Name: Biossensores raciométrica que medem estado redox mitocondrial e ATP em células vivas de levedura (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-07-22T13:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 22 s
Description: Aprenda a medir o estado redox mitocondrial e níveis de ATP em células vivas de levedura usando biossensores raciométricos baseados em GFP. Este método oferece resolução subcelular para análise funcional.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Este trabalho foi apoiado por prêmios de HHMI 56006760 para JDV, o National Institutes of Health (NIH) (2 TL1 RR 24158-6) para DMAW, e da Fundação Médica Ellison (AG-SS-2465) e do NIH (GM45735, GM45735S1 e GM096445) para LP. GM45735S1 foi emitido a partir do NIH sob a Recuperação Americana e Reinvestimento de 2009. Os microscópios utilizados para estes estudos foram apoiados, em parte, através de uma subvenção NIH / NCI (5 P30 CA13696).

1. Transformação de células de levedura com o Biossensores <ol><li> Transformar a estirpe de levedura com o plasmídeo desejado Mito-roGFP ou mitGO-ATeam2 usando o método do acetato de lítio 27. </li><li> Para confirmar a transformação com o plasmídeo de biossensor de origem e para evitar a perda do plasmídeo, seleccionar e manter os transformantes no meio completo sintético selectivo apropriado (SC-Ura para Mito-roGFP, ou SC-Leu por mitGo-ATeam2). Se a sonda fluorescente foi subclonado num plasmídeo diferente do que os descritos aqui, o uso do meio selectivo apropriado. Visualiza transformantes por microscopia de fluorescência para confirmar que elas expressam o biossensor fluorescente e exibem morfologia mitocondrial normal. </li></ol> 2. Crescimento das células e preparação para a imagem A função celular e da resposta ao tratamento com medicamentos são altamente dependentes da densidade da célula e actividade metabólica. Os melhores resultados são obtidos quando as célulasestão dividindo activamente (fase mid-log, ~ 0,5-1 x 10 7 células / ml). A maneira mais fiável para gerar culturas de densidade consistente de fase mid-log é para inocular de uma pré-cultura em fase estacionária. <ol><li> Prepare uma pré-cultura estacionária-fase: escolher uma única colônia de células transformadas a partir de uma placa e inocular meios líquidos seletivos (5 ml em um tubo de 50 ml cônico-bottom). Crescer a 30 ° C com agitação a 225 rpm até a densidade óptica da cultura a 600 nm (OD 600) atingiu um patamar (24-48 h). </li><li> Prepare uma cultura fase mid-log para a observação: use o volume adequado de pré-cultura para inocular 5 ml de meios seletivos em um tubo de 50 ml cônico-bottom. Meios YPD é autofluorescente e não devem ser utilizados para estes estudos. Use, glicose base, abandono (SC-Ura) media completos sintéticos. Crescer as células a 30 ° C, agitação a 225 rpm, durante 4-16 horas, até que eles atinjam fase mid-log (~ 0,5-1 x 10 7 células / ml). A densidade celular pode ser determinadamedindo a OD 600; calibrar o espectrofotómetro para determinar a leitura de OD 600 correcto. No nosso Beckman DU530 (Beckman Coulter, Indianapolis, IN), a fase semi-log corresponde a uma DO 600 de 0,1-0,3. </li></ol> Mito-roGFP1 detecta flutuações no organelo em resposta a alterações metabólicas. Por exemplo, neste ensaio mitocondriais alterações de estado redox quando a levedura crescer em fontes de carbono fermentável (por exemplo, glucose, como em meio SC) em função das fontes de carbono não fermentáveis ​​(por exemplo, glicerol, tal como em meios SGlyc), e mesmo em diferentes lotes da mesma mídia. Consequentemente, a utilização do mesmo lote de meios para todas as experiências. <ol start="3"><li> Células estão prontas para a concentração (veja o passo 2.4) e imagem se nenhum tratamento está sendo realizado. Se as células estão a ser tratados, incubar as células com o tratamento adequado e continuar para a próxima etapa. </li><li> Concentre-se 1 ml de cultura por centrifugação a 6000 xg durante 15 seg eressuspensão do sedimento celular em 20 ul de meio. Estas condições de maximizar o número de células distintas no campo de visão. </li><li> Aplicar 2 ul das células ressuspensas para uma lâmina. Cobrir com uma lamela (n º 1.5, de preferência de alto desempenho 170 ± 5 m de espessura) e selar as bordas da lamínula com claro unha polonês ou valap (ver Reagentes). Para selar com valap, derreter uma pequena quantidade de uma espátula de metal, mantendo-a sobre uma chama de bico de Bunsen, em seguida, espalhar uma pequena quantidade ao longo das arestas da lamela. </li><li> Manter as células a 30 ° C durante a imagiologia. Um aquecedor objectiva sobre a lente de imersão em óleo 100x usado para geração de imagens funciona bem para esta aplicação. Sob estas condições, a morfologia mitocondrial, estado redox, e os níveis de ATP permanecem inalterados durante a imagem durante 10-15 min. </li></ol> 3. Configuração de imagem <ol><li> Configuração para imagens mito-roGFP1 em um microscópio de fluorescência de campo amplo Os passos aqui são adaptados para o AxioObserver.Z1 microscópio equipado com um LED fonte de excitação Colibri, um amplo campo de Orca ER câmera e software de aquisição Axiovision. Fotodegradação dos dois canais e fotoconversão de oxidados mito-roGFP1 é significativamente reduzido com uma iluminação LED em comparação com arco iluminação da lâmpada de mercúrio (veja abaixo). Para maximizar o sinal e resolução, usar a maior abertura numérica possível no objetivo, eo menor ampliação que fornece resolução espacial suficiente. Além disso, para imagiologia de mito-roGFP, verificar que o objectivo transmite bem a 365 nm. O 100x/1.3NA PlanNeofluar objetivo CE (Zeiss) funciona bem para esta aplicação. Configure o software de aquisição para capturar as espécies mito-roGFP1 oxidadas e reduzidas. Usamos as seguintes condições. <ol><li> Configure o canal de oxidado mito-roGFP usar excitação em 365 nm (100% LED de alimentação) e um filtro de emissão adequada para GFP, como o 38 HE filtrar set (Zeiss), com o excitatio incluídon filtro removido do cubo. A remoção do filtro de excitação permite excitação a 365 nm, ambas e 470 nm, sem a necessidade de mudar os filtros, aumentando assim a resolução de tempo possível. </li><li> Configurar o canal para a redução de mito-roGFP utilizar a excitação a 470 nm (100% da potência do LED) e, como mencionado acima, o mesmo cubo de filtro de emissão usado para a oxidação de mito-roGFP. Defina a câmara para 1x1 binning para otimizar resolução espacial. </li><li> Definir software para adquirir pilha az composto por 11 fatias com 0,5 mM espaçamento, coletando os dois canais em cada posição z. Este modo de aquisição é mais lenta do que a aquisição de cada pilha por sua vez, z, mas evita que o movimento de artefactos decorrentes mitocondrial entre a aquisição dos canais oxidados e reduzidos. </li><li> Imagem de várias células para determinar um tempo de exposição apropriado, produzindo um sinal forte, mas não de saturação. É importante manter a relação dos tempos de exposição para oxidada e reduzida de mito-roGFP1 para todos experimentos. Por exemplo, se os tempos de exposição para oxidada e reduzida de mito-roGFP1 são de 300 e 100 ms, respectivamente, então o tempo de exposição para oxidada Mito-roGFP1 deve ser de 3 vezes maior que para a redução de mito-roGFP para todas as experiências. </li></ol></li><li> Configuração para imagens mitGO-ATeam2 em um microscópio confocal espectral Para quantificar os níveis de ATP, utilizando mitGO-ATeam2, a fluorescência da GFP (máximos de emissão 510 nm) deve ser diferenciado de que a partir de OFP (emissão máxima de 560 nm). Há conjuntos de filtros de fluorescência que resolvem a fluorescência emitida a partir destes fluoróforos. No entanto, descobrimos que um detector espectral, disponível em microscópios de varredura confocal muitos laser, funciona melhor para esta aplicação. Um detector espectral separa a emissão de fluorescência em diversos componentes (normalmente 32 ou mais) com base no comprimento de onda. Várias bandas de comprimentos de onda adjacentes, podem ser combinados em um canal de imagem. Os comprimentos de onda a serem combinados são seleccionadas empiricamente de modo a maximizar o sinal de GFP e OFP, evitando cruzamento de sinal que iria confundir o traste medição. Utilizar a abertura numérica da lente mais elevada disponível. Nós usamos um 100x/1.49 ou 60x/1.49 lente Apo-TIRF. Usamos a Nikon A1R microscópio confocal executando o software NIS Elements. Configure o software de aquisição para capturar as espécies mitGO-ATeam2 ATP-bound e ATP-desacoplado. Usamos as seguintes condições. <ol><li> Definir pinhole de 1,0 unidades de Airy (UA), que no nosso sistema corresponde a resolução az de cerca de 0,42 mM. </li><li> Definir zoom digitalização para se aproximar do limite de amostragem de Nyquist, que irá maximizar a informação espacial na imagem. No nosso sistema o tamanho do pixel é de 0,12 um. </li><li> Como as mitocôndrias podem se mover durante o exame, pode ser útil para aumentar a velocidade de imagem, cortando o campo para 512 x 256 pixels. O tempo total requerido para a imagem de uma estrutura do nosso sistema, é de 1,0 segundos, incluindo uma média de varredura de 2 vezes. Dependendo da resolução espacial desejado, o campo pode ser posteriormente cortada para crese resolução de tempo. </li><li> Excite a 488 nm, e recolher emissão de 500-520 nm para GFP e 550-580 nm para OFP. Valores ideais reais podem variar de acordo com as características do sistema de imagem. </li><li> A potência do laser óptima para o nosso sistema situa-se entre 6,0 e 6,4%. A potência do laser óptima irá variar para cada sistema de microscópio, mas irá ser idealmente tão baixa quanto possível e ainda produzir uma imagem interpretável. Use um medidor de energia interna ou externa para monitorar mudanças na potência do laser, que ocorrem normalmente ao longo do tempo, em qualquer sistema óptico. </li><li> Ajuste o ganho do detector de intensidade de luz e iluminação para maximizar a gama de valores de pixel detectada mas evitar a saturação do sinal, para o maior número possível de células. Não analise todas as células que contenham mais de 1% pixels saturadas. Imagem todas as amostras utilizando o mesmo objectivo, a potência do laser, digitalização de zoom, tamanho do pixel, ganho e offset. </li></ol></li></ol> 4. Aquisição de Imagem <ol><li> Localize o pla focal<html> ne de células de interesse, utilizando luz transmitida para minimizar o branqueamento da sonda fluorescente. </li><li> Depois de localizar uma ou mais células de interesse, recolher um z-série, através de toda a espessura de uma célula típica (aprox. 7 mM), utilizando um tamanho de passo de 0,5 micron. </li><li> Imagem outras células de interesse no slide, mas não uma imagem de único slide por mais de 15 min. Depois de 15 minutos sobre a lâmina, as células perdem a viabilidade. </li></ol> 5. Análise Nível de ATP mitocondrial é determinada pela medição da proporção da emissão mitGO-ATeam2 a 560 nm a 510 nm em que 27 O estado redox do organelo é medida como a redução de oxidação (R / S) rácio de mito-roGFP,. Isto emissão a 510 nm a excitação a 470 nm dividido pela emissão a 510 nm a excitação a 365 nm. Antes de calcular a razão, nós subtrair fundo e determinar um valor limiar para os pixels que pertencem ao mitocôndrias fluorescente. tenda &quot;&gt; domínio público (por exemplo, ImageJ 30) ou comercialmente disponíveis (por exemplo Volocity, Perkin-Elmer) de software pode ser utilizado para a análise de mito-roGFP1 ou mitGO-ATeam2. Dependendo do software utilizado para a aquisição de imagens e para a análise, as imagens pode necessitar primeiro de ser convertido num outro formato, como TIFF, antes de abri-los no software de análise. Se as imagens são convertidas, é essencial para verificar que os valores de pixel não são mudadas durante a conversão. Análise de MITO-roGFP1 dados, usando ambos os programas é descrito abaixo. menus programa e as opções para selecionar dentro de cada menu são destacadas em negrito e itálico. 5.1 análise ImageJ <ol><li> Imagens abertas e tipo de alteração para 32 bit: Imagem → Tipo → 32 bits. </li><li> Desenhe uma região de interesse (ROI) em uma área onde não há células. Calcule a intensidade média nesta ROI: Analisar → Measure. </li><li> Subtrair o fundo média calculada a partir da pilha: Processo → Matemática → subtrair. </li><li> Usando o z-stack subtraídos, encontrar a fatia média e limiar em mitocôndrias: Imagem → Ajuste → Threshold e clique em Aplicar na janela do Threshold. Aplicar a todas as fatias na pilha. Verifique Definir fundo pixels de NaN. </li><li> Criar a relação z pilha: Processo → Image Calculator Divida a pilha reduzida pela pilha z oxidado para análise mito-roGFP1. Divida a imagem 560 nm (ATP bound) pelos 510 nm imagem (ATP não ligada) para análise mitGO-ATeam2. </li><li> Desenhe um ROI em torno da área de interesse. Escolha Analisar → Ferramentas → ROI Manager, e clique em Adicionar para registrar o ROI. Múltiplas regiões podem ser armazenadas no gestor. Em ROI Manager, selecione todos ROIs, em seguida, escolha Mminério → Multi-Measure para medir todas as fatias de pilha. Exportar dados para uma planilha para análise. </li></ol> 5.2 análise Volocity <ol><li> Importar imagens em uma biblioteca Volocity e criar uma sequência de imagens com 2 canais. </li><li> Desenhe uma região de interesse (ROI) em uma área onde não há células. Escolha: Tools → Ratio. </li><li> Use Volocity para calcular o background: Obter do ROI. </li><li> Ajustar o limiar para incluir estruturas mitocondriais. </li><li> Marque a opção de aplicar uma LUT arco-íris para o canal de relação. O canal de intensidade modulada pode produzir uma imagem menos barulhenta para apresen-tação, mas não deve ser usado para a quantificação da proporção média. </li><li> Selecione a guia de medição, selecione o canal de relação e desenhar um ROI em torno da área de interesse. Meça o canal de relação, excluindo os valores zero. Múltiplas regiões podem ser seleccionados e mediuao mesmo tempo. Exportar dados para uma planilha para análise. </li></ol>

<ol><li>Rizzuto, R., De Stefani, D., Raffaello, A., Mammucari, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitochondria+as+sensors+and+regulators+of+calcium+signalling%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+reviews.+Molecular+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Mitochondria as sensors and regulators of calcium signalling.</a> Nature reviews. Molecular Cell Biology. 13 (9), 566-578 (2012).</li>
<li>Nunnari, J., Suomalainen, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitochondria%3A+in+sickness+and+in+health%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Mitochondria: in sickness and in health.</a> Cell. 148 (6), 1145-1159 (2012).</li>
<li>McFaline-Figueroa, J. R., Vevea, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitochondrial+quality+control+during+inheritance+is+associated+with+lifespan+and+mother-daughter+age+asymmetry+in+budding+yeast%5BTitle%5D)+AND+%22Aging+Cell%22%5BJournal%5D)">Mitochondrial quality control during inheritance is associated with lifespan and mother-daughter age asymmetry in budding yeast.</a> Aging Cell. 10 (5), 885-895 (2011).</li>
<li>Hamilton, M. L., Van Remmen, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Does+oxidative+damage+to+DNA+increase+with+age%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Does oxidative damage to DNA increase with age.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 98, 10469-10474 (2001).</li>
<li>Cadenas, E., Davies, K. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitochondrial+free+radical+generation%2C+oxidative+stress%2C+and+aging%5BTitle%5D)+AND+%22Free+Radical+Biology+%26+Medicine%22%5BJournal%5D)">Mitochondrial free radical generation, oxidative stress, and aging.</a> Free Radical Biology & Medicine. 29 (3-4), 222(2000).</li>
<li>Mammucari, C., Rizzuto, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Signaling+pathways+in+mitochondrial+dysfunction+and+aging%5BTitle%5D)+AND+%22Mechanisms+of+Ageing+and+Development%22%5BJournal%5D)">Signaling pathways in mitochondrial dysfunction and aging.</a> Mechanisms of Ageing and Development. 131 (7-8), 536-543 (2010).</li>
<li>Lin, M. T., Beal, M. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitochondrial+dysfunction+and+oxidative+stress+in+neurodegenerative+diseases%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Mitochondrial dysfunction and oxidative stress in neurodegenerative diseases.</a> Nature. 443 (7113), 787-795 (2006).</li>
<li>Schon, E. A., Przedborski, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitochondria%3A+the+next+%28neurode%29generation%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Mitochondria: the next (neurode)generation.</a> Neuron. 70 (6), 1033-1053 (2011).</li>
<li>Taylor, E. R., Hurrell, F., Shannon, R. J., Lin, T. -K., Hirst, J., Murphy, M. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reversible+glutathionylation+of+complex+I+increases+mitochondrial+superoxide+formation%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Reversible glutathionylation of complex I increases mitochondrial superoxide formation.</a> The Journal of Biological Chemistry. 278 (22), 19603-19610 (2003).</li>
<li>Beer, S. M., Taylor, E. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Glutaredoxin+2+catalyzes+the+reversible+oxidation+and+glutathionylation+of+mitochondrial+membrane+thiol+proteins%3A+implications+for+mitochondrial+redox+regulation+and+antioxidant+defense%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Glutaredoxin 2 catalyzes the reversible oxidation and glutathionylation of mitochondrial membrane thiol proteins: implications for mitochondrial redox regulation and antioxidant defense.</a> The Journal of Biological Chemistry. 279 (46), 47939-47951 (2004).</li>
<li>Tretter, L., Adam-Vizi, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inhibition+of+Krebs+cycle+enzymes+by+hydrogen+peroxide%3A+A+key+role+of+%5Balpha%5D-ketoglutarate+dehydrogenase+in+limiting+NADH+production+under+oxidative+stress%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Neuroscience%3A+The+Official+Journal+of+the+Society+for+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Inhibition of Krebs cycle enzymes by hydrogen peroxide: A key role of [alpha]-ketoglutarate dehydrogenase in limiting NADH production under oxidative stress.</a> The Journal of Neuroscience: The Official Journal of the Society for Neuroscience. 20 (24), 8972-899 (2000).</li>
<li>Nulton-Persson, A. C., Szweda, L. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modulation+of+mitochondrial+function+by+hydrogen+peroxide%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Modulation of mitochondrial function by hydrogen peroxide.</a> The Journal of Biological Chemistry. 276 (26), 23357-23361 (2001).</li>
<li>Gardner, P. R., Fridovich, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effect+of+glutathione+on+aconitase+in+Escherichia+coli%5BTitle%5D)+AND+%22Archives+of+Biochemistry+and+Biophysics%22%5BJournal%5D)">Effect of glutathione on aconitase in Escherichia coli.</a> Archives of Biochemistry and Biophysics. 301 (1), 98-102 (1993).</li>
<li>Gardner, P. R., Raineri, I., Epstein, L. B., White, C. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Superoxide+radical+and+iron+modulate+aconitase+activity+in+mammalian+cells%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Superoxide radical and iron modulate aconitase activity in mammalian cells.</a> The Journal of Biological Chemistry. 270 (22), 13399-13405 (1995).</li>
<li>Schafer, F., Buettner, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Redox+environment+of+the+cell+as+viewed+through+the+redox+state+of+the+glutathione+disulfide%2Fglutathione+couple%5BTitle%5D)+AND+%22Free+Radical+Biology+and+Medicine%22%5BJournal%5D)">Redox environment of the cell as viewed through the redox state of the glutathione disulfide/glutathione couple.</a> Free Radical Biology and Medicine. 30 (11), 1191-1212 (2001).</li>
<li>Maechler, P., Wang, H., Wolheim, C. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Continuous+monitoring+of+ATP+levels+in+living+insulin+secreting+cells+expressing+cytosolic+firefly+luciferase%5BTitle%5D)+AND+%22FEBS+Lett%22%5BJournal%5D)">Continuous monitoring of ATP levels in living insulin secreting cells expressing cytosolic firefly luciferase.</a> FEBS Lett. 422, 328-332 (1998).</li>
<li>Ouhabi, R., Boue-Grabot, M., Mazat, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitochondrial+ATP+synthesis+in+permeabilized+cells%3A+Assessment+of+the+ATP%2FO+values+in+situ%5BTitle%5D)+AND+%22Anal.+Biochem%22%5BJournal%5D)">Mitochondrial ATP synthesis in permeabilized cells: Assessment of the ATP/O values in situ.</a> Anal. Biochem. 263, 169-175 (1998).</li>
<li>Strehler, B. L., Totter, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Firefly+luminescence+in+the+study+of+energy+transfer+mechanism+in+substrates+and+enzymes+determinations%5BTitle%5D)+AND+%22Arch.+Biochem.+Biophys%22%5BJournal%5D)">Firefly luminescence in the study of energy transfer mechanism in substrates and enzymes determinations.</a> Arch. Biochem. Biophys. 40, 28-41 (1952).</li>
<li>Lemasters, J. J., Backenbrock, C. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adenosine+triphosphate%3A+Continuous+measurement+in+mitochondrial+suspension+by+firefly+luciferase+luminescence%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem.+Biophys.+Res.+Commun%22%5BJournal%5D)">Adenosine triphosphate: Continuous measurement in mitochondrial suspension by firefly luciferase luminescence.</a> Biochem. Biophys. Res. Commun. 55, 1262-1270 (1973).</li>
<li>Wibom, R., Lundin, A., Hultman, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+sensitive+method+for+measuring+ATP+formation+in+rat+muscle+mitochondria%5BTitle%5D)+AND+%22Scand.+J.+Clin.+Lab.+Invest%22%5BJournal%5D)">A sensitive method for measuring ATP formation in rat muscle mitochondria.</a> Scand. J. Clin. Lab. Invest. 50, 143-152 (1990).</li>
<li>Manfredi, G., Spinazzola, A., Checcarelli, N., Naini, A. Assay of Mitochondrial ATP Synthesis in Animal Cells. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aManfredi%2C+G+%22Methods+in+Cell+Biology%2C+Mitochondria%22">Methods in Cell Biology, Mitochondria</a>. Pon, L. A., Schon, E. A. 65, Academic Press. New York. 133-145 (2001).</li>
<li>DeLuca, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Firefly+luciferase%5BTitle%5D)+AND+%22Adv.+Enzymol.+Relat.+Areas+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">Firefly luciferase.</a> Adv. Enzymol. Relat. Areas Mol. Biol. 44, 37-68 (1976).</li>
<li>Atamna, H., Frey, W. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanisms+of+mitochondrial+dysfunction+and+energy+deficiency+in+Alzheimer%27s+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Mitochondrion%22%5BJournal%5D)">Mechanisms of mitochondrial dysfunction and energy deficiency in Alzheimer's disease.</a> Mitochondrion. 7, 297-310 (2007).</li>
<li>Hanson, G. T., Aggeler, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Investigating+mitochondrial+redox+potential+with+redox-sensitive+green+fluorescent+protein+indicators%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">Investigating mitochondrial redox potential with redox-sensitive green fluorescent protein indicators.</a> J. Biol. Chem. 279 (13), 13044-13053 (2004).</li>
<li>Dooley, C. T., Dore, T. M., Hanson, G. T., Jackson, W. C., Remington, S. J., Tsien, R. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+dynamic+redox+changes+in+mammalian+cells+with+green+fluorescent+protein+indicators%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">Imaging dynamic redox changes in mammalian cells with green fluorescent protein indicators.</a> J. Biol. Chem. 279 (21), 22284-22293 (2004).</li>
<li>Schwarzländer, M., Fricker, M. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Confocal+imaging+of+glutathione+redox+potential+in+living+plant+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Microscopy%22%5BJournal%5D)">Confocal imaging of glutathione redox potential in living plant cells.</a> Journal of Microscopy. 231 (2), 299-316 (2008).</li>
<li>Nakano, M., Imamura, H., Nagai, T., Noji, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ca2%2B+regulation+of+mitochondrial+ATP+synthesis+visualized+at+the+single+cell+level%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Chem+Biol%22%5BJournal%5D)">Ca2+ regulation of mitochondrial ATP synthesis visualized at the single cell level.</a> ACS Chem Biol. 6 (7), 709-715 (2011).</li>
<li>Berg, J., Hung, Y. P., Yellen, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+genetically+encoded+fluorescent+reporter+of+ATP%3AADP+Ratio%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">A genetically encoded fluorescent reporter of ATP:ADP Ratio.</a> Nature Methods. 6 (2), 161-166 (2009).</li>
<li>Gietz, R. D., Woods, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transformation+of+yeast+by+lithium+acetate%2Fsingle-stranded+carrier+DNA%2Fpolyethylene+glycol+method%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Enzymology%22%5BJournal%5D)">Transformation of yeast by lithium acetate/single-stranded carrier DNA/polyethylene glycol method.</a> Methods in Enzymology. 350, 87-96 (2002).</li>
<li>Schneider, C. A., Rasband, W. S., Eliceiri, K. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((NIH+Image+to+ImageJ%3A+25+years+of+image+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">NIH Image to ImageJ: 25 years of image analysis.</a> Nature Methods. 9, 671-675 (2012).</li>
<li>Patterson, G. H., Lippincott-Schwartz, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+photoactivatable+GFP+for+selective+photolabeling+of+proteins+and+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Science+%28New+York%2C+N.Y.%29%22%5BJournal%5D)">A photoactivatable GFP for selective photolabeling of proteins and cells.</a> Science (New York, N.Y.). 297 (5588), 1873-1877 (2002).</li>
<li>Dairaku, N., Kato, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Oligomycin+and+antimycin+A+prevent+nitric+oxide-induced+apoptosis+by+blocking+cytochrome+c+leakage%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Lab.+Clin.+Med%22%5BJournal%5D)">Oligomycin and antimycin A prevent nitric oxide-induced apoptosis by blocking cytochrome c leakage.</a> J. Lab. Clin. Med. 143 (3), 141-153 (2004).</li>
<li>Cannon, M. B., Remington, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Re-engineering+redox-sensitive+green+fluorescent+protein+for+improved+response+rate%5BTitle%5D)+AND+%22Protein+Sci%22%5BJournal%5D)">Re-engineering redox-sensitive green fluorescent protein for improved response rate.</a> Protein Sci. , 45-57 (2006).</li>
</ol>

Não há conflitos de interesse declarados.

Aqui, descrevemos métodos para usar mito-roGFP1 e mitGO-ATeam2 como biossensores para avaliar o estado redox mitocondrial e os níveis de ATP em células de levedura viva. Nós achamos que a expressão de plasmídeo de origem mito-roGFP1 ou mitGO-ATeam resulta em quantitativo direcionamento para mitocôndria, sem qualquer efeito óbvio sobre a morfologia e distribuição mitocondrial ou nas taxas de crescimento celular. 3 Mito-roGFP1 pode detectar alterações no estado redox mitocondrial de altamente oxidado a estados ...

As mitocôndrias são organelos essenciais para a produção de ATP, a biossíntese de aminoácidos, ácidos gordos, heme, aglomerados de enxofre do ferro e pirimidinas. As mitocôndrias também desempenham um papel fundamental na homeostase do cálcio e na regulação da apoptose. Uma crescente evidência de ligações mitocôndrias ao envelhecimento e doenças relacionadas à idade, incluindo a doença de Parkinson, doença de Alzheimer, esclerose lateral amiotrófica e doença de Huntington. 2 Enquanto as pessoas vivem suas vidas inteiras com mutações em proteínas mitocondriais que estão associadas a doenças neurodegenerativas, os sintomas da doença ocorrerem apenas mais tarde na vida. Isto indica que as mudanças ocorrem nas mitocôndrias com a idade, que permitem a patologia a emergir. De fato, aptidão mitocondrial está relacionada com a saúde geral e longevidade celular em leveduras e células de mamíferos 3,4 Aqui., Descrevemos como usar geneticamente codificados, biossensores fluorescentes raciométrica para avaliar dois aspectos críticos do mitochondria em células de levedura viva: o estado redox e os níveis de ATP. Função mitocondrial na mobilização de energia aeróbica está bem estabelecida. Estado redox mitocondrial é um produto da redução e espécies oxidantes na organela, inclusive NAD + / NADH, FAD / FADH 2, NADP + / NADPH, glutationa / glutationa oxidada (GSH / GSSG) e espécies reativas de oxigênio (ROS). Desacoplamento mitocondrial ou hipóxia afeta a atividade respiratória mitocondrial e altera a relação de NAD + para NADH na organela. ROS, que são produzidos a partir de transferência de electrões entre ineficiente complexos da cadeia de transporte de electrões na membrana mitocondrial interna, bem como a partir da desaminação de aminas através da monoamina oxidase na membrana mitocondrial externa 5, lípidos, proteínas, danos e ácidos nucleicos e têm foi associada ao envelhecimento e as doenças neurodegenerativas associadas à idade 6,7,8. ROS também desempenhar um papel na transdução de sinal em mitochondria, através da oxidação de GSH. Por exemplo, NADH desidrogenase não só contribui para a produção de ROS, mas também é regulada através de interações com o pool de glutationa 9,10. desidrogenase α-cetoglutarato e aconitase, componentes do ciclo do TCA, exibem uma actividade reduzida em ambientes oxidantes 11,12. Na verdade, a regulação redox dependente da atividade aconitase é conservada de bactérias a mamíferos 13,14. Assim, o monitoramento do estado redox e os níveis de ATP das mitocôndrias é crucial para entender sua função e papel na patologia da doença. Métodos bioquímicos têm sido usados ​​para avaliar o estado redox, ou os níveis de ATP de células inteiras ou mitocôndrias isoladas. Métodos amplamente utilizadas para avaliar o estado redox de células inteiras ou mitocôndrias isoladas são baseadas na medição dos níveis do par redox de GSH / GSSG 15. O sistema luciferina-luciferase é comumente usado para medir mitocondrialEm ambos os níveis de ATP de células inteiras permeabilizadas ou mitocôndrias isoladas. 16,17,18,19,20 Neste ensaio, liga-se a luciferase de ATP e catalisa a oxidação da luciferina e de quimioluminescência. 21 A intensidade da luz emitida é proporcional à quantidade de ATP na mistura reaccional 22. Estes métodos têm revelado informação fundamental em relação a função mitocondrial, incluindo a descoberta de que os pacientes com doenças neurodegenerativas, tais como doença de Alzheimer, têm níveis anormalmente baixos de ATP 23. No entanto, eles não podem ser utilizados para a imagem de vida, as células intactas. Além disso, os métodos baseados na análise de célula completa fornecer uma média de estado redox, ou os níveis de ATP em todos os compartimentos da célula. Medidas em organelas isoladas são potencialmente problemático porque o estado redox mitocondrial ou níveis de ATP podem mudar durante o fracionamento subcelular. Finalmente, estudos recentes do nosso laboratório e outros indicam quemitocôndrias dentro das células individuais são heterogêneos em função, que por sua vez afeta a vida útil das células-mãe e filha. 3 Assim, há uma necessidade de medir os níveis de ATP mitocondrial e estado redox em células vivas com resolução subcelular. Os biossensores para a função mitocondrial descrita aqui são ambos baseados em boas práticas agrícolas. GFP Redox-sensível (roGFP) 24,25 é uma variante da GFP em que superfície expostas cisteínas são adicionados à molécula. roGFP, como a GFP do tipo selvagem, que apresenta dois picos de excitação (em ~ 400 nm e ~ 480 nm) e um pico de emissão a 510 nm ~. A oxidação dos resíduos de cisteína em roGFP resulta em um aumento na absorção a 400 nm, ~. Redução dos cisteínas favorece excitação a 480 nm, ~. Assim, a razão de emissão de 510 nm após excitação de roGFP em 480 nm e 400 nm, revela a quantidade relativa de roGFP reduzida e oxidada, o que reflecte o estado redox do meio ambiente do fluoróforo. Duas versiões de roGFP são amplamente utilizados: roGFP1 e roGFP2. Ambos contêm as mesmas inserções de cisteína. roGFP1 baseia-se na GFP do tipo selvagem e roGFP2 baseia-S65T GFP, que tem mais eficiente excitação a 480 nm e menos eficiente de excitação a 400 nm em comparação com wtGFP 24. roGFP1 é menos sensível do que o pH roGFP2 e a sua gama dinâmica estende ainda mais para o intervalo reduzido. Assim, roGFP1 pode ser mais útil para o monitoramento mais reduzindo compartimentos tais como mitocôndrias ou citosol, e compartimentos com pH variável, como endossomos. roGFP2 oferece sinal brilhante e, em alguns estudos, uma maior gama dinâmica do que roGFP1 24,26. Estudos em Arabidopsis thaliana indicam que o tempo necessário para responder a alterações no estado redox é similar para ambos os sensores (t ½ para oxidação, 65 e 95 s e t ½ para redução, 272 e 206 segundos, o que roGFP1 e roGFP2, respectivamente) 26. MitGO-ATeam2 é minimamente invasivo, confiávelsensor que mede ATP mitocondrial no brotamento levedura Saccharomyces cerevisiae. GO-ATeam é uma transferência de energia de ressonância de Förster (FRET) de sonda, que consiste na subunidade da ε o F F 1-ATP sintase ensanduichada entre dador FRET e proteínas aceitadoras fluorescentes GFP (proteína fluorescente e laranja (OFP), respectivamente), 27. A ligação de ATP para as subunidades ε resulta em mudanças de conformação na proteína que trazem o dador FRET em estreita proximidade com o receptor e para permitir a transferência de energia entre o dador eo aceitador. Existem duas variantes da GO-ATeam, GO-ATeam1 e GO-ATeam2. GO-ATeam2 tem uma maior afinidade para MgATP que GO-ATeam1, tornando-o mais adequado para medir o tipicamente inferior [ATP], em comparação com as mitocôndrias do citosol 27. Para sondar estado redox mitocondrial, construiu-se uma proteína de fusão (mito-roGFP1) consistindo de roGFP1 fundido com a sequência líder de um ATP9nd expresso a partir de um centrómero baseado (baixo número de cópias) o plasmídeo de expressão de levedura sob o controlo do forte desidrogenase de gliceraldeído-3-fosfato (GPD) promotor (p416GPD, Addgene). Usamos roGFP1 para sondar o estado redox de mitocôndrias no contexto do envelhecimento do modelo fungo Saccharomyces cerevisiae. Descobrimos que roGFP1 pode detectar alterações no estado redox mitocondrial que ocorrem durante o envelhecimento e em resposta a disponibilidade de nutrientes, mas não tem nenhum efeito prejudicial aparente em células de levedura. Vemos também a variabilidade no estado redox de mitocôndrias nas células de leveduras vivas individuais, o que reafirma a importância de um biosensor com resolução espacial subcelular. MitGO-ATeam2 é uma variante da GO-ATeam2, que tem a sequência de sinal mitocondrial do citocromo c oxidase subunidade VIII inserido no terminal amino da GO-ATeam2 27. Nós modificamos o mitGO-ATeam2 sonda (gentilmente cedido pelo laboratório de H. Noji, o Institutof Scientific e Industrial Research, Universidade de Osaka, Japão), para utilização em levedura por subclonagem-lo, através de Xba1 e locais HindIII, no vector de expressão de levedura pAG415GPD-ccdB (Addgene, Cambridge, MA, EUA), que é um plasmídeo de cópia de baixa contendo o promotor GPD constitutivo forte. Expressamos mitGO-ATeam2 em levedura de brotamento, e encontrar, pela coloração de contraste com o DNA-binding corante DAPI, que localiza exclusivamente para a mitocôndria, onde ele serve como uma sonda eficaz para medir as mudanças fisiológicas em níveis de ATP mitocondrial. roGFP e GO-ATeam ambos são geneticamente codificado. Como resultado, eles podem ser introduzidos e mantidos de forma estável em células intactas, e fornecem informações sobre o estado redox, ou os níveis de ATP, em células vivas individuais. Além disso, ambos os biossensores monitorar as alterações no estado redox ou níveis de ATP que ocorrem sob condições fisiológicas. 28 Ambas as sondas são também raciométrica. Como resultado, as medições feitas com estes testes não são afetados por changes na concentração biosensor ou iluminação da amostra ou espessura. Finalmente, ambos os biossensores fornecer resolução espacial subcelular. Com efeito, roGFP foi orientada de mitocôndrias, ER, endossomas e peroxissomas 24, e pode detectar alterações no estado redox de cada um destes organelos, em grande parte independentes do pH.

<table><tbody><tr><td>&nbsp;</td><td></td><td></td><td><forte>Reagentes</forte></td></tr><tr><td>Antimicina A</td><td>Sigma-Aldrich (St. Louis, MO)</td><td>1397-94-0</td><td>Dissolvido em etanol para uma solução-mãe de 2 mg/ml.</td></tr><tr><td>Meio de crescimento de levedura SGlyc (à base de glicerol sintético) *omitir para SGlyc-Ura **omitir para SGlyc-Leu</td><td></td><td></td><td>Dissolver em H2O. Ajustar o pH para 5,5 com NaHCO3. Autoclave. Ingredientes: 0,67% Levedura à base de nitrogênio sem aminoácidos 3% Glicerol 0,05% Glicose 2 mg/ml adenina 2 mg/ml uracila* 1 mg/ml L-arginina 1 mg/ml L-histidina 1 mg/ml L-leucina** 3 mg/ml L-lisina 2 mg/ml L-metionina 4 mg/ml L-fenilalanina 2 mg/ml L-triptofano 3 mg/ml L-tirosina</td></tr><tr><td>SC (sintético completo, à base de glicose) meio de crescimento de levedura *omitir para SGlyc-Ura **omitir para SGlyc-Leu</td><td></td><td></td><td>Dissolver em H2O. Ajustar o pH para 5,5 com NaHCO3. Autoclave. Ingredientes: 0,67% Levedura à base de nitrogênio sem aminoácidos 3% Glicose 2 mg/ml de adenina 2 mg/ml de uracila* 1 mg/ml de L-arginina 1 mg/ml de L-histidina 1 mg/ml de L-leucina** 3 mg/ml de L-lisina 2 mg/ml de L-metionina 4 mg/ml de L-fenilalanina 2 mg/ml de L-triptofano 3 mg/ml de L-tirosina</td></tr><tr><td>Valap</td><td></td><td></td><td>Combine os ingredientes na proporção de 1:1:1 (p:p:p). Derreter submergindo em um 70 &deg; C H2O banho. Alíquota em placas de Petri de vidro. Armazene em temperatura ambiente. Ingredientes: Vaselina vaselina, parafina dura, lanolina</td></tr><tr><td>&nbsp;</td><td></td><td></td><td>Equipamento e Software</td></tr><tr><td>Preclean Gold Seal Rite-on Micro Slides</td><td>Thomas Scientific (Swedesboro, NJ)</td><td>3050</td><td>Tamanho: 25 x 75 mm; Espessura: 0,93 a 1,05 mm</td></tr><tr><td>Lamínulas de alto desempenho, No. 1.5, 18x18 mm</td><td>Zeiss (Thornwood, NY)</td><td>474030-9000-000</td><td>Estas são menos variáveis em espessura (170&plusmn; 5 &mu; m) do que as lamínulas padrão, reduzindo a aberração esférica e melhorando o desempenho da imagem 3D</td></tr><tr><td>Vidro de Cobertura para Microscópio Fisherbrand, No. 1.5</td><td>Fisher Scientific (Pittsburgh, PA)</td><td>12-545E</td><td>Tamanho: 22 x 22 mm, espessura No. 1.5 (170 &mu; m)</td></tr> <tr><td>Microscópio confocal de varredura a laser A1 com detector espectral e objetiva Apo-TIRF 100x/1.49 NA</td><td>Nikon (Melville, NY)</td><td></td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Microscópio AxioObserver.Z1 equipado com objetiva 100x/1.3NA EC Plan-Neofluar (Zeiss) e câmera CCD refrigerada Orca ER (Hamamatsu) e controlado pelo software Axiovision</td><td>Zeiss (Thornwood, NY); Hamamatsu (Cidade de Hamamatsu, Japão)</td><td></td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Software de análise de imagem 3D Volocity</td><td>Perkin Elmer (Waltham, MA)</td><td></td><td>Módulo de restauração para deconvolução; Módulo de quantificação para cálculo e medição de proporções</td></tr><tr><td>Software ImageJ</td> National <td>Institutes of Health (Bethesda, MD)</td><td></td><td><a href="http://rsb.info.nih.gov/ij/" target="_blank">http://rsb.info.nih.gov/ij/</a></td></tr></tbody></table>

biossensores raciométrica que medem estado redox mitocondrial e atp em células vivas de levedura

Ratiometric Biosensors that Measure Mitochondrial Redox State and ATP in Living Yeast Cells

As mitocôndrias têm um papel em muitos processos celulares, a partir do metabolismo da energia e homeostase do cálcio para controlar o tempo de vida de celular e morte celular programada. Esses processos afetam e são afetados pelo estado redox e de produção de ATP pela mitocôndria. Aqui, descrevemos o uso de dois, biossensores geneticamente codificados raciométrica que podem detectar estado redox mitocondrial e os níveis de ATP em resolução subcelular em células de levedura viva. Estado redox mitocondrial é medida usando Proteína Fluorescente Verde redox-sensível (roGFP) que é direcionado para a matriz mitocondrial. Mito-roGFP contém cisteínas nas posições 147 e 204 da GFP, que sofrem oxidação e redução reversível e dependente do ambiente, que por sua vez altera o espectro de excitação da proteína. MitGO-ATeam é uma transferência de energia de ressonância Förster (FRET) sonda em que a subunidade ε da F o F 1 ATP sintase é imprensada entre FRET doador e receptor fluoproteínas rescent. A ligação de ATP para as subunidades ε resulta em mudanças de conformação na proteína que trazem o dador e aceitador de FRET em estreita proximidade e permitir a transferência de energia de ressonância de fluorescência do dador ao receptor.

Medindo estado redox mitocondrial com mito-roGFP Aqui, mostramos que mito-roGFP1 tem a gama dinâmica para detectar alterações no estado redox mitocondrial de totalmente oxidado a reduzida em células de levedura viva, sem afetar o crescimento de células de levedura ou morfologia mitocondrial. Primeiro, encontramos células que expressam GFP mitocôndrias-alvo e roGFP1 crescer a taxas normais (Figura 1A). A taxa de crescimento máxima, tal como medido pelo declive máximo da curva de...

Descreve-se a utilização de dois raciométrica, biossensores codificados geneticamente, que são baseados em GFP, para monitorar estado redox mitocondrial e os níveis de ATP na resolução subcelular em células vivas.

Biossensores raciométrica que medem estado redox mitocondrial e ATP em células vivas de levedura

Mitochondria have roles in many cellular processes, from energy metabolism and calcium homeostasis to control of cellular lifespan and programmed cell ...

O objetivo geral deste procedimento é medir a função mitocondrial em células vivas de levedura usando duas variantes de proteína fluorescente verde ou GFP. A GFP de detecção redox contém cistinas expostas à superfície, que sofrem oxidação e redução reversíveis e dependentes do ambiente, alterando o espectro de excitação da fileira reduzida de proteínas. A GFP tem um máximo de excitação em 470 nanômetros, enquanto a GFP oxidada tem uma deficiência aumentada de excitação em 365 nanômetros.O estado redoc é medido como emissão RO GFP a 470 nanômetros de excitação sobre a emissão RO GFP a 365 nanômetros de excitação go Uma equipe é uma sonda de traste na qual a subunidade épsilon da F zero F1 A TP sintase é imprensada entre um doador de traste GFP e uma proteína fluorescente laranja aceitadora de trastes ou a ligação OFP de um TP à subunidade epsilon resulta em alterações de confirmação na proteína que trazem o doador e o aceitador de trastes próximos, permitindo a transferência de energia do doador para o receptor. Os níveis de TP são então medidos como a emissão de OFP após excitação a 488 nanômetros sobre a emissão de GFP após excitação a 488 nanômetros. São obtidos resultados que monitoram mudanças no estado redox ou nos níveis de TP que ocorrem em condições fisiológicas.A principal vantagem desses métodos sobre os métodos existentes é que a estrada GFP e go. Uma equipe é codificada geneticamente e pode ser introduzida e mantida de forma estável em células vivas. Como resultado, eles podem ser usados para medir o estado redox mitocondrial e um TP em células vivas sem afetar a aptidão das células ou das organelas.Ambas as sondas monitoram mudanças no estado redox ou nos níveis de TP em condições fisiológicas. Como resultado, ambas as sondas também são métricas de proporção. As medições feitas com essas sondas não são afetadas por alterações na concentração do biossensor ou na iluminação ou espessura da amostra.Ambos os biossensores fornecem resolução no nível de organelas individuais. De fato, as variantes RO GFP foram direcionadas para mitocôndrias, er, endossomos e peroxissomos, onde detectaram alterações no estado redox, em grande parte independentes do pH. Esses métodos podem ajudar a responder a perguntas-chave em campos relacionados ao controle de qualidade mitocondrial e como as mitocôndrias mudam com a idade.A demonstração visual desse método é útil, pois as etapas de limite e proporção durante a análise da imagem são difíceis e precisam ser realizadas usando diretrizes definidas de forma consistente Para iniciar este procedimento. Realize a transformação da levedura com biossensores conforme descrito no protocolo de texto. Cultive células até a fase logarítmica intermediária em cinco mililitros de meios de dropout completos seletivos em um tubo inferior cônico de 15 mililitros.Use o mesmo lote de mídia para todos os experimentos. Depois de concentrar um mililitro de cultura em 20 microlitros, aplique dois microlitros das células ressuspensas em uma lâmina e cubra as células com uma lamínula. Em seguida, derreta uma pequena quantidade de VAP em uma espátula de metal e espalhe ao longo das bordas da lamínula para selar.Alternativamente, o esmalte transparente pode ser usado para imagens mito RO GFP one em um microscópio fluorescente de campo amplo. Use uma objetiva com a maior abertura numérica possível que transmita luz a 365 nanômetros, como o plano CEE de 100 x 1,3 NA. Lente objetiva Neo Fluor.Configure o microscópio para excitar em 365 e 470 nanômetros para detectar GFP oxidado e reduzido da linha de esquadria, respectivamente. Use LEDs para alterar o comprimento de onda de excitação e um cubo de filtro de emissão adequado para GFP. Com o filtro de excitação removido, defina a câmera para um por um para obter uma resolução espacial ideal.Em seguida, configure o software para adquirir um Zack composto por 11 fatias com espaçamento de 0,5 micrômetro, coletando ambos os canais em cada posição Z. Localize o plano focal das células usando luz transmitida para minimizar o branqueamento da sonda fluorescente. Em seguida, colete uma série Z em toda a profundidade de uma célula típica usando um tamanho de passo de 0,5 micrômetros para configurar a imagem.Pode ir uma equipe dois em um microscópio confocal espectral. Use a lente de abertura numérica mais alta disponível aqui. Uma lente de relva APO de 100 x 1,49 é usada.Configure o microscópio para excitar migo uma equipe dois a 488 nanômetros e coletar emissão de 500 a 520 nanômetros para um TP ligado e de 550 a 580 nanômetros. Para formulários TP não vinculados. Os valores ideais reais podem variar de acordo com as características do sistema de imagem.Defina o orifício para 1,0 unidades de área e, em seguida, defina. Digitalize o zoom para se aproximar do limite de amostragem de nyquist. Para aumentar a velocidade da imagem, corte o campo para 512 por 256 pixels.Use a média de varredura, se necessário, para reduzir o ruído. Use o mínimo de potência do laser possível enquanto ainda produz uma imagem interpretável. Use um medidor de potência interno ou externo para monitorar as mudanças na potência do laser que ocorrem normalmente ao longo do tempo em qualquer sistema óptico.Ajuste o ganho do detector e a intensidade da iluminação para maximizar a faixa dinâmica. Mas evite a saturação. Não analise nenhuma célula que contenha mais de 1% de pixels saturados.Localize o plano focal das células usando luz transmitida antes de coletar uma série Z através da profundidade de retenção de uma célula típica usando um tamanho de passo de 0,5 micrômetros, visualize todas as amostras usando a mesma varredura de potência do laser objetiva, zoom, tamanho do pixel, ganho e deslocamento. Abra as imagens adquiridas e altere o tipo para 32 bits para determinar o plano de fundo. Desenhe uma região de interesse ou ROI em uma área onde não há células.Escolha, analise, meça para adicionar a intensidade média neste ROI à janela de resultados. Para subtrair esse valor da pilha, escolha matemática do processo e subtraia. Em seguida, insira a intensidade média de fundo e escolha visualizar.Ok e sim, o limiar é o aspecto mais difícil do procedimento. Para garantir o sucesso, defina parâmetros de limite de modo que a imagem resultante mantenha o tamanho real do objeto fluorescente na imagem original. Usar exatamente as mesmas condições de exposição para cada experimento ajudará a produzir limites consistentes em todo o processamento da imagem.Um limite muito baixo incluirá pixels de plano de fundo. Um limite muito alto eliminará partes das mitocôndrias da análise usando o Zack subtraído, encontrará a fatia do meio e selecionará o ajuste e o limite da imagem e, em seguida, limitará as mitocôndrias após encontrar um valor de limite apropriado. Clique em aplicar para aplicar esse limite a todas as fatias da pilha.Em seguida, marque definir pixels de fundo para NAN ou não um número e clique em ok e sim, repita esse processo para a outra imagem. Crie a pilha Z de proporção clicando em processo e, em seguida, em calculadora de imagens. Divida a pilha reduzida pela pilha C oxidada para análise MIT O-R-G-F-P um.O mesmo protocolo é usado para análise migo AAM dois. Nesse caso, divida a imagem de 560 nanômetros vinculada A TP pela imagem de 510 nanômetros não vinculada A TP. Desenhe um ROI em torno da área de interesse.Escolha ferramentas de análise. Gerenciador de ROI e clique em adicionar para registrar o ROI, em seguida, escolha mais medidas múltiplas e ok. Por fim, copie a área e a média do número da fatia e exporte os dados para uma planilha para análise, use a planilha para calcular a área vezes a média da soma ponderada e a média ponderada das células que expressam a GFP direcionada às mitocôndrias e a GFP da linha crescem a taxas normais.A taxa máxima de crescimento é semelhante em células que expressam mito GFP e MIT row GFP one. Além disso, as mitocôndrias e leveduras que expressam MIT RO GF P um são tubulares alinhadas ao longo do eixo do botão mãe e se acumulam nas pontas das células-mãe e filhas. Essa morfologia normal indica que o MIT RO GF P um não perturba a função mitocondrial.Para avaliar a faixa dinâmica de células de levedura do tipo selvagem de fase midlock mitg FP one foram tratadas com peróxido de hidrogênio e dihi três etol e a razão média mitocondrial reduzida para oxidada foi medida para avaliar a titulação do estado redox mitocondrial com peróxido de hidrogênio ou DTT de zero a 10 milimolares resulta em uma mudança dependente da dose. Na proporção média mitocondrial reduzida para oxidada com uma faixa medida de 0,6 em condições oxidantes a 1,23 em condições redutoras. Assim, o mitg FP one é um biossensor eficaz para análise da redata mitocondrial em células vivas.Mito RO GFP one também oferece resolução subcelular do estado redox mitocondrial. Esta resolução subcelular revela que as mitocôndrias dentro de células de levedura individuais diferem em estado redox relativo a luz pode induzir mudanças no GFP Chromo quatro após exposição a alta intensidade 400 nanômetros linha de luz GFP um sofre fotoconversão para uma espécie com um espectro de emissão diferente usando excitação de baixa intensidade. Não há conversão significativa de fotos durante o período analisado.A maneira preferida de reduzir a fotoconversão é excitar a forma oxidada de linha GFP a 365 nanômetros MIGO AAM dois colocaliza com DNA mitocondrial corado com DAPI em levedura e é encontrado em estruturas tubulares típicas de mitocôndrias de leveduras do tipo selvagem. Além disso, a taxa de crescimento das células que expressam MIGO AAM two é semelhante à das células que expressam GFP direcionada às mitocôndrias em meios de glicose e glicerol. Assim, a expressão de migo A dois não parece deletéria para a célula ou mitocôndria para testar se migo A dois responde a mudanças nos níveis mitocondriais de A TP, as células foram tratadas com antimicina A, um agente que inibe a produção mitocondrial de A TP.A razão de trastes mediana diminui nas células tratadas com antimicina. Curiosamente, os dados preliminares indicam que pode haver diferenças nos níveis de TP em diferentes mitocôndrias dentro da mesma célula. Uma vez dominada, essa técnica pode ser executada em várias horas.Além disso, ao tentar este procedimento, é importante manter os parâmetros de imagem constantes enquanto monitora as células quanto à fragmentação mitocondrial e outros sinais de fototoxicidade. Evite o fotobranqueamento e desenvolva critérios consistentes para o limiar. Esses biossensores podem ser usados para monitorar alterações mitocondriais em fungos de plantas vivas e células de mamíferos.Eles também podem ser usados para monitorar alterações mitocondriais na neurodegeneração, doenças metabólicas e outras doenças associadas a defeitos nas funções mitocondriais. Depois de assistir a este vídeo, você poderá usar corantes fluorescentes métricos de proporção direcionada às mitocôndrias para monitorar o estado redox mitocondrial e um TP em células vivas.

ratiometric-biosensors-that-measure-mitochondrial-redox-state-atp

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Bioengenharia

PH vacuolar e citosólica pode ser medido em leveduras vivas...

Medição do valor pH vacuolar e Cytosolic<em&gt; In Vivo</em&gt; Em Suspensions célula de levedura

O peróxido de hidrogênio (H2 O2) é uma fonte de dano oxidativo e uma molécula sinalizadora. Este protocolo descreve como medir mitocondrial H 2 O2usando HyPer7 mitocondrial (mtHyPer7), um biossensor ratiométrico codificado geneticamente, em leveduras vivas. Ele detalha como otimizar as condições de imagem e realizar análises quantitativas celulares e subcelulares usando software disponível gratuitamente.

Imagem de mtHyPer7, um biossensor ratiométrico para peróxido mitocondrial, em células vivas de levedura

A respiração mitocondrial em células inteiras de levedura é um indicador valioso da bioenergética celular. Aqui, apresentamos um protocolo para quantificar esse fenótipo aplicável a diferentes espécies de leveduras.

Quantificação da respiração mitocondrial em células inteiras de levedura

"E-DNA" sensores, reagentless, biossensores eletroquímicos que um bom desempenho, mesmo quando desafiados diretamente no sangue e outras matrizes complexas, foram adaptados para a detecção de uma ampla gama de ácido nucléico, proteínas e moléculas pequenas analitos. Aqui apresentamos um procedimento geral para a fabricação e uso de tais sensores.

Fabricação de Eletroquímica-DNA Biossensores para Detecção Reagentless de ácidos nucléicos, proteínas e pequenas moléculas

Imagens Lifetime fluorescência (FLIM) emergiu como uma técnica de imagem chave para o meio ambiente e interacção de proteínas específicas e corantes em células vivas. FLIM de rotores moleculares fluorescentes permite o mapeamento de viscosidade em células vivas.

Imagem Lifetime fluorescência de rotores moleculares em células vivas

Um método para espácio-temporal controlo da actividade GTPase pequena pela luz é descrito. Este método baseia-se em rapamicina induzida heterodimerização FKBP-FRB e foto-enjaulamento sistemas. Otimização de luz irradiação permite a ativação espaço-temporalmente controlada de pequenas GTPases no nível subcelular.

Espaço-Temporal Manipulação de Atividade GTPase Pequeno em nível subcelular e em escala de tempo de segundos em células vivas

Este artigo detalha a construção de um sensor de microagulhas multiplexados baseado. O dispositivo está a ser desenvolvido para a amostragem in situ ea análise electroquímica de analitos múltiplos de uma maneira rápida e selectiva. Nós encaramos a medicina clínica e pesquisa biomédica usa para esses sensores baseados microagulhas.

Sensor de microagulhas baseado oco para Multiplexed Transdermal Eletroquímica Sensing

Um método para estimulação da atividade elétrica de culturas de células in vitro com luz visível é descrito.

Controle óptico de células vivas atividade elétrica por conjugados Polymers

Vários biossensores de força baseados em FRET foram desenvolvidos recentemente, permitindo a resolução específica da proteína da força intracelular. Neste protocolo, demonstramos como um desses sensores, projetado para o ligante da proteína do complexo nucleoesqueleto-citoesqueleto (LINC) Nesprin-2G, pode ser usado para medir as forças de actomiosina no complexo nuclear LINC.

Um protocolo para usar a transferência de Förster Ressonância Energia (FRET) Biossensores -force medir forças mecânicas em todo o Complexo LINC Nuclear

Este artigo apresenta uma série de protocolos para o desenvolvimento de células manipuladas e superfícies funcionalizadas que permitem sinteticamente engenharia E. coli para controlar e manipular superfícies de materiais programáveis.

Usando biologia sintética para manipular células vivas que fazem interface com materiais programáveis

Aprenda a medir o estado redox mitocondrial e níveis de ATP em células vivas de levedura usando biossensores raciométricos baseados em GFP. Este método oferece resolução subcelular para análise funcional.

Biossensores raciométrica que medem estado redox mitocondrial e ATP em células vivas de levedura

Explorar mais vídeos