Biossensores raciométrica que medem estado redox mitocondrial e ATP em células vivas de levedura

O objetivo geral deste procedimento é medir a função mitocondrial em células vivas de levedura usando duas variantes de proteína fluorescente verde ou GFP. A GFP de detecção redox contém cistinas expostas à superfície, que sofrem oxidação e redução reversíveis e dependentes do ambiente, alterando o espectro de excitação da fileira reduzida de proteínas. A GFP tem um máximo de excitação em 470 nanômetros, enquanto a GFP oxidada tem uma deficiência aumentada de excitação em 365 nanômetros.

O estado redoc é medido como emissão RO GFP a 470 nanômetros de excitação sobre a emissão RO GFP a 365 nanômetros de excitação go Uma equipe é uma sonda de traste na qual a subunidade épsilon da F zero F1 A TP sintase é imprensada entre um doador de traste GFP e uma proteína fluorescente laranja aceitadora de trastes ou a ligação OFP de um TP à subunidade epsilon resulta em alterações de confirmação na proteína que trazem o doador e o aceitador de trastes próximos, permitindo a transferência de energia do doador para o receptor. Os níveis de TP são então medidos como a emissão de OFP após excitação a 488 nanômetros sobre a emissão de GFP após excitação a 488 nanômetros. São obtidos resultados que monitoram mudanças no estado redox ou nos níveis de TP que ocorrem em condições fisiológicas.

A principal vantagem desses métodos sobre os métodos existentes é que a estrada GFP e go. Uma equipe é codificada geneticamente e pode ser introduzida e mantida de forma estável em células vivas. Como resultado, eles podem ser usados para medir o estado redox mitocondrial e um TP em células vivas sem afetar a aptidão das células ou das organelas.

Ambas as sondas monitoram mudanças no estado redox ou nos níveis de TP em condições fisiológicas. Como resultado, ambas as sondas também são métricas de proporção. As medições feitas com essas sondas não são afetadas por alterações na concentração do biossensor ou na iluminação ou espessura da amostra.

Ambos os biossensores fornecem resolução no nível de organelas individuais. De fato, as variantes RO GFP foram direcionadas para mitocôndrias, er, endossomos e peroxissomos, onde detectaram alterações no estado redox, em grande parte independentes do pH. Esses métodos podem ajudar a responder a perguntas-chave em campos relacionados ao controle de qualidade mitocondrial e como as mitocôndrias mudam com a idade.

A demonstração visual desse método é útil, pois as etapas de limite e proporção durante a análise da imagem são difíceis e precisam ser realizadas usando diretrizes definidas de forma consistente Para iniciar este procedimento. Realize a transformação da levedura com biossensores conforme descrito no protocolo de texto. Cultive células até a fase logarítmica intermediária em cinco mililitros de meios de dropout completos seletivos em um tubo inferior cônico de 15 mililitros.

Use o mesmo lote de mídia para todos os experimentos. Depois de concentrar um mililitro de cultura em 20 microlitros, aplique dois microlitros das células ressuspensas em uma lâmina e cubra as células com uma lamínula. Em seguida, derreta uma pequena quantidade de VAP em uma espátula de metal e espalhe ao longo das bordas da lamínula para selar.

Alternativamente, o esmalte transparente pode ser usado para imagens mito RO GFP one em um microscópio fluorescente de campo amplo. Use uma objetiva com a maior abertura numérica possível que transmita luz a 365 nanômetros, como o plano CEE de 100 x 1,3 NA. Lente objetiva Neo Fluor.

Configure o microscópio para excitar em 365 e 470 nanômetros para detectar GFP oxidado e reduzido da linha de esquadria, respectivamente. Use LEDs para alterar o comprimento de onda de excitação e um cubo de filtro de emissão adequado para GFP. Com o filtro de excitação removido, defina a câmera para um por um para obter uma resolução espacial ideal.

Em seguida, configure o software para adquirir um Zack composto por 11 fatias com espaçamento de 0,5 micrômetro, coletando ambos os canais em cada posição Z. Localize o plano focal das células usando luz transmitida para minimizar o branqueamento da sonda fluorescente. Em seguida, colete uma série Z em toda a profundidade de uma célula típica usando um tamanho de passo de 0,5 micrômetros para configurar a imagem.

Pode ir uma equipe dois em um microscópio confocal espectral. Use a lente de abertura numérica mais alta disponível aqui. Uma lente de relva APO de 100 x 1,49 é usada.

Configure o microscópio para excitar migo uma equipe dois a 488 nanômetros e coletar emissão de 500 a 520 nanômetros para um TP ligado e de 550 a 580 nanômetros. Para formulários TP não vinculados. Os valores ideais reais podem variar de acordo com as características do sistema de imagem.

Defina o orifício para 1,0 unidades de área e, em seguida, defina. Digitalize o zoom para se aproximar do limite de amostragem de nyquist. Para aumentar a velocidade da imagem, corte o campo para 512 por 256 pixels.

Use a média de varredura, se necessário, para reduzir o ruído. Use o mínimo de potência do laser possível enquanto ainda produz uma imagem interpretável. Use um medidor de potência interno ou externo para monitorar as mudanças na potência do laser que ocorrem normalmente ao longo do tempo em qualquer sistema óptico.

Ajuste o ganho do detector e a intensidade da iluminação para maximizar a faixa dinâmica. Mas evite a saturação. Não analise nenhuma célula que contenha mais de 1% de pixels saturados.

Localize o plano focal das células usando luz transmitida antes de coletar uma série Z através da profundidade de retenção de uma célula típica usando um tamanho de passo de 0,5 micrômetros, visualize todas as amostras usando a mesma varredura de potência do laser objetiva, zoom, tamanho do pixel, ganho e deslocamento. Abra as imagens adquiridas e altere o tipo para 32 bits para determinar o plano de fundo. Desenhe uma região de interesse ou ROI em uma área onde não há células.

Escolha, analise, meça para adicionar a intensidade média neste ROI à janela de resultados. Para subtrair esse valor da pilha, escolha matemática do processo e subtraia. Em seguida, insira a intensidade média de fundo e escolha visualizar.

Ok e sim, o limiar é o aspecto mais difícil do procedimento. Para garantir o sucesso, defina parâmetros de limite de modo que a imagem resultante mantenha o tamanho real do objeto fluorescente na imagem original. Usar exatamente as mesmas condições de exposição para cada experimento ajudará a produzir limites consistentes em todo o processamento da imagem.

Um limite muito baixo incluirá pixels de plano de fundo. Um limite muito alto eliminará partes das mitocôndrias da análise usando o Zack subtraído, encontrará a fatia do meio e selecionará o ajuste e o limite da imagem e, em seguida, limitará as mitocôndrias após encontrar um valor de limite apropriado. Clique em aplicar para aplicar esse limite a todas as fatias da pilha.

Em seguida, marque definir pixels de fundo para NAN ou não um número e clique em ok e sim, repita esse processo para a outra imagem. Crie a pilha Z de proporção clicando em processo e, em seguida, em calculadora de imagens. Divida a pilha reduzida pela pilha C oxidada para análise MIT O-R-G-F-P um.

O mesmo protocolo é usado para análise migo AAM dois. Nesse caso, divida a imagem de 560 nanômetros vinculada A TP pela imagem de 510 nanômetros não vinculada A TP. Desenhe um ROI em torno da área de interesse.

Escolha ferramentas de análise. Gerenciador de ROI e clique em adicionar para registrar o ROI, em seguida, escolha mais medidas múltiplas e ok. Por fim, copie a área e a média do número da fatia e exporte os dados para uma planilha para análise, use a planilha para calcular a área vezes a média da soma ponderada e a média ponderada das células que expressam a GFP direcionada às mitocôndrias e a GFP da linha crescem a taxas normais.

A taxa máxima de crescimento é semelhante em células que expressam mito GFP e MIT row GFP one. Além disso, as mitocôndrias e leveduras que expressam MIT RO GF P um são tubulares alinhadas ao longo do eixo do botão mãe e se acumulam nas pontas das células-mãe e filhas. Essa morfologia normal indica que o MIT RO GF P um não perturba a função mitocondrial.

Para avaliar a faixa dinâmica de células de levedura do tipo selvagem de fase midlock mitg FP one foram tratadas com peróxido de hidrogênio e dihi três etol e a razão média mitocondrial reduzida para oxidada foi medida para avaliar a titulação do estado redox mitocondrial com peróxido de hidrogênio ou DTT de zero a 10 milimolares resulta em uma mudança dependente da dose. Na proporção média mitocondrial reduzida para oxidada com uma faixa medida de 0,6 em condições oxidantes a 1,23 em condições redutoras. Assim, o mitg FP one é um biossensor eficaz para análise da redata mitocondrial em células vivas.

Mito RO GFP one também oferece resolução subcelular do estado redox mitocondrial. Esta resolução subcelular revela que as mitocôndrias dentro de células de levedura individuais diferem em estado redox relativo a luz pode induzir mudanças no GFP Chromo quatro após exposição a alta intensidade 400 nanômetros linha de luz GFP um sofre fotoconversão para uma espécie com um espectro de emissão diferente usando excitação de baixa intensidade. Não há conversão significativa de fotos durante o período analisado.

A maneira preferida de reduzir a fotoconversão é excitar a forma oxidada de linha GFP a 365 nanômetros MIGO AAM dois colocaliza com DNA mitocondrial corado com DAPI em levedura e é encontrado em estruturas tubulares típicas de mitocôndrias de leveduras do tipo selvagem. Além disso, a taxa de crescimento das células que expressam MIGO AAM two é semelhante à das células que expressam GFP direcionada às mitocôndrias em meios de glicose e glicerol. Assim, a expressão de migo A dois não parece deletéria para a célula ou mitocôndria para testar se migo A dois responde a mudanças nos níveis mitocondriais de A TP, as células foram tratadas com antimicina A, um agente que inibe a produção mitocondrial de A TP

A razão de trastes mediana diminui nas células tratadas com antimicina. Curiosamente, os dados preliminares indicam que pode haver diferenças nos níveis de TP em diferentes mitocôndrias dentro da mesma célula. Uma vez dominada, essa técnica pode ser executada em várias horas.

Além disso, ao tentar este procedimento, é importante manter os parâmetros de imagem constantes enquanto monitora as células quanto à fragmentação mitocondrial e outros sinais de fototoxicidade. Evite o fotobranqueamento e desenvolva critérios consistentes para o limiar. Esses biossensores podem ser usados para monitorar alterações mitocondriais em fungos de plantas vivas e células de mamíferos.

Eles também podem ser usados para monitorar alterações mitocondriais na neurodegeneração, doenças metabólicas e outras doenças associadas a defeitos nas funções mitocondriais. Depois de assistir a este vídeo, você poderá usar corantes fluorescentes métricos de proporção direcionada às mitocôndrias para monitorar o estado redox mitocondrial e um TP em células vivas.