Isolamento livre-Label e enriquecimento de células através de contato dieletroforese

Dieletroforese Contactless (CDEP) alcança a classificação e enriquecimento de partículas através de suas propriedades dielétricas intrínsecas. Canais de eletrodos fluídicos substituir os eletrodos metálicos tradicionais para DEP, adequando CDEP para não danificar caracterização estéril e classificação de partículas biológicas. Demonstramos como preparar um microdispositivo CDEP e realizar a caracterização das células e experimentos de classificação.

O objetivo geral deste procedimento é induzir o movimento translacional de células suspensas em um fluxo acionado por pressão usando eletroforese de corante sem entrar em contato com os eletrodos na amostra. Isso é feito suspendendo primeiro as células de interesse em um tampão de baixa condutividade. O segundo passo é carregar o dispositivo microfluídico com a suspensão celular e introduzir fluido altamente condutor nos canais do eletrodo.

Em seguida, o dispositivo preparado é conectado a eletrônicos de alta tensão e a resposta de frequência do movimento celular é registrada por vídeo alimentado por uma câmera acoplada a um microscópio invertido. A etapa final é analisar as imagens de vídeo para prever quantitativamente as propriedades elétricas das células. Em última análise, a eletroforese sem contato é usada para mostrar que células com diferentes propriedades elétricas podem ser classificadas de maneira não prejudicial sem rótulos, usando dispositivos microfluídicos baratos e simples de fabricar.

Portanto, esse método é útil para aplicações como separar células vivas de mortas, isolar tumores, iniciar células, separar células cancerígenas com base no estágio e observar os efeitos das drogas em diferentes células em suas propriedades dielétricas. As principais vantagens desta técnica em relação aos métodos existentes, como a classificação de células ativadas por fluorescência, é que as células podem ser classificadas e caracterizadas com base em suas propriedades biofísicas intrínsecas sem a necessidade de marcação com base em biomarcadores e também que a esterilidade da amostra pode ser mantida eliminando o contato entre os eletrodos e a amostra. Bem, tivemos essa ideia pela primeira vez quando queríamos desenvolver uma técnica que evitasse vários problemas, como contaminação de amostras, eletrólise, fabricação cara e isso está associado a dispositivos eletroforéticos di tradicionais.

Para isolar células de mamíferos. Siga os procedimentos relatados anteriormente usando fotorresistência e corrosão iônica reativa profunda para gravar o design de canal desejado em um wafer de silício, depositando uma fina camada de Teflon para melhorar a liberação do microdispositivo do wafer. Enrole o wafer com papel alumínio para evitar transbordamento.

Misture polimetilalano ou PDMS em uma proporção de 10 para um de elastômero para agente de cura DGAs por aproximadamente 20 minutos e despeje sobre o wafer. Em seguida, aqueça o wafer por 45 minutos a 100 graus Celsius para evitar danificar o revestimento de Teflon do carimbo após o resfriamento. Remova a folha de alumínio.

Apare o PDMS usando uma lâmina cirúrgica e faça furos de acesso na saída de entrada do canal. Usando um perfurador rombo adequado ao tamanho da tubulação aqui, um perfurador rombo de 1,5 milímetro é usado. Em seguida, limpe uma lâmina de microscópio de vidro conforme indicado no protocolo de texto.

Limpe o dispositivo PDMS usando fita adesiva Scotch Magic. Examine ao microscópio para ter certeza de que os canais estão limpos. Em seguida, exponha a lâmina e o dispositivo PDMS ao plasma de ar por dois minutos, pressione firmemente o lado do canal do dispositivo na lâmina de vidro, evitando a formação de bolhas de ar entre o dispositivo e a lâmina.

Prepare um buffer de baixa condutividade conforme descrito no protocolo de texto, que será chamado de buffer DEP. Suspenda as células em tampão DEP a 3 milhões de células por mililitro aqui, células cancerígenas, epiteliais de superfície ovariana, ovarianas, ou L de musgo são usadas após tingir as células usando uma membrana fluorescente. O corante permeável mede a condutividade da suspensão de células dy.

A condutividade deve ser de aproximadamente 100 microsiemens por centímetro. Se a medição de condutividade for muito alta, gire a amostra para baixo. Resus suspenda no buffer de profundidade e repita a medição de condutividade.

O aspecto mais difícil deste protocolo é evitar bolhas nos canais do eletrodo e as bolhas do canal de amostra nos canais do eletrodo podem impedir as conexões do orifício elétrico e as bolhas no canal de amostra podem impedir o fluxo constante. Certifique-se de executar as etapas demonstradas para evitar bolhas e garantir um fluxo constante Antes de carregar o chip microfluídico por imersão C. Coloque-o sob vácuo por 30 minutos.

Enquanto isso, corte um pedaço de tubo flexível para abranger a distância da bomba de seringa até o estágio do microscópio onde o chip microfluídico estará localizado aqui. É necessário um comprimento de tubulação de seis polegadas. Encaixe o tubo na ponta da agulha na seringa.

Em seguida, estime o comprimento necessário para a tubulação de saída dividindo o volume da amostra coletada pela área da seção transversal do tubo. Corte o comprimento necessário da tubulação. Em seguida, puxe a suspensão celular para uma seringa.

Verifique se não há bolhas localizadas no tubo ou na seringa. Ao remover o chip do vácuo, insira a tubulação de saída e prepare o sample canal rapidamente. Para evitar bolhas de ar presas nos canais, bata suavemente na seringa ao preparar.

Para evitar o rompimento da fina barreira isolante para preparar os canais do eletrodo, coloque rapidamente as pontas da pipeta vazias em uma saída de cada canal de eletrodo fluídico, pipeta 200 microlitros de PBS contendo uma pequena quantidade de bromo B. E bata suavemente para introduzir o fluido na extremidade oposta do canal do eletrodo. Mantenha uma pressão suave até que o PBS com bromo B progrida visivelmente pela ponta da ponta da pipeta vazia, repita para cada eletrodo. O canal R domina B é usado apenas para fluorescente.

Visualize os canais de eletrodos fluídicos após a preparação. Encha cada reservatório da ponteira da pipeta com PBS, com R domine B.Evite a formação de bolhas nos reservatórios da ponteira da pipeta e remova qualquer bolha visível pipetando suavemente para cima e para baixo. Retire a tubulação de saída e descarte adequadamente.

Em seguida, insira um novo reservatório de tubulação de saída. Colete o volume de destino. Posicione o chip no palco de um microscópio invertido equipado com a câmera digital.

Monte a seringa na bomba da seringa e insira os eletrodos de fio nos reservatórios do canal do eletrodo fluídico, bombeie o fluido a um mililitro por hora para garantir um bom contato entre a bomba da seringa e a seringa. Inspecione visualmente o comprimento do canal para garantir o fluxo desimpedido de células e a ausência de bolhas ou vazamentos. Em seguida, reduza a vazão para cinco microlitros por hora.

Por segurança. Teste os componentes eletrônicos ligando o gerador de funções, o amplificador de alta tensão e o osciloscópio e ajustando para o volume desejadotage e frequência. Aqui, esses parâmetros são 200 volts e 20 kilohertz.

Após a verificação do desempenho aceitável, desligue a energia. Em seguida, conecte os eletrodos ao alto voltage amplificador. Ao atingir o fluxo constante, aplique a tensão desejada na frequência desejada Neste experimento, a tensão é de 200 volts RMS em frequências entre cinco e 60 kilohertz.

Grave os arquivos de vídeo da resposta celular com técnicas de processamento de imagem para quantificar a distribuição celular no canal e caracterizar a frequência de cruzamento. Para fazer isso, mantenha uma tensão constante e varie a frequência sistematicamente no início e no final do experimento, bem como aleatoriamente entre as execuções experimentais. Registre a distribuição da célula de controle, que é a distribuição das células sem aplicar nenhum campo elétrico.

Depois de definir uma nova espera de frequência, a quantidade de tempo necessária para que as células fluam da entrada para o local monitorado e, em seguida, comecem a gravar, prossiga para realizar o processamento da imagem para caracterizar a frequência de cruzamento conforme descrito no protocolo de texto, suspenda a mistura desejada no tampão DEP a uma concentração total de 3 milhões de partículas por mililitro. Aqui, esta mistura é de células L de musgo com quatro micrômetros de esferas fluorescentes em tampão DEP executam as etapas descritas anteriormente. Para preparar um dispositivo CEP, opere o experimento em uma frequência entre as duas frequências de cruzamento determinadas das células-alvo e as partículas de fundo, de modo que as duas populações de partículas experimentem forças DEP em direções opostas.

Para coletar o conteúdo de amostras variadas, remova o tubo de saída após a coleta do volume alvo, colocando um dedo de luva sobre a abertura de saída e puxando suavemente o tubo. Despeje o volume alvo coletado em um reservatório para análise posterior. Para células cancerígenas de mamíferos, como a maioria das células L usadas aqui, DEP negativo foi observado em cinco kilohertz e DEP positivo forte.

A 60 kilohertz, as células MOS L têm um diâmetro de 17,7 mais ou menos 3,3 micrômetros, e as contas têm um diâmetro nominal de quatro micrômetros. Além de determinar a frequência de cruzamento das células, essa técnica pode ser usada para classificar uma mistura ilustrada aqui por uma mistura de células L e grânulos do MO. Este exemplo aproveita a dieletroforese negativa exibida por quatro micrômetros em frequências onde as células L do MO experimentam dieletroforese positiva.

Quando o dispositivo foi operado a 200 volts RMS e 10 kilohertz, ambas as células mostradas aqui em verde e as contas mostradas aqui em vermelho foram misturadas, pois experimentaram DEP negativo a 50 kilohertz. O movimento das células MOS L para o topo do canal foi observado enquanto os grânulos estavam restritos à porção inferior do canal, permitindo a separação da mistura em dois componentes. Portanto, seguindo esse procedimento, outras técnicas podem ser conduzidas a jusante, como cultura de células e imagens de imunofluorescência ou ensaios bioquímicos para responder a perguntas adicionais, como como as propriedades dielétricas se correlacionam com as características físicas das células.

Então, após seu desenvolvimento, essa técnica realmente abriu caminho para os biólogos estudarem como as mudanças induzidas por metabólitos no citoesqueleto da célula podem ser correlacionadas às suas propriedades dielétricas usando um modelo de câncer de ovário de camundongo. Depois de assistir a este vídeo, você deve ter uma boa compreensão de como enriquecer e classificar células usando eletroforese sem contato.