Name: Isolamento livre-Label e enriquecimento de células através de contato dieletroforese (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-09-03T14:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 38 s
Description: Aprenda a isolar e enriquecer células sem marcação usando dieletroforese sem contato. Este método baseado em microfluídica permite caracterizar e separar células vivas de forma não danosa, mantendo a esterilidade da amostra.

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Este trabalho foi apoiado apoiado em parte pela National Science Foundation, Grant No. EFRI 0938047, e pelo Instituto de Tecnologia de Virgínia para a crítica de Tecnologia e Ciências Aplicadas (ICTAS). Os autores gostariam de expressar meu agradecimento ao Dr. Eva Schmelz e Dr. Paul Roberts para seu presente tipo de células MOSE-L. Os autores reconhecem Angela Anderson por sua assistência com cultura de células, Caitlan Swaffar por sua ajuda com a edição deste documento e preparar os experimentos, e todos os membros do laboratório Bioelectromechanical Systems.

1. Confecção de um protótipo CDEP Microfluidic: Visão Geral <ol><li> Siga os procedimentos anteriormente relatados 22 usando photoresist e Deep Reactive Ion Etching (DRIE) para gravar o projeto do canal desejado (Figura 1) em uma pastilha de silício (Figura 2). Depositar uma fina camada de Teflon para melhorar a libertação do microdispositivo da bolacha. </li></ol><img alt="Figura 1" src="/files/ftp_upload/50634/50634fig1.jpg" /> Figura 1. Esquema de um dispositivo de classificação contínua de baixa freqüência. As canal exemplo é executado esquerda para a direita e é 500 mm de largura, com constrições dente de serra de 100 mm. Os dois pares de canais de eléctrodos fluídicos compor os eléctrodos de fonte e dreno respectivamente, e estão separadas do canal de amostra por uma barreira de PDMS de espessura de 20 um. <img alt="Figura 2" src="/files/ftp_upload/50634/50634fig2.jpg" /> Figura 2. O fabrprocesso icação de um dispositivo CDEP. (a) durante 60 segundos, a luz UV reage selectivamente com fotorresistente exposto por meio de um padrão de máscara da geometria do dispositivo CDEP. (b) Photoresist é removido utilizando revelador. (c) funda Reactive Ion Entalhe (DRIE) é usado para gravar 50 mM características profundas, e 5 min de decapagem húmida por hidróxido de tetrametilamónio (TMAH) 25% a 70 ° C é usada para reduzir a rugosidade das paredes laterais. (d) um revestimento de Teflon é adicionado para melhorar a libertação do dispositivo a bolacha. (e) PDMS é vertida sobre a bolacha de selo pode ser reutilizado após a desgaseificação e curado durante 45 minutos a 100 ° C. (f) PDMS é removido da bolacha. PDMS e uma lâmina de vidro limpa são expostas ao plasma de ar durante 2 minutos e ligados entre si. <ol start="2"><li> Enrole o wafer com folha de alumínio para evitar spill-over. Misture polidimetilsiloxano (PDMS), em 10:1 de elastômero para agente de cura, de-gás por cerca de 20 min, E despeje sobre o wafer. Aquecer durante 45 minutos a 100 ° C para evitar danificar o revestimento de Teflon do selo. Deixe o aparelho arrefecer. </li><li> Após o resfriamento, retire a folha de alumínio, a guarnição PDMS usando uma lâmina cirúrgica, e furos de acesso na entrada do canal / saída usando um perfurador sem corte adequado para o tamanho da tubulação. Aqui, um 1,5 milímetros perfurador sem corte é usado. </li><li> Limpe a lâmina de vidro usando uma lavagem com água e sabão, álcool etílico, água DI e secagem com ar, respectivamente. Limpe o dispositivo PDMS usando fita Scotch Magia. Examinar ao microscópio para ter certeza de canais estão limpos. Expor a lâmina e dispositivo de PDMS para plasma de ar por 2 min. Pressionar firmemente o lado do canal do dispositivo de lâmina de vidro, evitando a formação de bolhas de ar entre o dispositivo e a corrediça (fig. 3). </li></ol><img alt="Figura 3" src="/files/ftp_upload/50634/50634fig3.jpg" fo:content-width="6in" fo:src="/files/ftp_upload/50634/50634fig3highres.jpg"/> Figura 3. </stRong&gt; (a) A máscara usada para a fotolitografia durante o fabrico do selo da bolacha de silício, e (b) o dispositivo de PDMS-vidro acabado com a amostra de fluido e os canais de eléctrodos cheias com corante alimentar verde e vermelho, respectivamente. Veja a Figura 1 para as dimensões. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50634/50634fig3highres.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver maior figura</a> . 2. Preparar uma suspensão de células em DEP Tampão <ol><li> Prepara-se uma condutividade baixa (100 mS / cm) de tampão, o qual irá ser referido como &quot;tampão DEP&quot; (8,5% de sacarose [w / v], 0,3% de glucose [w / v], 0,725% de RPMI [w / v]) 16. </li><li> Suspender as células em tampão DEP em 3 x 10 6 células / ml. Aqui, canceroso do mouse em estágio avançado de ovário epitelial superficial (MOSE-L), as células são usadas. </li></ol> Nota: a análise de viabilidade celular pelo método de exclusão do corante azul de tripano demonstrou uma ligeira queda na viabilidade(95,1-91,6%) de início de carreira MOSE (MOSE-E), as células suspensas em tampão DEP à temperatura ambiente depois de 5 horas. Prevê-se que uma ligeira diminuição na viabilidade semelhante ocorre em células MOSE-L, o que indica que as células não devem ser armazenados em DEP tamponar a longo prazo. <ol start="3"><li> Tingir as células utilizando um corante fluorescente de membrana permeável, tal como a enzimaticamente activada Calceina AM. </li><li> Medir a condutividade da suspensão de células tingidas. A condutividade deve ser cerca de 100 mS / cm. Se a medição da condutividade é muito alta, a rotação da amostra para baixo, ressuspender em tampão DEP em 3 x 10 6 células / ml, e repetir a medição da condutividade. </li></ol> 3. Carregando o Microfluidic Chip CDEP <ol><li> Colocar o chip de microfluidos sob vácuo durante 30 min. </li><li> Enquanto isso, cortar um pedaço de tubo flexível, para abranger a distância entre a bomba de seringa para a fase de microscópio em que o chip de microfluidos será localizado. Aqui, um comprimento de tubo de 6 polegadasé necessária. Tubulação Fit para alfinetar ponta na seringa. </li><li> Estimar o comprimento necessário para o tubo de saída através da divisão do volume de amostra recolhido alvo por a área da secção transversal do tubo. Corte a exigir comprimento da tubulação. </li><li> Desenhar suspensão de células para dentro da seringa. Verificar que não há bolhas estão localizados no tubo ou seringa. </li><li> Após a remoção de chips de vácuo, inserir o tubo de saída e preparar o canal de amostra rapidamente para evitar bolhas de ar nos canais. Bater levemente na seringa quando purga para evitar a ruptura da fina (20 um) de isolamento barreira, embora tenha sido observado que a barreira pode suportar uma taxa de transferência elevada constante perto de 5 ml / h, sem se romper. </li><li> Para os principais canais de eletrodos, coloque rapidamente as pontas de pipeta vazias em uma saída de cada canal eletrodo fluídico. Pipetar 200 l de PBS contendo uma pequena quantidade de rodamina B e suavemente toque para introduzir o fluido dentro da extremidade oposta do canal de eléctrodo. Manter uma pressão suaveaté PBS com rodamina B visivelmente avança até a ponta da ponteira vazio. Repita o procedimento para cada canal de eletrodo. Rodamina B é usado apenas para visualizar fluorescência dos canais de eléctrodos fluídicos. </li><li> Depois de aprontar, preencher cada reservatório ponta da pipeta com PBS com B. Evitar formação de bolha rhodamine nos reservatórios de pontas para pipetas e remover qualquer bolha visível com cuidado pipetando para cima e para baixo. Retire a tubulação de saída e descartar de forma adequada, em seguida, insira um novo reservatório tubulação de saída para recolher o volume alvo. </li></ol> 4. Caracterizando Crossover freqüência de células usando CDEP Chip <ol><li> Posicione o chip no palco de um microscópio invertido equipado com câmera digital (Figura 4). </li></ol><img alt="Figura 4" src="/files/ftp_upload/50634/50634fig4.jpg" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/50634/50634fig4highres.jpg"/> Figura 4. </strong&gt; (a) a configuração experimental geral para experimentos CDEP. O chip CDEP está localizado na plataforma de um microscópio invertido. A câmera envia imagens para o computador para gravação. A bomba de seringa mantém um fluxo de entrada constante. O gerador de função que gera um sinal que é intensificada pelo amplificador de alta tensão e ligado ao chip CDEP por eléctrodos de arame. O osciloscópio monitora o sinal enviado para o chip. (B) Visualização de detalhes do chip CDEP e conexões fluídicas e eletrônicos. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50634/50634fig4highres.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver maior figura</a> . <ol start="2"><li> Montar seringa na bomba de seringa e inserir eletrodos de fio em reservatórios canal eletrodo fluídicos. </li><li> Bombear o líquido através de 1 ml / h, para assegurar um bom contacto entre a bomba de seringa e a seringa. Inspecione visualmente o comprimento do canal para garantir o fluxo desimpedido de células e ausência de bolhas ou vazamentos. Vermelhocaudal uce a 0.005 ml / h. Nota: O rendimento tão elevado como 1 ml / hr 31,35 foi conseguida em dispositivos de outras geometrias. </li><li> Por segurança, testar os componentes eletrônicos ao ligar o gerador de função, amplificador de alta tensão, e osciloscópio, e ajustar a tensão e frequência desejada. Aqui estes parâmetros são de 200 V e 20 kHz. Após a verificação do desempenho aceitável, desligue. Conecte os eletrodos para amplificador de alta tensão. Nota: Observe os procedimentos de segurança elétrica apropriadas quando estiver operando o sistema eletrônico nas altas tensões usadas para estes experimentos. </li><li> Ao atingir o fluxo estacionário, aplicar a tensão desejada na frequência desejada. Neste experimento, a tensão é de 200 V RMS em freqüências entre 5-60 kHz. </li><li> Gravar arquivos de vídeo da resposta celular com técnicas de processamento de imagem (passo 5) para quantificar a distribuição de células no canal e caracterizar a freqüência crossover. Para fazer isso,manter uma tensão constante e variar a frequência sistemática. No início e no final da experiência, assim como de forma aleatória entre os ensaios experimentais, registar a distribuição de células de controlo, a distribuição das células, sem aplicação de qualquer campo eléctrico. Estimar a quantidade de tempo necessário para que as células de fluxo a partir da entrada para o local de controlo (aqui, 5 minutos). Depois de definir uma nova freqüência, esperar este período de tempo, em seguida, começar a gravar (aqui, a 2 min de vídeo de distribuição celular). </li></ol> 5. Processamento de Imagem para a caracterização Crossover Frequency <ol><li> Usando um script computacional, analisar cada quadro de vídeo de quadro para determinar a posição relativa y (onde a direcção-z é a profundidade vertical do canal, a direcção y é a largura do canal, e na direcção x é o comprimento do canal) de cada célula fluorescente ou de partículas a uma especificada coordenada x, a jusante da região de alta força DEP no canal. Criar um gráfico dos dis relativostribuição. </li><li> Comparar a linha central da distribuição de cada tensão e da frequência com a linha central da distribuição de controlo. Para uma determinada voltagem e frequência variáveis, determinar a frequência de cruzamento, em que a linha central coincide com a posição y do controlo. </li></ol> 6. Variando o Experimento para executar a classificação celular ou Enriquecimento <ol><li> Suspender mistura desejada em tampão de DEP, a uma concentração total de 3 x 10 6 / ml de partículas. Aqui, esta mistura é MOSE células-L com 4 contas mM fluorescentes em tampão DEP. Siga as etapas descritas anteriormente para preparar um dispositivo CDEP. </li><li> Para classificar ou enriquecer as células a partir de uma mistura, determinar as frequências de transição das células alvo e as partículas de fundo, como anteriormente descrito. Operar a experiência, com uma frequência entre as duas frequências de transição das células alvo e as partículas de base, de modo que as duas populações de partículas experimentam forças DEP em frente directions. Para classificar as células MOSE-L e 4 mm de contas, operar o microdispositivo acima 11,90 ± 0,63 kHz. a primeira frequência de transição das células MOSE-L recentemente relatado por Salmanzadeh et al. 33 </li><li> Para recolher o conteúdo de uma amostra classificada, retirar o tubo de saída após a recolha do volume alvo, pela colocação de um dedo de luva através da abertura de saída e puxando suavemente o tubo. Verter o volume alvo recolhido num reservatório para posterior análise Nota:. Outros métodos de recuperação da amostra pode incluir um reservatório de fixação permanente com o chip e retirar a amostra por pipetagem simples. </li></ol>

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</ol>

Dr. Rafael Davalos tem uma patente pendente para dieletroforese contato.

DEP é uma técnica poderosa para determinar propriedades dielétricas de partículas e dirigir partícula movimento para classificar as aplicações, de isolamento, ou de enriquecimento. Devido ao efeito prejudicial do contato direto do eletrodo com uma amostra, outros tomaram abordagens semelhantes ao método apresentado anteriormente para evitar o contato. Por exemplo, Bashir et al. Desenvolveu dispositivos DEP sem contato usando um dispositivo de PDMS microfluídicos separado de eletrodos impressos placa de circuito por uma lamela de vidro fino, e esta técnica também é disponibilizado em formato de vídeo. 23,36 Aqui, demonstramos a fabricação de um chip CDEP e eléctrodos fluídicas através de um único substrato de PDMS, e o protocolo experimental para a separação de células de cancro do ovário a partir de uma mistura de células e esferas fluorescentes. A técnica apresentada foi usado com sucesso para uma variedade de aplicações mais complexas e fisiologicamente relevantes, incluindo a separação de livE e células mortas, 28 de tumor iniciar células a partir de células de câncer de próstata, 30 células de câncer de células vermelhas do sangue diluído, 31,32 e diferenciar entre os estágios do câncer de mama e câncer de ovário 37. 29 CDEP também tem sido utilizado para misturar as partículas 38 Estes. aplicações, sugerem que, usando a técnica simples apresentada, diversas finalidades pode ser realizado simplesmente pela alteração do desenho da geometria do canal. . DEP é útil em microescala para manipulação de partículas 13 para partículas esféricas, a força dieletroforética translacional depende do tamanho e propriedades eléctricas da partícula e o seu meio de suspensão, bem como o gradiente do campo eléctrico ao quadrado: <img alt="Equação 1" src="/files/ftp_upload/50634/50634eq1.jpg" /> onde ε m é a permissividade do meio de suspensão, r é o raioda partícula, e Rc [k (ω)] é a parte real do factor de Clausius-Mossotti (CM). O factor de CM é uma medida da polarizabilidade relativa da partícula em relação ao meio de suspensão e determina a direcção da força dielectrof orética. É descrita como <img alt="Equação 2" src="/files/ftp_upload/50634/50634eq2.jpg" /> onde <img alt="Equação 3" src="/files/ftp_upload/50634/50634eq3.jpg" /> e <img alt="Equação 4" src="/files/ftp_upload/50634/50634eq4.jpg" /> são as permissividades complexos da partícula e média, respectivamente. A permissividade complexa, <img alt="Equação 5" src="/files/ftp_upload/50634/50634eq5.jpg" /> , Depende da condutividade (σ) e freqüência (ω). O fator CM de partículas esféricas é teoricamente limitado entre -0,5 e 1. Se o factor de CM é negativo, as partículas experimentam PADS porque o meio é mais polarizável do que o das partículas, de modo que as partículas se movem fora de regiões degradientes de campo elétrico de alta. Se o factor de CM é positiva, as partículas são mais polarizável do que o meio e que experimentam PDEP em que se movem para as regiões de gradientes elevados do campo eléctrico. Para partículas biológicas que são não homogénea em termos de estrutura, tais como células, o factor de Clausius-Mossotti pode ser determinada a partir de um valor eficaz para a permissividade de partícula: <img alt="Equação 6" src="/files/ftp_upload/50634/50634eq6.jpg" /> onde <img alt="Equação 7" src="/files/ftp_upload/50634/50634eq7.jpg" /> e <img alt="Equação 8" src="/files/ftp_upload/50634/50634eq8.jpg" /> 26 r é o raio da célula, e d é a espessura da membrana plasmática; representam a permissividade complexa do permissividade complexa eficaz do interior da célula, tais como o citoplasma, e a membrana de plasma, respectivamente. Quando DEP ocorre com as partículas em suspensão numafluido, o movimento da partícula a em relação ao fluido irá gerar uma força de arrastamento sobre a partícula. Esta força de arrasto deve ser considerada ao determinar a força total atuando sobre a partícula. Para as situações de interesse aqui, forças viscosas dominam e as partículas são assumidas esférica, pequeno, e movendo-se com velocidade relativamente baixa, de modo que a lei arrasto de Stokes fornece uma boa aproximação para a força de arrasto: <img alt="Equação 9" src="/files/ftp_upload/50634/50634eq9.jpg" /> onde η é a viscosidade do fluido, u p é a velocidade da partícula, e u f é a velocidade do fluido, que pode também ser móvel. Dada a força dieletroforética, fluido e propriedades de partículas conhecido, e uma velocidade de fluxo conhecidos, o equilíbrio entre a força de arrasto e a força dieletroforética pode ser resolvido para estimar a velocidade da partícula. A taxa de cisalhamento que a experiência as células devem estar abaixo do limiar a partir do qual cell lise podem ocorrer. Caracterização das propriedades elétricas das partículas é necessário prever e controlar como eles vão reagir sob DEP-los. Neste trabalho, especificamente utilizados baixo CDEP frequência com células MOSE-L para demonstrar o protocolo para determinar o primeiro frequência de transição das células e, em seguida, mostrou a classificação contínua de esferas de poliestireno e células MOSE-L com base em suas respostas opostas DEP. Alterando a geometria do dispositivo CDEP vai mudar os gradientes espaciais do campo elétrico, permitindo que os dispositivos sejam projetados para alta freqüência ou operação de baixa frequência, e em alta seletividade e eficiência de triagem para um tipo de célula especificada. Além disso, os dispositivos de elevada capacidade pode ser desenvolvida por fabricar canais mais largos, 30 canais em paralelo, de 30 ou de fabricação de múltiplas camadas 35, no qual os canais de eléctrodos estão empilhadas verticalmente acima e abaixo relativamente profundacanal de amostra. Membranas finas formar a barreira entre as camadas. Os testes preliminares com dispositivos fabricados em polimetilmetacrilato (PMMA) e policarbonato (PC), os filmes finos demonstraram resposta de células DEP MOSE-L. Os esforços atuais estão em curso para aperfeiçoar dispositivos de alto rendimento multi-camada e para melhorar o sistema periférico no sentido de uma eventual plataforma plug-and-play. Para expandir a partir da técnica experimental básico apresentado, os pedidos e as especificações do dispositivo pode ser adaptado para caber exigências específicas, tais como a triagem contra caracterização, ou a adição de reservatórios de exemplo e um sistema de semi-automatizada para o dispositivo.

Enriquecimento da amostra biológica e de partículas de classificação é muitas vezes necessário para análise posterior. 1, por exemplo, o isolamento de células raras de fluidos corporais tem importantes aplicações em detecção de câncer e medicina individualizada. 2,3 As técnicas de enriquecimento mais comumente utilizados são células ativadas fluorescente (FACS ) 4 e magnético triagem de células activadas (MACS), 5, que dependem de marcadores de superfície expressas para diferenciar células. Outras estratégias incluem hidrodinâmico 6 ou inercial 7,8 triagem, pinças ópticas, 9 acoustophoresis, 10 e dieletroforese. 11,12 dieletroforese é o movimento de uma partícula polarizada na presença de um campo eléctrico não uniforme. DEP 13 tem sido usado para uma vasta gama de aplicações, incluindo as células de triagem 2,14 com base na viabilidade, 15 caracterizando propriedades bioeléctricos de células, 16 e espécieção mediante alterações induzidas nas propriedades biofísicas das células. 17,18 tradicional DEP utiliza eléctrodos planos estampados no interior de um canal microfluídico para aplicar uma tensão e provocar uma não-uniforme do campo eléctrico 13. Embora esta seja uma técnica poderosa, desafios podem surgir, tais como delaminação eletrodo e eletrólise. Dieletroforese baseado isolador (IDEP) 19 abordou os desafios da incrustação, eletrodo de delaminação e degradação espacial do campo eletrodo através de padronização de isolamento estruturas que induzem a não-uniformidades em um campo elétrico DC. IDep foi utilizada para separar selectivamente as células de bactérias vivas e mortas, 19 isolar os esporos bacterianos, 20 e manipular o ADN, 21, entre outras aplicações. Aquecimento de Joule pode ser um desafio, porque ele pode ocorrer como resultado das altas voltagens DC, muitas vezes exigidas. Para amenizar esses desafios, microdevices DEP livre de contato têm sido desenvolvidos. 22-24 <p class = &quot;jove_content&quot;&gt; A técnica aqui apresentada utiliza contactless dieletroforese (CDEP), assim chamado pela falta de contato direto entre os eletrodos metálicos e do canal de amostra. 22 Exclusivo para esta estratégia é a substituição de eletrodos metálicos com canais cheios de fluido com eletrodo uma solução altamente condutora. Estes eléctrodos de fluido estão capacitivamente acoplados através de uma barreira de isolamento fino para o canal de amostra por meio de uma tensão alternada. Eliminando o contato da amostra com eletrodos reduz problemas associados aos métodos baseados em DEP como eletrólise e formação de bolhas, contaminação da amostra, e eletrodo de delaminação. Como resultado, CDEP é especialmente útil para amostras biológicas porque suporta a viabilidade das células na amostra. Importante, CDEP pode manter a esterilidade da amostra. Um chip pode ser preparado de um capuz de cultura de células e o ensaio pode ser realizado sem a necessidade de contacto da amostra para eléctrodos de metal ou exigindo que a amostra seja aberto à Environment. Um reservatório simples pode ser fixado à saída de chip para facilitar a recuperação da amostra estéril. Além disso, a fabricação de eléctrodos de fluidos a partir do mesmo material polímero biocompatível (PDMS) como o canal de amostra reduz o custo elevado efectuadas com padrões costume de eléctrodos de metal, o tempo necessário para a fabricação, e limita a necessidade de equipamento especializado para a sala limpa padronização inicial do selo wafer de silício reutilizável. Movimento de partículas devido à DEP depende das características da partícula e o meio, bem como os gradientes espaciais do campo eléctrico. Uma partícula e dependente da frequência fator, chamado o factor de Clausius-Mossotti (CM), tem um valor no intervalo de -0,5 a 1, e determina a direcção da força DEP. A freqüência com que o fator de CM é exatamente zero é chamada de frequência de crossover. Este é o ponto em que nenhuma força é exercida sobre dieletroforética uma partícula e o sinal de alteração do factor de CM. A sfrequência de crossover ingle para microesferas sólidas inertes ocorre quando o fator CM alterações de negativa para positiva 25 Para células de mamíferos em tampão baixa condutividade da ordem de 0,01 S / m, uma freqüência primeiro cruzamento que indica uma transição de PADS para PDEP existe perto 10. - 100 kHz, e é influenciado pelo tamanho, forma, citoesqueleto, e propriedades da membrana da célula. 26,27 Uma segunda frequência de cruzamento a uma mudança da PDEP ao regime PADS é ​​da ordem de 10 MHz, e é influenciada pela relação núcleo-citoplasma, o citoplasma de condutividade, e retículo endoplasmático. 27 força DEP pode ser aplicada sem a presença do fluxo do fluido, mas aqui utiliza um fluido que se escoa para conseguir separação contínua das partículas suspensas. A influência combinada da força dieletroforética e força de arrasto de Stokes ditar o movimento de translação de uma partícula. Temos desenvolvido dispositivos para a operação em duas faixas de freqüência. Frequenc Superiordispositivos y (100-600 kHz) têm operado usando PDEP e alcançou a classificação do lote de células, como células tumorais da próstata iniciando (TICs), epiteliais da superfície ovariana células murino (Mose), MDA-MB-231 células de câncer de mama, ou viver THP -1 células prendendo seletivamente as células de interesse em isolar as mensagens localizadas no canal de amostra. 28-31 menor freqüência (5-100 kHz) dispositivos operam de forma contínua, e quando operado a uma freqüência na qual uma população experimenta PDEP enquanto a população fundo experiências PADS, pode redirecionar trajetórias de partículas para conseguir a classificação. 32-34 Estes dispositivos de baixa freqüência têm sido utilizados para classificar as células cancerosas a partir de células vermelhas do sangue, determinar as mudanças nas propriedades dielétricas de uma linha celular MOSE progressiva, e para elucidar os efeitos da não- tratamentos sphingolipid tóxicos em reverter características agressivas de células Mose agressivos. Além disso, microdevices CDEP pode ser projetado para operar em maior produção, atualmente de até 1 ml / hr. 31,35 Conforme descrito, a flexibilidade e baixo custo do processo de fabricação permite geometria do dispositivo customizados, que permitem que o processo experimental apresentado de ser relevante para uma vasta gama de aplicações. O objetivo a longo prazo da CDEP é realizar triagem de células isento de selo e de enriquecimento em nível clínico, com a recuperação da amostra para a cultura ou o processamento subseqüente. A técnica apresentada aqui é um método simples e barato, desde a fabricação até a experimentação, o que aumenta a acessibilidade da DEP. Nós demonstrar a preparação de um chip CDEP e o protocolo experimental para alcançar enriquecimento e caracterização de células de cancro do ovário a partir de microesferas fluorescentes.

<table><tbody><tr><td>Polidimetilsiloxano (PDMS)</td><td>Dow Corning, Midland, MI,USA</td> Lâminas de vidro <td>Sylgard 184</td><td></td></tr><tr><td> </td><td>The Microscope Depot</td><td>76079</td><td>Bordas retificadas de 2x3 polegadas</td></tr><tr><td>Tubulação de PTFE Microbore</td><td>Cole-Parmer Instrument Co, Vernon Hills, IL, USA</td><td>EW-06417-31</td><td>Paredes finas 20 gauge, 0.032"ID x 0.056"OD, 100 ft/rolo</td></tr><tr><td>Seringas de plástico Luer-slip</td><td>National Scientific empresa</td><td>S7510-1</td><td></td></tr><tr><td>Ponta da agulha</td><td>Howard Instrumentos eletrônicos</td><td>JG20-1.0</td><td>20 Calibre 1.0", ID=0.025" OD=0.036"</td></tr><tr><td>D (+)-sacarose</td><td>Fisher Scientific, Fair Lawn, NJ</td><td>S3-500</td><td></td></tr><tr><td>D(+)-glicose, reagente ACS, anidro</td><td>Acros Organics NV, Fair Lawn, NJ</td><td>AC410955000</td><td></td></tr><tr><td>RPMI-1640 Medium</td><td>Quality Biological Inc.</td><td>112-025-101</td><td></td></tr><tr><td>Calcein AM, Molecular Probes</td><td>Invitrogen Corp. (tecnologias de vida), Carlsbad, CA, EUA</td><td>C3100MP</td><td>comprimento de onda de excitação 488 / comprimento de onda de emissão 516</td></tr><tr><td>Rodamina B, O</td><td>Science Lab</td><td>SLR1465-100G</td><td>comprimento de onda de excitação 540 / comprimento de onda de emissão 625</td></tr><tr><td>Solução salina tamponada com fosfato (10X)</td> <td>Gbiosciences, St. Louis, MO</td><td>RC-147</td><td></td></tr><tr><td>Leica, microscópio de luz invertida </td><td>Leica Microsystems, Bannockburn, IL, USA</td><td>Leica DMI 6000B</td><td></td></tr><tr><td>Leica DFC420, câmera colorida</td><td>Leica Microsystems, Bannockburn, IL, USA</td><td>Leica DFC420</td><td></td></tr><tr><td>Gerador de função </td><td>GW Instek, Taipei, Taiwan</td><td>GFG-3015</td><td></td></tr><tr><td>Amplificador de potência de banda larga </td><td>Amp-Line Corp., Oakland Gardens, NY, USA</td><td>AL-50HF-A</td><td></td></tr><tr><td>HFHV Saída Transformador</td><td></td><td>AL-T50-V25/300-F100K-600K</td><td></td></tr><tr><td>Amplificador de alta tensão</td><td>Trek</td><td>Modelo 2205</td><td></td></tr><tr><td>USB Osciloscópio Modular, 100 MHz</td><td>AgilentTechnologies</td><td>U2701A</td><td></td></tr><tr><td>Limpador de Plasma Expandido</td><td>Harrick Plasma</td><td>PDC-001/002 (115/230V)</td><td>plasma de ar</td></tr><tr><td>Fita mágica escocesa</td><td>3M</td><td></td><td>qualquer largura disponível é suficiente</td></tr><tr><td>perfurador de 1,5 mm </td><td>Harris Uni-Core</td><td>Z708836-25EA.25</td><td></td></tr><tr><td>% Tripsina-EDTA</td><td>Invitrogen</td><td>25200-056</td><td></td></tr><tr><td>Microesferas de Sulfato FluoSpheres</td><td>Invitrogen</td><td>F8858</td><td>4.0 &mu; m, fluorescente vermelho (comprimento de onda de excitação 580/comprimento de onda de emissão 605)</td></tr><tr><td>AZ 9260 fotorresistente </td><td>AZ Electronic Materials</td><td></td><td></td></tr><tr><td>AZ 400 K desenvolvedor</td><td>AZ Electronic Materials</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Hidróxido de tetrametilamônio (TMAH) 25% </td><td></td><td></td><td>fornecido pela Virginia Tech sala limpa</td></tr><tr>Revestimento <td></td><td></td> de<td>Teflon</td><td>aplicado usando máquina DRIE</td></tr><tr><td>Silício wafer</td><td>University Wafer</td><td>452</td><td>100 mm de diâmetro, 500 &mu; m de espessura, um lado polido (SSP) </td></tr><tr><td>Gravação de íons reativos profundos (DRIE)</td><td>Alcatrel</td><td>AMS SDE 100</td><td></td></tr></tbody></table>

isolamento livre-label e enriquecimento de células através de contato dieletroforese

Label-free Isolation and Enrichment of Cells Through Contactless Dielectrophoresis

Dieletroforese (DEP) é o fenómeno pelo qual polarizado partículas num campo eléctrico não uniforme sofrer movimento de translação, e pode ser utilizada para dirigir o movimento de micropartículas de um modo independente do marcador de superfície. Tradicionalmente, os dispositivos DEP incluem eletrodos metálicos planos estampados no canal de amostra. Esta abordagem pode ser caro e requer um ambiente de sala limpa especializado. Recentemente, foi desenvolvida uma abordagem livre de contato chamado dieletroforese contactless (CDEP). Este método utiliza o princípio clássico da DEP, evitando o contato direto entre os eletrodos e amostra de padronização eletrodos fluídicos e um canal de amostra de um único polidimetilsiloxano (PDMS) substrato, e tem aplicação como uma estratégia de microfluídica rápido projetado para classificar e enriquecer micropartículas. Original para este método é que o campo eléctrico é gerado através de canais de eléctrodos fluídicos contendo um fluido altamente condutor, que são separadas dacanal de amostra por uma barreira isolante fina. Porque eletrodos de metal não contactar directamente a amostra, eletrólise, eletrodo delaminação, e contaminação da amostra são evitados. Além disso, isto permite um processo de fabrico simples e barato. CDEP é, portanto, bem adequado para a manipulação de partículas biológicas sensíveis. A força dieletroforética atuando sobre as partículas depende não apenas gradientes espaciais do campo elétrico gerado pelo projeto customizável da geometria do dispositivo, mas as propriedades biofísicas intrínsecas da célula. Como tal, CDEP é uma técnica sem etiqueta que evita dependendo biomarcadores moleculares expressas na superfície que pode ser variável expressas dentro de uma população, permitindo ainda a caracterização, o enriquecimento, e classificação de partículas biológicas. Aqui, nós demonstrar os conceitos básicos de fabricação e experimentação usando CDEP. Nós explicamos a preparação simples de um chip CDEP utilizando litografia suavetécnicas y. Discute-se o procedimento experimental para a caracterização de frequência de transição de uma partícula ou celular, a freqüência com que a força dieletroforética é zero. Finalmente, foi demonstrado o uso desta técnica para a triagem de uma mistura de células de cancro do ovário e microesferas fluorescentes (esferas).

DEP devem ser observada qualitativamente no canal de amostra para confirmar que o dispositivo está operacional, quando o campo eléctrico está presente. Um método para testar a presença de DEP é ajustar a frequência para valores perto da frequência de cruzamento onde forte PDEP e PADS está previsto (cerca de&gt; 40 kHz para observar PDEP e &lt;10 kHz para observar PADS para a maioria das células cancerosas de mamífero em um tampão com condutividade de 100 mS / cm). Deve-se notar que as microesferas inertes exibem PDEP abaixo da sua frequência de crossover e PADS acima de sua freqüência de crossover. Para a geometria característica dente de serra aqui apresentada, PDEP deve ser visto por células na freqüência de teste superior, indicado pela ocorrência de pérola encadeamento e foco de células ou partículas na borda característica dente de serra do canal, enquanto que a freqüência de teste inferior, PADS Deve ser evidente que as células estão restritos à região mais próxima da borda rectilínea do canal. A estas baixas frequências, as células podem lysE devido a electroporação, assim, a amostra pode parecem conter menos células, e aqueles que estão disponíveis podem aparecer alargada ou desfocada se utilizando um corante fluorescente enzimaticamente activada. Verificando as freqüências nas quais ocorrem PDEP e PADS permite a determinação da frequência de transição, conforme descrito no protocolo. No caso de células cancerosas de mamífero, tais como L-MOSE utilizados aqui, observou-se PADS a 5 kHz (Figura 5a) e forte PDEP a 60 kHz (Figura 5b). Células MOSE-L tinha um diâmetro de 17,7 ± 3,3 um (n = 268 células) e os grânulos têm um diâmetro nominal de 4 mm. Uma análise completa das propriedades dielétricas de células MOSE-L, em comparação com células Mose em estágios iniciais de progressão pode ser encontrada no recente trabalho de Salmanzadeh et al. 33 Se PDEP e PADS não são observadas nesses extremos, vários problemas podem estar ocorrendo. A condutividade da amostra pode ser muito alto devido a contaminantes ou lise celular. INSUFICIENTEnt campo eléctrico pode ser gerado devido a bolhas de ar nos canais do eléctrodo de fluido, o que impede a condução da corrente para a porção de um dos canais que fazem fronteira com o canal de amostra. Fluxo instável pode ser causada por uma bolha aprisionada na seringa ou tubagem de admissão, a partir de bolhas resultante não manter o dispositivo sob vácuo durante um tempo suficiente ou não encher rapidamente o dispositivo após a remoção do vácuo, o vazamento, devido à delaminação de PDMS fracamente ligadas ao lâmina de vidro, com lágrimas nos a membrana de barreira devido à força excessiva exercida quando do preenchimento dos canais, ou taxas de fluxo nos extremos da faixa de operação da bomba. Além de determinar a frequência de cruzamento de células, esta técnica pode ser utilizada para classificar uma mistura, aqui ilustrada por uma mistura de células-L MOSE e grânulos. Este exemplo aproveita a dieletroforese negativo (PADS) exibida por 4 mm de contas em freqüências onde as células MOSE-L experimentar dieletroforese positivo (PDEP). Nós operated o dispositivo a 200 V RMS e 10 kHz (Figura 6a) e observou-se que ambas as células e os grânulos foram misturados à medida que experimentaram PADS. Aos 50 kHz observamos movimento de células MOSE-L para o topo do canal, enquanto que os grânulos eram restritas à parte inferior do canal, permitindo a separação da mistura em duas componentes (Figura 6b). <img alt="Figura 5" src="/files/ftp_upload/50634/50634fig5.jpg" fo:content-width="6in" fo:src="/files/ftp_upload/50634/50634fig5highres.jpg"/> Figura 5. A posição de células MOSE-L é manipulada alterando a frequência do campo eléctrico aplicado. As fotos foram tiradas no recurso de dente de serra final no canal de amostra e os eléctrodos fluídicos estão localizados nos cantos do lado direito. Eles são cheios com PBS contendo rodamina B, o qual fluoresce de visualizar os canais. (A) células MOSE-L experimentar PADS a 200 V RMS<html> e 5 kHz. (b) células MOSE-L experimentar encadeamento de pérolas e PDEP a 200 V RMS e 60 kHz. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50634/50634fig5highres.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver maior figura</a> . <img alt="Figura 6" src="/files/ftp_upload/50634/50634fig6.jpg" fo:content-width="6in" fo:src="/files/ftp_upload/50634/50634fig6highres.jpg"/> Figura 6. Uma mistura de células MOSE-G (verde) e 4 mm de contas (vermelho) fluem através do recurso de dente de serra final no canal de amostra de um dispositivo CDEP de baixa freqüência. (A) Em 200 V e 10 células kHz e miçangas são misturados. As setas indicam a fraca aparecendo células que provavelmente morreram devido às condições de baixa freqüência. (B) Em 200 V e células 50 kHz experimentar PDEP e mover-se para a borda característica do canal, enquanto esferas de experimentar PADS e permanecer confinado à região mais próxima a borda em linha reta.&quot;target =&quot; _blank p_upload/50634/50634fig6highres.jpg &quot;&gt; Clique aqui para ver maior figura.

Dieletroforese Contactless (CDEP) alcança a classificação e enriquecimento de partículas através de suas propriedades dielétricas intrínsecas. Canais de eletrodos fluídicos substituir os eletrodos metálicos tradicionais para DEP, adequando CDEP para não danificar caracterização estéril e classificação de partículas biológicas. Demonstramos como preparar um microdispositivo CDEP e realizar a caracterização das células e experimentos de classificação.

Isolamento livre-Label e enriquecimento de células através de contato dieletroforese

Dielectrophoresis (DEP) is the phenomenon by which polarized particles in a non-uniform electric field undergo translational motion, and can be used to ...

O objetivo geral deste procedimento é induzir o movimento translacional de células suspensas em um fluxo impulsionado por pressão utilizando eletroforese com corante, sem contato direto entre os eletrodos e a amostra. Isso é realizado primeiramente suspendendo as células de interesse em um tampão de baixa condutividade. O segundo passo consiste em carregar o dispositivo microfluídico com a suspensão celular e introduzir um fluido altamente condutivo nos canais dos eletrodos.Em seguida, o dispositivo preparado é conectado à eletrônica de alta tensão e a resposta em frequência do movimento celular é registrada por meio de vídeo fornecido por uma câmera acoplada a um microscópio invertido. O passo final consiste em analisar as imagens de vídeo para prever quantitativamente as propriedades elétricas das células. Em última instância, a dieletroforese sem contato é utilizada para demonstrar que células com propriedades elétricas diferentes podem ser separadas de maneira livre de marcadores e não danosa, empregando dispositivos microfluídicos de baixo custo e fáceis de fabricar.Portanto, este método é útil para aplicações como separar células vivas de mortas, isolar células tumorais iniciadoras, separar células cancerígenas com base em estágios e analisar os efeitos de fármacos sobre diferentes células por meio de suas propriedades dielétricas. As principais vantagens desta técnica em comparação com métodos existentes, como a triagem de células ativada por fluorescência, são que as células podem ser separadas e caracterizadas com base em suas propriedades biofísicas intrínsecas, sem a necessidade de marcação com base em biomarcadores, e também que a esterilidade da amostra pode ser mantida ao eliminar o contato entre os eletrodos e a amostra. Bem, tivemos essa ideia inicialmente quando queríamos desenvolver uma técnica que evitasse diversos problemas, como contaminação da amostra, eletrólise e fabricação cara, associados a dispositivos dieléctroforéticos tradicionais.Para o isolamento de células de mamíferos. Siga os procedimentos previamente relatados utilizando photoresist e gravura reativa a íons profunda para gravar o design desejado dos canais em uma pastilha de silício, depositando uma camada fina de teflon para melhorar a liberação do microdispositivo da pastilha. Envolva a pastilha com folha de alumínio para evitar derramamento.Misture polimetilalano ou PDMS numa proporção de 10 para 1 de elastômero para agente de cura DGAs por aproximadamente 20 minutos e despeje sobre a pastilha. Em seguida, aqueça a pastilha por 45 minutos a 100 graus Celsius para evitar danificar o revestimento de teflon do carimbo após o resfriamento. Remova a folha de alumínio.Recorte o PDMS usando uma lâmina cirúrgica e faça furos de acesso na entrada e saída do canal. Utilize um furador rombo adequado ao tamanho do tubo; neste caso, utiliza-se um furador rombo de 1,5 milímetro. Em seguida, limpe uma lâmina de microscópio de vidro conforme indicado no protocolo descrito no texto.Limpe o dispositivo de PDMS usando fita adesiva Scotch Magic. Examine ao microscópio para garantir que os canais estejam limpos. Em seguida, exponha a lâmina e o dispositivo de PDMS ao plasma de ar por dois minutos e pressione firmemente o lado do canal do dispositivo contra a lâmina de vidro, evitando a formação de bolhas de ar entre o dispositivo e a lâmina.Prepare um tampão de baixa condutividade conforme descrito no protocolo textual, que será denominado tampão DEP. Suspenda as células no tampão DEP a 3 milhões de células por mililitro, utilizando-se aqui células cancerosas de camundongo em estágio avançado, células epiteliais da superfície ovariana ou células L musgo, após corar as células com um corante fluorescente permeável à membrana. Meça a condutividade da suspensão de células coradas.A condutividade deve ser aproximadamente 100 microsiemens por centímetro. Se a medição da condutividade for muito alta, centrifugue a amostra. Re-suspenda no tampão de profundidade e repita a medição de condutividade.O aspecto mais difícil deste protocolo é evitar bolhas nos canais dos eletrodos e no canal de amostra; bolhas nos canais dos eletrodos podem impedir as conexões eletroforéticas, e bolhas no canal de amostra podem impedir o fluxo constante. Certifique-se de realizar os passos demonstrados para evitar bolhas e garantir um fluxo estável antes de carregar o chip microfluídico C dip. Coloque-o sob vácuo por 30 minutos.Enquanto isso, corte um pedaço de tubo flexível para cobrir a distância da bomba de seringa até a platina do microscópio onde o chip microfluídico será colocado. É necessário um comprimento de seis polegadas de tubo. Encaixe o tubo na ponta da agulha da seringa.Em seguida, estime o comprimento necessário para o tubo de saída dividindo o volume alvo da amostra coletada pela área da seção transversal do tubo. Corte o comprimento necessário de tubo. A seguir, aspire a suspensão celular para dentro de uma seringa.Verifique se não há bolhas localizadas na tubulação ou na seringa. Após remover o chip do vácuo, insira a tubulação de saída e prepare rapidamente o canal da amostra. Para evitar bolhas de ar aprisionadas nos canais, bata suavemente na seringa durante o preparo.Para evitar romper a fina barreira isolante e preparar rapidamente os canais do eletrodo, coloque ponteiras vazias em uma saída de cada canal fluidico do eletrodo e pipete 200 microlitros de PBS contendo uma pequena quantidade de bromo B. Bata suavemente para introduzir o fluido na extremidade oposta do canal do eletrodo. Mantenha pressão suave até que o PBS com bromo B progrida visivelmente até a ponta da ponteira vazia. Repita o procedimento para cada eletrodo. O canal R domine B é usado apenas para fluorescência.Visualize os canais de eletrodos fluidicos após o escorvamento. Encha cada reservatório da ponteira de pipeta com PBS, com R domine B. Evite a formação de bolhas nos reservatórios das ponteiras de pipeta e remova quaisquer bolhas visíveis pipetando suavemente para cima e para baixo. Desconecte a tubulação de saída e descarte-a adequadamente.Em seguida, insira um novo reservatório de tubo de saída. Colete o volume alvo. Posicione o chip sobre a platina de um microscópio invertido equipado com câmera digital.Monte a seringa na bomba de seringa e insira os eletrodos de arame nos reservatórios do canal eletrodo fluídico; bombeie o fluido a uma taxa de um mililitro por hora para garantir um bom contato entre a bomba de seringa e a seringa. Inspecione visualmente o comprimento do canal para assegurar o fluxo ininterrupto de células e a ausência de bolhas ou vazamentos. Em seguida, reduza a taxa de fluxo para cinco microlitros por hora.Para segurança. Teste a eletrônica ligando o gerador de funções, o amplificador de alta tensão e o osciloscópio, e ajustando-os à tensão e frequência desejadas. Aqui, esses parâmetros são 200 volts e 20 quilohertz.Após a verificação do desempenho aceitável, desligue a alimentação. Em seguida, conecte os eletrodos ao amplificador de alta tensão. Após atingir um fluxo estável, aplique a tensão desejada na frequência desejada. Neste experimento, a tensão é de 200 volts RMS em frequências entre cinco e 60 quilohertz.Registre os arquivos de vídeo da resposta celular com técnicas de processamento de imagem para quantificar a distribuição celular no canal e caracterizar a frequência de cruzamento. Para isso, mantenha uma tensão constante e varie a frequência de forma sistemática no início e no final do experimento, bem como aleatoriamente entre as execuções experimentais. Registre a distribuição de células controle, que é a distribuição das células sem aplicar nenhum campo elétrico.Após definir um novo tempo de espera de frequência, aguarde o período necessário para que as células fluam da entrada até o local monitorado e, em seguida, inicie a gravação. Prossiga com o processamento de imagem para caracterizar a frequência de cruzamento conforme descrito no protocolo textual e suspenda a mistura desejada no tampão DEP numa concentração total de 3 milhões de partículas por mililitro. Neste caso, a mistura é composta por células L de musgo e microesferas fluorescentes de quatro micrômetros no tampão DEP; realize os passos descritos anteriormente. Para preparar um dispositivo CEP, conduza o experimento numa frequência entre as duas frequências de cruzamento determinadas para as células-alvo e as partículas de fundo, de modo que as duas populações de partículas sofram forças DEP em direções opostas.Para coletar o conteúdo de uma amostra variada, remova o tubo de saída após a coleta do volume alvo, colocando um dedo de luva sobre a abertura de saída e puxando suavemente o tubo. Despeje o volume alvo coletado em um reservatório para análise adicional. Para células cancerígenas de mamíferos, como as células L mais utilizadas aqui, observou-se DEP negativo em cinco quilohertz e DEP positivo acentuado.Em 60 quilohertz, as células MOS L têm um diâmetro de 17,7 ± 3,3 micrômetros, e as microesferas têm um diâmetro nominal de quatro micrômetros. Além de determinar a frequência de cruzamento das células, esta técnica pode ser utilizada para separar uma mistura, ilustrada aqui por uma mistura de células MO'S L e microesferas. Este exemplo aproveita a dieletroforese negativa exibida por microesferas de quatro micrômetros em frequências nas quais as células MO'S L experimentam dieletroforese positiva.Quando o dispositivo foi operado com 200 volts RMS e 10 quilohertz, ambas as células mostradas aqui em verde e os microesferas mostrados aqui em vermelho foram misturados, pois experimentaram DEP negativa a 50 quilohertz. Observou-se o movimento das células MOS L para o topo do canal, enquanto os microesferas foram restritos à porção inferior do canal, permitindo a separação da mistura em dois componentes. Assim, após este procedimento, outras técnicas podem ser realizadas a jusante, como cultivo celular e imagens de imunofluorescência ou ensaios bioquímicos, para responder a questões adicionais, como a forma como as propriedades dielétricas se correlacionam com as características físicas das células.Assim, após seu desenvolvimento, essa técnica realmente abriu caminho para que os biólogos estudassem como as alterações induzidas por metabólitos no citoesqueleto da célula podem ser correlacionadas às suas propriedades dielétricas, utilizando um modelo de câncer ovariano em camundongo. Após assistir a este vídeo, você deverá ter uma boa compreensão de como enriquecer e separar células utilizando eletroforese sem contato.

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