Abordagens para a frente genéticos em

O objetivo geral deste procedimento é realizar análise genética de Chlamydia trachomatis mediante a realização de mutagênese química e a determinação de associações genótipo-fenótipo. Isso é alcançado primeiramente gerando cepas mutantes de Chlamydia trachomatis por meio de mutagênese química. Em seguida, todas as mutações geradas quimicamente são identificadas por sequenciamento completo do genoma, seguido de montagem do genoma orientada por referência.

Em seguida, identificam-se associações entre fenótipo e genótipo nas linhagens mutantes. Por fim, as associações entre fenótipo e genótipo são confirmadas mediante a geração de linhagens recombinantes e sua análise. Em última instância, podem-se obter resultados demonstrando que uma mutação em um gene específico de *Chlamydia* leva a um fenótipo de interesse por meio de uma combinação de abordagens clássicas de mutagênese química e sequenciamento de nova geração Singh.

No momento, não existem métodos disponíveis para substituição gênica em chlamydia e as ferramentas genéticas moleculares para seu estudo estão em estágio inicial. Este método não requer transformação com DNA recombinante nem o desenvolvimento de ferramentas genéticas moleculares, ainda assim alcança o mesmo objetivo, que é a atribuição de função aos produtos gênicos individuais.

Para preparar as células cultivadas, semeie aproximadamente um vezes 10 elevado a seis células viris por 25 centímetros quadrados em três mililitros de DMEM suplementado com 10% de FBS e incube a 37 graus Celsius com 5% de dióxido de carbono. Quando as células atingirem confluência, cerca de 24 horas depois, aspire o meio e infecte as células com clamídia numa multiplicidade de infecção de cinco. Num volume total de três mililitros de DMEM-FBS contendo 200 nanogramas por mililitro de cicloheximida, inicie a mutagênese 18 horas após a infecção. Sob uma capela química, prepare 20 miligramas por mililitro de etil metano sulfonato ou EMS em PBS com cloreto de cálcio e cloreto de magnésio.

O EMS é um potente mutagênico e carcinogênico. Portanto, consulte o protocolo textual para seu descarte. Aspire o meio das células Vero e lave-as uma vez com três mililitros de PBS com cloreto de magnésio e cloreto de cálcio.

Em seguida, adicione três mililitros da solução de EMS e incube por uma hora na câmara de fluxo laminar à temperatura ambiente. Após a incubação, remova o EMS e coloque-o em um recipiente contendo hidróxido de sódio 1 molar para inativar o agente mutagênico antes de lavar as células três vezes para remover qualquer resíduo de EMS. Em seguida, adicione seis mililitros de DMEM com 10% de FBS, contendo 200 nanogramas por mililitro de cicloheximida e 25 microgramas por mililitro de gentamicina, e incube a 37 graus Celsius com 5% de dióxido de carbono por 48 a 72 horas.

As inclusões aparecem desprovidas de bactérias cerca de 36 horas após a mutagênese às 72 horas. Cerca de 10% das inclusões estão preenchidas com bactérias, enquanto o restante permanece vazio para extrair os corpos elementares ou EBS por lise hipotônica; aspire completamente o meio. Adicione um mililitro de água e agite por 10 minutos para destacar as células, lise as células pipetando para cima e para baixo pelo menos 10 vezes.

Após coletar o lisado em um tubo de microcentrífuga, adicione 0,25 mililitros de tampão de sacarose, fosfato e glutamato 5x, ou SPG, para obter uma concentração final 1x e armazene a menos 80 graus Celsius. Prepare monocamadas confluentes de células Vero em placas de seis poços, semeadas com cerca de 0,4 vezes 10 elevado a 6 células em três mililitros de DMEM contendo 10% de FBS por poço, e deixe as células formarem uma monocamada homogênea nas próximas 24 horas. Em seguida, coloque no gelo uma solução estoque de clamídia mutagênica.

Em seguida, prepare seis tubos com diluições seriadas de dez vezes em um volume total de 200 microlitros por diluição em DMEM 10%FBS e coloque-os no gelo. Use três mililitros por poço de PBS para lavar as células Vero duas vezes. Em seguida, adicione três mililitros de DMEM a cada poço de placas de seis poços e 100 microlitros da diluição bacteriana em duplicata.

Agite a placa para garantir uma mistura homogênea. Centrifugue as placas infectadas a 2.700 ×g por 30 minutos a 15 °C. Em seguida, incube-as a 37 °C em um incubador com 5% de dióxido de carbono e umidade controlada por uma a duas horas.

Enquanto isso, prepare 0,54% AROS em DMEM combinando primeiro os seguintes ingredientes e misturando bem. Em seguida, misture 18,9 mililitros de AROS 1,2% quente e estéril em água, agitando para evitar grumos. Mantenha a mistura aquecida em banho-maria a 55 graus Celsius.

Aspire a suspensão bacteriana das placas e adicione seis mililitros da solução de aro morna. Deixe solidificar completamente em temperatura ambiente fora da cabine. Em seguida, na cabine de segurança biológica com as tampas removidas, seque as placas por mais 15 minutos. Quando as placas estiverem secas, incube-as a 37 graus Celsius em uma incubadora de dióxido de carbono por sete a 10 dias.

As placas devem ser visíveis com o auxílio de um microscópio estereoscópico um dia antes do isolamento dos mutantes. Veja um vezes 10 elevado a quatro zero células em 100 microlitros por poço. Em uma placa de 96 poços, as células estarão confluente em 24 horas.

Sob um microscópio estereoscópico, marque as placas a serem selecionadas e, em seguida, utilize uma pipeta estéril de um mililitro com barreira para coletar fragmentos das placas. Re-suspenda as placas em 100 microlitros de DMEM suplementado com 10% de FBS, 400 nanogramas por mililitro de cyclo, heide e 50 microgramas por mililitro de gentamicina para expandir as linhagens mutantes. Cubra a suspensão sobre monocamadas confluente de células Vero.

Centrifugue as placas a 2.700 ×g e 15 graus Celsius por 30 minutos antes de incubar as culturas colhidas quando mais de 50% das células estiverem infectadas, o que pode ocorrer entre 48 horas e 14 dias após a infecção. Essa quantidade de células infectadas permite armazenar bactérias viáveis suficientes para extração de EVs por lise hipotônica das células infectadas. Após aspirar o meio, adicione 160 microlitros de água estéril e incube à temperatura ambiente por 10 minutos.

Utilize ponteiras com barreira para romper as células, pipetando para cima e para baixo várias vezes para garantir a lise completa. Por fim, transfira 160 microlitros de cada lisado para tubos microfuge. Adicione 40 microlitros de SPG 5X e armazene a menos 80 graus Celsius até o momento de realizar o ensaio e triar mutantes para fenótipos de interesse.

A exposição ao agente mutagênico leva à formação de inclusões que parecem desprovidas de bactérias, presumivelmente devido à morte celular bacteriana. Normalmente, o sorovar LGVL dois lisa completamente as células infectadas dentro de 48 horas pós-infecção, mas o tratamento com agentes mutagênicos pode prolongar esse ciclo para mais de 90 horas, e cerca de 10% das inclusões são esperadas para recuperar em nossos experimentos. Células Vero infectadas e tratadas com 20 miligramas por mililitro de EMS apresentaram uma redução de 99% na recuperação de progênie infecciosa em comparação com os controles não tratados, como observado nesta figura.

O tratamento com mutagênio também levou ao surgimento de placas com morfologias alteradas, incluindo placas pequenas. Outras morfologias incluem placas que parecem granulares, agregadas ou com formato de favo de mel, como mostrado aqui. As doses de EMS utilizadas nestes estudos podem resultar em de três a 30 mutações por genoma KCL, conforme avaliado experimentalmente por NGS.

Embora os EBS purificados por gradiente sejam amplamente livres de material de células hospedeiras, o DNA do hospedeiro também é detectado e representa cerca de 10 a 15% das preparações genômicas após este procedimento. Podem ser realizadas triagens para fenótipos como replicação prejudicada em células de cultura tecidual, perda de atividades bioquímicas ou alterações na morfologia bacteriana, com o objetivo de responder perguntas adicionais, como quais fatores bacterianos são necessários para a formação e manutenção da clamídia, fatores patogênicos.