for Inhibition.</a> J. Neurosci. 31, 13260-13271 (2011).</li>
<li>Berger, T. K., Perin, R., Silberberg, G., Markram, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Frequency-dependent+disynaptic+inhibition+in+the+pyramidal+network%3A+a+ubiquitous+pathway+in+the+developing+rat+neocortex%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Physiol%22%5BJournal%5D)">Frequency-dependent disynaptic inhibition in the pyramidal network: a ubiquitous pathway in the developing rat neocortex.</a> J. Physiol. 587, 5411-5425 (2009).</li>
<li>Kodandaramaiah, S. B., Franzesi, G. T., Chow, B. Y., Boyden, E. S., Forest, C. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Automated+whole-cell+patch-clamp+electrophysiology+of+neurons+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Methods%22%5BJournal%5D)">Automated whole-cell patch-clamp electrophysiology of neurons in vivo.</a> Nat. Methods. 9, 585-587 (2012).</li>
<li>Anastassiou, C. A., Perin, R., Markram, H., Koch, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ephaptic+coupling+of+cortical+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Ephaptic coupling of cortical neurons.</a> Nat. Neurosci. 14, 217-223 (2011).</li>
<li>Prakash, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Two-photon+optogenetic+toolbox+for+fast+inhibition%2C+excitation+and+bistable+modulation%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Methods%22%5BJournal%5D)">Two-photon optogenetic toolbox for fast inhibition, excitation and bistable modulation.</a> Nat. Methods. 9, 1171-1179 (2012).</li>
<li>Papagiakoumou, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Scanless+two-photon+excitation+of+channelrhodopsin-2%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">Scanless two-photon excitation of channelrhodopsin-2.</a> Nat Methods. 7, 848-854 (2010).</li>
<li>Ko, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+specificity+of+local+synaptic+connections+in+neocortical+networks%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Functional specificity of local synaptic connections in neocortical networks.</a> Nature. 473, 87-91 (2011).</li>
<li>Wickersham, I. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Monosynaptic+Restriction+of+Transsynaptic+Tracing+from+Single%2C+Genetically+Targeted+Neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Monosynaptic Restriction of Transsynaptic Tracing from Single, Genetically Targeted Neurons.</a> Neuron. 53, 639-647 (2007).</li>
<li>Liang, C. W., Mohammadi, M., Santos, M. D., Tang, C. -M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Patterned+Photostimulation+with+Digital+Micromirror+Devices+to+Investigate+Dendritic+Integration+Across+Branch+Points%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Patterned Photostimulation with Digital Micromirror Devices to Investigate Dendritic Integration Across Branch Points.</a> J. Vis. Exp. (49), e2003(2011).</li>
<li>Nikolenko, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((SLM+Microscopy%3A+Scanless+Two-Photon+Imaging+and+Photostimulation+with+Spatial+Light+Modulators%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Neural+Circuits%22%5BJournal%5D)">SLM Microscopy: Scanless Two-Photon Imaging and Photostimulation with Spatial Light Modulators.</a> Front Neural Circuits. 2, (2008).</li>
</ol>

Os autores declaram que não têm interesses financeiros concorrentes.

Uma questão imediata geralmente surge sobre a taxa de sucesso do procedimento foi descrito. Para altas taxas de sucesso preparação é essencial. Pipettes deve ter aberturas de ponta que são adequadas para os seres células gravadas. Filtração da solução intracelular para evitar pipetas entupidos também é importante. São impecáveis, pipetas acabadas de tirar são outra exigência. A distribuição binomial é o modelo mais simples que pode ser usado para entender como essas questões afetam o rendimento final. É razoável esperar...

A capacidade de gravar e estimular vários sites com precisão micrômetro é extremamente útil para experimentalmente alcançar uma melhor compreensão dos sistemas neuronais. Muitas técnicas têm sido desenvolvidas para este fim, mas nenhuma permite a resolução submillivolt conseguida pela técnica de patch-clamp, essencial para o estudo da actividade de sublimiar e potenciais pós-sinápticos individuais. Aqui vamos cobrir o desenvolvimento de um sistema de patch-clamp assistida por computador doze eletrodo destinado a registar simultaneamente e estimular um grande número de células individuais com uma precisão suficiente para o estudo da conectividade neuronal. Embora muitas outras aplicações pode ser concebida para um tal sistema, que se presta especialmente bem para o estudo da conectividade sináptica dado que o número de ligações possíveis dentro de um grupo de neurónios aumenta proporcionalmente ao quadrado do número de neurónios em causa. Por conseguinte, enquanto um sistema com três eléctrodos permite testar oocorrência de até seis ligações e na maioria das vezes a gravação de um único, a gravação doze neurónios permite testar a ocorrência de até 132 ligações e frequentemente mais de uma dúzia de observação (Figura 1). A observação de dezenas de ligações simultaneamente torna possível analisar a organização de redes pequenas e inferir propriedades estatísticas da estrutura de rede que não pode ser de outra forma sondado 1. Além disso, a estimulação precisa de numerosas células também permite a quantificação do recrutamento de células pós-sinápticas 2.

<table><tbody><tr><td>Microscópio</td><td>Olympus</td><td>BX51WI</td><td>40X Manipuladores de Objetiva de Imersão</td></tr><tr><td></td><td>Luigs Neumann</td><td>SM-5</td><td>Protocolo serial usado</td></tr><tr><td>Amplificadores</td><td>Axon Instruments</td><td>MultiClamp 700B</td><td>SDK usado</td></tr><tr><td>Camera</td><td>Till Photonics</td><td>VS 55</td><td>Saída analógica BNC</td></tr><tr><td>Framegrabber</td><td>Tradução de dados</td><td>DT3120</td><td>SDK usado</td></tr><tr><td>Osciloscópios</td><td>Tektronix</td><td>TDS 2014</td><td>Comunicação serial</td></tr><tr><td>Aquisição de dados</td><td>InstruTECH</td><td>ITC 1600</td><td></td></tr><tr><td>Aquisição de dados</td><td>National Instruments</td><td>PCI-6221</td><td>Biblioteca usada (.dll)</td></tr><tr><td>Válvula de pressão</td><td>SMC</td><td>SMC070C-6BG-32</td><td></td></tr><tr><td>Sensor de pressão</td><td>Honeywell</td><td>24PCDFA6G</td><td></td></tr><tr><td>Membrana bomba</td><td>Schego</td><td>Optimal</td><td></td></tr></tbody></table>

a multi-eletrodo sistema patch-clamp assistida por computador

A Computer-assisted Multi-electrode Patch-clamp System

A técnica de patch-clamp é hoje o método mais bem estabelecido para gravar a atividade elétrica dos neurônios individuais ou seus compartimentos subcelulares. No entanto, a realização gravações estáveis, mesmo a partir de células individuais, continua a ser um processo demorado de considerável complexidade. Automação de muitos passos em conjunto com display de informação eficiente pode ajudar muito experimentalistas na realização de um maior número de gravações com maior confiabilidade e em menos tempo. A fim de alcançar as gravações em grande escala que concluiu a abordagem mais eficaz não é de automatizar totalmente o processo, mas para simplificar os passos experimentais e reduzir as possibilidades de erro humano, enquanto que incorpora de forma eficiente a experiência do experimentador e o feedback visual. Com esses objetivos em mente, desenvolvemos um sistema assistido por computador que centraliza todos os controles necessários para uma experiência multi-eletrodo patch-clamp em uma única interface, um commercgamepad sem fio ei ra me nt disponível, durante a exibição de experimento relacionado informação e orientação pistas na tela do computador. Descrevemos aqui os diferentes componentes do sistema que permitiu reduzir o tempo necessário para atingir a configuração de gravação e substancialmente aumentar as chances de gravação com sucesso um grande número de neurónios em simultâneo.

Seguindo os métodos descritos acima, conseguimos realizar a gravação de células inteiras de até doze neurônios simultaneamente, praticamente duplicando o maior número de neurónios em simultâneo, até agora fixada patch. Exemplos de redes de ligações sinápticas directas entre neurónios piramidais gravada na camada V do córtex somatossensorial de ratos são apresentados na Figura 6. A determinação de perfis de probabilidade de ligação como função da distância inter-somática para...

Multi-eletrodo gravações de patch-clamp constitui uma tarefa complexa. Aqui nós mostramos como, através da automatização de muitas das etapas experimentais, é possível acelerar o processo conducente à melhoria qualitativa no desempenho e número de gravações.

A Multi-eletrodo Sistema patch-clamp assistida por computador

The patch-clamp technique is today the most  well-established method for recording electrical activity from individual  neurons or their subcellular ...

O objetivo geral deste procedimento é realizar gravações de patch clamp de até 12 células no modo de célula inteira. Isso é feito marcando primeiro a posição de cada célula de interesse e atribuindo uma pipeta a cada célula. O segundo passo é localizar a ponta de cada pipeta e mover automaticamente as pipetas ao lado de suas células atribuídas.Em seguida, aproxime-se de cada célula com uma pipeta de cada vez. Para estabelecer vedações herméticas com a membrana celular, a etapa final é romper a membrana das células e realizar gravações de células inteiras. Em última análise, a gravação de grampo de patch de eletrodo múltiplo assistida por computador é usada para mostrar as propriedades de rede de pequenos circuitos neuronais com alta resolução.A principal vantagem dessa técnica sobre os métodos existentes, como o patch clamp manual, é que o número de conexões que podem ser observadas em uma rede cresce com o quadrado do número de neurônios que estão sendo registrados. A demonstração visual dessa técnica é importante porque as etapas do patch clamp podem ser difíceis de aprender devido à complexidade e à velocidade com que precisam ser executadas. Comece este procedimento colocando u

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Research

JoVE Journal

Neuroscience

Neurociência

Este destina-se como uma introdução para o patch clamp de gravação a partir de oócitos Xenopus laevis. Abrange vitelínico remoção da membrana, a formação de um selo gigaohm (gigaseal), ea conversão opcional do patch para a topologia de fora-out.

Gravação de patch-clamp de canais iônicos Expresso em Oócitos Xenopus

Corrente iônica de canais BK é gravado usando técnicas de patch clamp. Canais BK são expressos...

Grampo patch e Técnicas de Perfusão para estudar canais iônicos Expresso em Xenopus Oócitos

Este protocolo descreve uma técnica chamada eletrofisiologia de patch clamp de célula inteira, que é um método para estudar propriedades elétricas de neurônios de Mauthner e outras células reticuloespinhais em embriões de peixe-zebra.

Eletrofisiologia de grampo de remendo de células inteiras: um método para estudar as propriedades elétricas dos neurônios

Este vídeo demonstra a caracterização das correntes catiônicas dos canais iônicos de melastatina tipo 4 (TRPM4) com potencial receptor transitório em células musculares lisas detrusoras usando a técnica de patch-clamp perfurado mediado por anfotericina B. A técnica ajuda a avaliar as propriedades biofísicas e farmacológicas dos canais iônicos.

Análise de Patch-Clamp Perfurado Mediada por Anfotericina B: Uma Técnica Eletrofisiológica para Estudar Correntes Iônicas em Células da Bexiga Urinária

Nós desenvolvemos uma preparação cordão intacto cérebro espinhal para gravar e monitorar a atividade elétrica através de patches gravação braçadeira dos neurônios e outras células Mauthner reticulospinais em embriões de peixe-zebra. Assim, somos capazes de gravar correntes sinápticas excitatórias e inibitórias, a atividade do canal voltagem-dependentes e potenciais de ação dos neurônios-chave em um embrião em desenvolvimento.

Grampo patch Gravações de Embryonic Cells Zebrafish Mauthner

Descrito aqui é um procedimento para a obtenção de longos trechos de gravação atual de um canal iônico com a técnica de patch-clamp anexado à célula. Este método permite observar, em tempo real, o padrão de open-close conformações dos canais que estão na base do sinal biológico. Estes dados informar sobre as propriedades dos canais nas membranas biológicas não perturbadas.

Um canal de gravação de patch-clamp anexado-Cell

A caracterização eletrofisiológica de cardiomiócitos derivados de células-tronco pluripotentes humanas (hPSC-CMs) é crucial para a modelagem de doenças cardíacas e para a determinação de respostas de fármacos. Este protocolo fornece as informações necessárias para dissociar e plaquear hPSC-CMs em matrizes de múltiplos eléctrodos, medir o seu potencial de campo e um método para analisar os intervalos QT e RR.

Análise eletrofisiológica de cardiomiócitos humanos derivados de células-tronco pluripotentes (hPSC-CMs) usando matrizes de múltiplos eletrodos (MEAs)

Este protocolo descreve como conduzir experimentos de grampos-grampos guiados por imagem usando um sistema desenvolvido recentemente para equipamentos de eletrofisiologia padrão in vitro .

Aplicação de correia de patch automatizada com guia de imagem para estudo de neurônios em fatias de cérebro

A gravação da único-fibra é uma técnica eletrofisiológicos eficaz que seja aplicável aos sistemas nervosos centrais e periféricos. Junto com a preparação de DRG intact com o nervo ciático Unido, o mecanismo da falha da condução é examinado. Ambos os protocolos melhoram a compreensão da relação do sistema nervoso periférico com a dor.

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