Matrix-assisted laser dessorção / ionização Time of Flight (MALDI-TOF) espectrometria de massa Análise de proteínas intactas maior que 100 kDa

O objetivo geral deste procedimento é analisar proteínas intactas maiores que 100 kilodaltons de maneira sensível por espectrometria de massa maldi. Isso é feito preparando primeiro as soluções de matriz. O segundo passo é depositar a solução de camada fina no alvo.

Em seguida, a amostra e a mistura de matrizes são depositadas no alvo. A etapa final é observar os pontos de amostra ao microscópio. Em última análise, um espectrômetro múltiplo a de massa é usado para analisar proteínas intactas e registrar espectros de massa.

A principal vantagem da espectrometria de massa maldi sobre outras abordagens analíticas, como ionização por eletrospray, é que ela é mais tolerante a sal, contaminantes e detergentes. Outra vantagem do maldi é que ele gera íons carregando menos cargas em comparação com o spray elétrico. Portanto, adquirir e interpretar dados MDI é bastante simples.

Para iniciar a cristalização do rech, despeje 10 mililitros de etanol a 40% em um pirex que. Em seguida, a 600 miligramas de uma matriz usando um banho-maria e um aquecedor de resistência. Aqueça a solução da matriz e mexa até que a matriz esteja completamente dissolvida.

Repita as etapas anteriores até que a solução esteja saturada. Deixe a solução esfriar lentamente em temperatura ambiente por várias horas e depois armazene a quatro graus Celsius durante a noite. Se os cristais não forem formados, raspe o interior do béquer logo abaixo da superfície da solução, usando uma haste de vidro para induzir a cristalização.

Finalmente, colete os cristais da matriz por filtração. Lave os cristais residuais no balão com uma quantidade mínima de solvente gelado e filtre-os. Quando a filtração estiver concluída, deixe os cristais secarem para limpar a placa alvo maldi.

Enxágue com metanol e limpe suavemente com um lenço umedecido. Em seguida, enxágue com água e limpe com um lenço umedecido. Insira o alvo maldi em um copo de 600 mililitros e cubra-o com etanol a 50%.

Em seguida, sonicar o alvo na solução de etanol por 10 minutos em um banho ultrassônico. Se houver resíduos restantes na placa, repita as etapas anteriores. Enxágüe o alvo com metanol ou água o solvente usado, determina o quanto a amostra se espalha.

Em seguida, incline o alvo para que todo o líquido seja coletado em um lenço Kim. Seque o alvo usando um fluxo de gás nitrogênio. Na próxima etapa, dissolva o alfa CHCA em acetona.

Para fazer uma solução saturada, mergulhe uma ponta de pipeta de 10 microlitros na solução saturada de alfa CHCA para que uma pequena quantidade da solução flua na ponta. Toque rapidamente no alvo maldi com a ponta da pipeta para depositar a solução alfa CHCA no alvo maldi usando um tubo de plástico de 1,5 mililitro. Prepare uma solução de 20 miligramas por mililitro de alfa CHCA dissolvendo alfa CHCA em uma proporção de sete a três volumes de acetonitrila para 5% de ácido fórmico, rotulada como solução de alfa CHCA.

Em seguida, prepare uma solução de DHB de 20 miligramas por mililitro dissolvendo o DHB em uma proporção de sete a três volumes de acetil nitrilo para ácido trifluoroacético a 0,1%, rotulada como solução de DHB. Misture a solução alfa CHCA e a solução DHB em uma proporção de volume de um para um. Para obter a solução C-H-C-A-D-H-B antes de iniciar este procedimento, uma etapa opcional é purificar as amostras de proteínas por troca de tampão mostrada na referência listada.

Caso contrário, deposite uma amostra de proteína não purificada no alvo MALDI. Em seguida, deposite 0,5 microlitros da amostra de proteína na camada fina alfa CHCA preparada. Imediatamente após isso, adicione 0,5 microlitros da solução C-H-C-A-D-H-B.

Deposite 0,5 microlitros do padrão Cain na placa MALDI e, em seguida, adicione 0,5 microlitros da solução da matriz. Depois que as amostras e o cain estiverem secos, você pode observar as manchas ao microscópio, inserir o alvo no instrumento e escolher a configuração apropriada do instrumento. Em seguida, escolha a faixa de proporção de massa para carga apropriada.

Adquira os espectros do ca e calibre o instrumento usando a intensidade de laser apropriada. Adquira os espectros das amostras de proteína. MALDI toff análise da região cromossômica intacta Manutenção de uma proteína é mostrada aqui.

A mistura C-H-C-A-D-H-B produziu espectros de massa de maior qualidade em termos de relação sinal-ruído e sensibilidade. Em particular, 0,5 picomoles de proteína depositados no alvo MALDI puderam ser detectados, enquanto a mesma quantidade de proteína foi quase imperceptível Usando o ácido SINO NIC utilizando a mistura C-H-C-A-D-H-B, foram observados íons multiplamente carregados da proteína, permitindo a determinação da massa com maior precisão porque a resolução de pico é inversamente proporcional à razão de carga mestre no caso de um instrumento multi toff axial. Além disso, usando a mistura C-H-C-A-D-H-B, nosso método de escolha para a deposição da matriz foi a abordagem de camada delgada.

Usando o método de gotículas secas, proteínas com massa superior a 100 kilodaltons não foram detectadas. A proteína beta aase monomérica foi analisada também por multi TOF. Os espectros de C-H-C-A-D-H-B foram melhores do que os espectros de ácido SINO NIC em termos de sensibilidade e resolução.

Além disso, a presença de íons com carga múltipla permitiu a confirmação da massa da proteína com maior precisão. MALDI para análise de uma imunoglobulina intacta é mostrada aqui. Os espectros obtidos usando a mistura C-H-C-A-D-H-B foram muito mais intensos do que os espectros SA e alfa CHCA.

Mais especificamente, os sinais proteicos foram maiores e tiveram melhor resolução nos espectros C-H-C-A-D-H-B. O uso da mistura C-H-C-A-D-H-B e o método de deposição em camada delgada demonstraram melhorias significativas na qualidade da proteína intacta grande. Espectros de massa adquiridos usando um instrumento MALDI.

O protocolo apresentado ilustra como adquirir espectros de massa de alta qualidade de proteínas de alto peso molecular usando um instrumento múltiplo. Enquanto você está realizando esse tipo de análise, três coisas são importantes. Primeiro, usar uma solução de métricas recém-preparada.

Em segundo lugar, depositar adequadamente sua amostra no alvo do Mali. E terceiro, usar a configuração instrumental apropriada, como intensidade do laser.