Modelos e Métodos para avaliar Transporte de Drug Delivery Systems através das barreiras celulares

O objetivo geral deste procedimento é avaliar o transporte de um sistema de liberação de fármacos ou do agente terapêutico que ele carrega através de uma barreira celular, como um modelo do epitélio gastrointestinal relevante para a liberação oral de fármacos. Isso é realizado primeiramente cultivando células caco dois em inserts transwell para permitir a diferenciação celular e a formação de uma monocamada celular.

O segundo passo é validar que este modelo representa uma barreira de permeabilidade mediante a medição da resistência elétrica transepitelial, coloração imuno-histoquímica das junções celulares e avaliação da permeabilidade passiva de uma molécula traçadora detectável. O próximo passo é preparar o sistema de liberação de fármacos; neste exemplo, são utilizados nanocarreadores poliméricos direcionados. Os carreadores podem conter ou não uma carga de fármaco, e devem ser incluídos controles, como carreadores não direcionados ou fármaco livre.

Esses elementos são marcados com radioisótopos para permitir sua detecção. Os transportadores são então adicionados à câmara apical acima da monocamada celular após a incubação. Em diferentes pontos de tempo, os transportadores são coletados da câmara apical, da câmara basolateral e da monocamada celular e testados quanto à possível degradação do componente marcado.

O transporte de nanocarreadores através da monocamada celular é então calculado finalmente, para investigar o mecanismo de transporte. Experimentos semelhantes devem ser realizados na presença de inibidores farmacológicos da transcitose através das células ou com indicadores do transporte paracelular entre células. A técnica que descrevemos aqui é uma adaptação de métodos bem estabelecidos utilizados para avaliar a taxa e o mecanismo de transporte de fármacos e nanoportadores de fármacos através de monocamadas celulares em cultura, os quais representam barreiras celulares no organismo.

Embora o exemplo em que nos concentramos aqui valide o transporte de nanopartículas poliméricas direcionadas através de um modelo de epitélio gastrointestinal. Métodos semelhantes também podem ser aplicados para examinar a passagem de diferentes sistemas de liberação de fármacos através dessas ou outras monocamadas celulares, como células endoteliais que normalmente formam uma barreira entre a corrente sanguínea e os tecidos e órgãos. Por exemplo, no caso da barreira hematoencefálica, geralmente indivíduos novos neste método enfrentarão dificuldades devido à complexidade na escolha de marcadores adequados para rastrear corretamente os sistemas de liberação de fármacos nestes estudos, particularmente se forem transportados através das células e em pequenas quantidades.

Para este aspecto, utilizaremos radioisótopos para marcar os sistemas de liberação de fármacos em nossos estudos; outra preocupação importante é validar a integridade da barreira celular modelo e utilizar os controles apropriados para validar isso ao longo dos experimentos. Este procedimento é realizado em uma capela de cultura celular estéril de nível biosseguro dois, e todos os materiais que entrarem na capela devem ser esterilizados com etanol utilizando pinças para posicionar inserções transwell de polietileno com porosidade de 0,8 micrômetro em uma placa de 24 poços, a fim de obter resultados estatisticamente significativos.

Cada condição experimental exige um mínimo de quatro repetições. Dilua células de adenocarcinoma colorretal epitelial humano ou células Caco-2 no meio celular previamente preparado. Adicione de 200 a 400 microlitros da solução celular na câmara superior ou apical do transwell.

Inocule com uma densidade de 1,5 vezes 10 à quinta potência de células por centímetro quadrado. Preencha a câmara inferior ou basolateral com 700 a 900 microlitros de meio de cultura celular e cultive as células a 37 graus Celsius, 5% de dióxido de carbono e 95% de umidade por 16 a 21 dias, substituindo o meio a cada três a quatro dias nas câmaras superior e inferior.

Substitua o meio na seguinte ordem para manter a pressão acima da monocamada celular: aspire o meio da câmara inferior, aspire o meio da câmara superior. Encha a câmara superior com 200 a 400 microlitros de meio fresco e encha a câmara inferior com 700 a 900 microlitros de meio fresco para validar a barreira de permeabilidade epitelial por estágio. Configure o voltôhmetro na posição de resistência e coloque verticalmente os eletrodos em um poço contendo o inserto transwell.

O eletrodo curto deve estar na câmara superior e o eletrodo longo na câmara inferior, tocando o fundo do poço. Uma vez que a leitura do voltímetro se estabilize, registre o valor da resistência em ohms para cada poço. Repita as medições a cada um ou dois dias até que os valores aumentem até um máximo e se estabilizem, indicando a formação de uma barreira de permeabilidade, o que normalmente leva de duas a três semanas a partir do momento do plaqueamento celular.

Para verificar a presença de junções apertadas em monocamadas celulares com alto grau de confiança inicialmente, fixe as células, aspire o meio de ambos os compartimentos e lave as células três vezes com DMEM morno, incube com paraformaldeído a 2% frio por 15 minutos. Após 15 minutos, remova o paraformaldeído e lave as células três vezes com PBS. Em seguida, adicione um micrograma por mililitro de anticorpo anti-occludina a cada um.

Utilizaremos poços com baixa vazão como controle negativo para a formação da barreira. Incube por 30 minutos à temperatura ambiente. Após 30 minutos, lave as células novamente com PBS e, em seguida, adicione 7,5 microgramas por mililitro de anticorpos secundários marcados a cada poço e incube por 30 minutos à temperatura ambiente no escuro. Por fim, lave as células com PBS e remova cuidadosamente a membrana de filtro à qual a monocamada fixada está aderida, montando-a sobre lâminas para imageamento utilizando microscopia epifluorescente, de fluorescência ou confocal.

Este procedimento inicia-se com a marcação do anticorpo direcionado com iodo 125 e o cálculo da atividade específica do anticorpo marcado em contagens por minuto por micrograma, utilizando protocolos previamente publicados. Neste exemplo, o anticorpo direcionado é um anticorpo monoclonal murino contra a molécula de adesão intercelular humana, um ou anti-ICAM um, para controle de especificidade. A IgG murina marcada com iodo 125 será utilizada para preparar nanoportadores revestidos não direcionados, a fim de estudar o transporte de uma carga terapêutica.

A carga também é marcada com iodo 1 25. Neste exemplo, a carga é a alfa galactosidase ou alfa G, uma enzima terapêutica utilizada no tratamento da doença de Fabry, um distúrbio genético de armazenamento lisossômico. Um dos aspectos mais difíceis deste procedimento é garantir a detecção adequada dos materiais transportados.

Para garantir o sucesso, os componentes dos nanocarregadores devem ser marcados com uma quantidade suficiente de isótopos em alta atividade específica. O próximo passo é acoplar o anti-ICAM marcado à superfície dos nanocarregadores. Neste caso, simplesmente misturamos o anti-ICAM marcado com iodo 1 25 com nanobolas de poliestireno de 100 nanômetros de diâmetro como modelo para o controle não específico.

Utilize IgG marcado com iodo 125 e, para rastrear o transporte de uma carga, use uma combinação de anti-ICAM e alfa-G marcado com iodo 125. Incube as misturas por uma hora à temperatura ambiente para permitir a absorção na superfície; após uma hora, centrifugue a 13.000 ×g por três minutos e, em seguida, remova os contrapartes não revestidos no sobrenadante por pipeta de aspiração. Suspenda o pellet contendo os nanoportadores revestidos em 1% de albumina sérica bovina em PBS e, posteriormente, sonique em baixa potência para romper possíveis agregados de partículas. Adicione os nanoportadores de anti-ICAM marcados com iodo 125 à câmara superior acima de monocamadas confluentes de Caco-2 com alta resistência. Repita o procedimento para os contrapartes não específicos e terapêuticos após a medição da absorção.

Incubar a 37 graus Celsius por um ou mais intervalos de tempo desejados. Medir novamente a ruptura após a incubação. As medições de ruptura servem para avaliar os efeitos dos nanocarreadores na barreira de permeabilidade.

Colete o meio das câmaras superior e inferior. Lave a câmara superior com 0,5 mililitros de DMEM a 37 graus Celsius e a câmara inferior com um mililitro de água desionizada. Colete as lavagens para medição do conteúdo total de radioisótopo utilizando um contador gama para medição da fração celular.

Excise o filtro permeável utilizando uma lâmina de barbear para cortar ao redor das bordas. Incube-o em um tubo de contador gama com Triton X-100 a 1% durante 10 minutos para liberar o conteúdo celular antes de medir a radioatividade total associada às células, a fim de quantificar o iodo 125 liberado de nanoportadores durante o transporte ou devido à possível degradação. Primeiro, misture 300 microlitros de cada amostra com 700 microlitros de BSA a 3% em PBS e 200 microlitros de ácido tricloroacético ou TCA e incube à temperatura ambiente por 15 minutos.

Durante esta incubação de 15 minutos, meça a radioatividade total das amostras em um contador gama. Centrifugue as amostras de ácido tricloroacético (TCA) a 3000 ×g por cinco minutos para separar a proteína intacta da proteína degradada ou da fração de iodo-125. Quantifique a radioatividade da fração de iodo-125 livre e subtraia esse valor da radioatividade total medida antes da centrifugação. Isso fornecerá a quantidade de proteína marcada versus a fração de radiotraçador que se destacou dela, para avaliar o transporte paracelular utilizando vazamento paracelular de albumina. Cultive monocamadas de células KCO2 em inserts de transwell, como demonstrado anteriormente, adicionando ao compartimento superior, acima da monocamada celular, ou albumina marcada com iodo-125 isoladamente, como controle negativo mostrando o nível basal de vazamento, ou iodo.

1 25 albumina marcada e anticorpo não marcado com radiação. Incubar os nanocarreadores direcionados a 37 graus Celsius durante os intervalos de tempo selecionados, que devem corresponder aos analisados ao testar nz.Transport. Medir a lágrima conforme demonstrado anteriormente, antes, durante e após a incubação.

Colete todas as frações após a incubação para medições de iodo total 1 25 e iodo livre 1 25 como controle positivo para abertura de junções intercelulares. Adicione o meio celular contendo peróxido de hidrogênio cinco milimolar às câmaras superior e inferior do transwell. Insira e incube a 37 graus Celsius por 30 minutos.

Meça o vazamento e adicione albumina com iodo-125 à câmara superior nos intervalos de tempo selecionados. Meça o vazamento em diversos pontos temporais durante a incubação para identificar a diminuição do valor de vazamento causada pela abertura das junções celulares induzida por peróxido de hidrogênio. Em experimentos paralelos, avalie o transporte transcelular ou transcitose de nanoportadores direcionados com iodo-125 incubando monocamadas confluentes de Caco-2 com cada um desses inibidores.

50 micromolar de MDC, um inibidor da endocitose mediada por clatrina. Um micrograma por mililitro de filipina, um inibidor da endocitose mediada por clar. 0,5 micromolar de WT manina, um inibidor da fosfatidilinositol três quinase, que participa da macropinocitose, e 20 micromolar de EIPA.

Um inibidor da macropinocitose e da endocitose mediada por quimiotáticos mede a resistência transepitelial antes, durante e após a incubação das células com inibidores e materiais marcados com radiação como um controle adicional para o efeito dos inibidores sobre a permeabilidade da monocamada, a fim de validar monocamadas CACO-2 como um modelo de transporte transepitelial de nanocarreadores direcionados. Células CACO-2 foram cultivadas em inserts transwell a 1,5 × 10⁵ células por centímetro quadrado, e a resistência elétrica transepitelial, ou TER, foi medida para avaliar a integridade da monocamada. Conforme mostrado neste gráfico, a monocamada atingiu confluência no dia 12 e manteve a integridade da monocamada até o dia 18. Esse resultado foi ainda validado pela presença de junções apertadas positivas para ocludina em monocamadas com um alto TER de 380 ohms por centímetro quadrado no dia 14, em comparação com a marcação difusa das junções apertadas em um baixo TER de 17 ohms por centímetro quadrado no dia 5. Para avaliar o transporte de nanocarreadores anti-ICAM através de monocamadas de células CACO-2 confluentes, monocamadas CACO-2 cultivadas em inserts transwell foram incubadas com nanocarreadores anti-ICAM marcados com iodo-125 adicionados à câmara apical.

O teor de iodo 125 na câmara basolateral foi medido nos pontos de tempo indicados para calcular a quantidade de nanoportadores transportados por célula, conforme mostrado no painel superior. No painel inferior, a porcentagem de nanoportadores transportados foi calculada como a razão entre os portadores encontrados na fração basolateral e aqueles na fração combinada de basolateral e células. Esses parâmetros estimados neste exemplo para nanoportadores de iodo 125 anti-ICAM também foram comparados aos do controle, nanoportadores de iodo 125 IgG, para demonstrar a eficiência de transporte em relação a uma contraparte não direcionada, e os resultados são mostrados no painel superior.

Os coeficientes de permeabilidade aparente também foram calculados, refletindo as taxas de transporte de nanoportadores de iodo-125 anti-ICAM ou nanoportadores de iodo-125 IgG, conforme mostrado no painel inferior, quando o marcador radioativo é incorporado à carga do nanocarrier. Os parâmetros descritos refletem o transporte da carga, que neste exemplo é a enzima alfa-GA utilizada no tratamento de uma desordem genética de armazenamento lisossômico conhecida como Doença de Fabry. O conteúdo de radioisótopo nas frações apical, basolateral e celular foi medido após três horas e 24 horas e convertido em diversos valores relevantes para o transporte, conforme mostrado nesta tabela.

Além de calcular o transporte de nanocarreadores por meio do rastreamento da carga, a liberação transepitelial desta enzima terapêutica pode ser estimada expressando-a como moléculas ou picogramas de alfa-gal transportados por célula. O mecanismo de transporte de nanocarreadores anti-ICAM através de monocamadas de Caco também foi investigado. O transporte transcelular de nanocarreadores anti-ICAM marcados com iodo-125 através de monocamadas confluentes de Caco-2 foi avaliado após 24 horas na ausência ou presença dos seguintes inibidores: EIPA, Filipina MDC ou Wirtmanina. O EIPA é um inibidor da macropinocitose e da endocitose mediada por canais. Filipina, MDC e Wirtmanina são inibidores da endocitose mediada por caveolas, endocitose mediada por clatrina e macropinocitose, respectivamente.

Conforme indicado neste gráfico, a EIPA reduziu o transporte de nanoportadores de iodo 1 25 anti-IAM através de monocamadas de células CACO-2, enquanto a Filipina MDC e a Wirt Menin não reduziram os níveis de transporte em relação à condição controle. Isso sugere que os nanoportadores anti-ICAM utilizam endocitose mediada por caveolas para o transporte transcelular, mas não a transcitose relacionada a clarina, clatrina ou macropinocitose.

Para avaliar o transporte paracelular, a resistência transepitelial foi medida durante o transporte de nanocarreadores de iodo 1 25 anti-ICAM através de Caco-2. Dois valores de resistência transepitelial de monocamadas na ausência de nanocarreadores são mostrados como controles, e o intervalo tracejado marca o erro padrão da média da incubação com cinco milimolares. O peróxido de hidrogênio foi um controle positivo para a abertura das junções intercelulares, conforme refletido na redução da resistência transepitelial até níveis basais.

Além disso, foi medida a vazão proteica paracelular, determinada como o coeficiente de permeabilidade aparente do iodo 125, da albumina que atravessa a monocamada celular na ausência ou presença de cinco milimolares de peróxido de hidrogênio, nanoportadores de IgG ou nanoportadores anti-ICAM, e calculou-se que o peróxido de hidrogênio aumentou significativamente a vazão de albumina marcada com iodo 125 para a câmara basal lateral, servindo como controle positivo, conforme mostrado nestes gráficos. A incubação com nanoportadores anti-ICAM não alterou a vazão paracelular de lágrima ou de albumina marcada com iodo 125 ao longo de um período de 48 horas, semelhante aos nanoportadores de IgG controle, que não são transportados.

Esses resultados descartam o transporte paracelular e são compatíveis com os resultados anteriores que sugerem que os nanoportadores anti-ICAM utilizam a endocitose mediada por cam para o transporte transcelular. Ao realizar este procedimento, é importante selecionar um ou mais tipos celulares apropriados e um filtro permeável com tamanho de poro, material, diâmetro, entre outros, adequados para o modelo Transwell, bem como técnicas de marcação para a quantificação eficaz do seu sistema de liberação de fármacos após este procedimento. Outros métodos, como microscopia de fluorescência ou microscopia eletrônica de transmissão, podem ser utilizados para determinar a localização dos materiais transportados e, adicionalmente, verificar o estado dos materiais transportados.

O blot ocidental pode ser utilizado para medir a degradação de proteínas. O EISA pode ser usado para determinar a capacidade de direcionamento de carreadores transportados, e a atividade da carga terapêutica pode ser medida por meio de ensaios espectrofotométricos ou outras técnicas apropriadas.