Name: Potenciação de longo prazo da Via Perfurante-giro denteado Synapse em Livremente Comportando Ratos (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-11-29T15:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 13 s
Description: Aprenda a registrar a potenciação de longo prazo (LTP) em camundongos livremente comportantes usando eletrodos implantados na via perfurante e no giro denteado. Este método avança a pesquisa em neurofisiologia e doenças neurológicas.

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Os autores gostariam de reconhecer o seguinte: Dr. Joseph Bronzino, Dr. Khamis Abu-Hassaballah, o Sr. Austin-RJ LaFrance, ea Sra. Jessica Koranda.

Este protocolo é apropriado para os ratinhos de 3 e 18 meses de idade e peso corporal aproximado de 30-50 g). Ratos podem ser obtidos no Laboratório Jackson (Bar Harbor, ME). Todos os protocolos cirúrgicos e experimentais foram aprovados pelo Comitê Animal Care e Use o Trinity College e estavam de acordo com o Guia do NIH para o Cuidado e Uso de Animais de Laboratório. 1. Preparação Animal e Procedimentos Cirúrgicos <ol><li> Prepare coquetel contendo anestesia de cetamina (25 mg / ml), xilazina (2,5 mg / mL) e acepromazina (0,5 mg / ml). Injectar 1 mL / kg de peso corporal no quadrante inferior direito do abdómen completada por injecções 0,2 ml / kg a cada 45 minutos depois disso a manter uma profundidade de anestesia estável utilizando o reflexo de retirada do pedal. </li><li> Prepare rato anestesiado para a cirurgia raspando a pele em seu crânio com um barbeador elétrico. A área raspada deve incluir no meio dos olhos para o meio das orelhas. Certifique-se de não fazer a barba a Whiskers como eles fazem parte do sistema sensorial barril mouse. </li><li> Use cotonetes para aplicar álcool isopropílico seguido de Betadine para a área raspada na cabeça. Em seguida, também usando cotonetes, aplicar uma pequena quantidade de óleo mineral sobre os olhos para evitar os globos oculares de secagem. </li><li> Use punhos da orelha de ratos infantis em vez de barras de ouvido regulares para montar a cabeça do animal sobre o aparelho quadro estereotáxico. Para fazer isso, a primeira montagem da orelha esquerda no punho da orelha esquerda. Então aliviar suavemente a orelha direita para a braçadeira direita, apoiando suavemente a cabeça do animal com uma mão e fazer avançar o manguito ouvido com a outra mão. Em seguida, coloque uma almofada de aquecimento sob o corpo do animal e configurá-lo para 86 ° F para manter a temperatura corporal. </li><li> Em seguida, verifique se há rigidez bilateral ao tentar mover o lado da cabeça para o outro. O animal está correctamente montada na armação estereotáxica quando a cabeça é rígido e não pode ser movida de lado a lado, mas pode facilmente rodar para cima e para baixo. </li><li> Delicadamente, coloque ofocinho de rato na barra de nariz / dente montagem certificando-se que os incisivos estão descansando suavemente, mas de forma segura dentro da abertura da lâmina da barra nariz / dente. </li><li> Usando um bisturi estéril, fazer uma incisão na linha média a partir de meados dos olhos para o meio das orelhas. Certifique-se que o bisturi é ser realizada em um ângulo de 45 ° e aplicar pressão suficiente para cortar através da fáscia subjacente, mas não através do crânio como que vai causar sangramento excessivo. </li><li> Use cotonetes para separar a fáscia e expor o crânio. Crânio marcos bregma e lambda deve ser claramente visível (Figura 1A). Assegure-se que o animal se encontra na posição crânio plana, ajustando a barra de nariz / dente de tal modo que bregma e lambda são marcos na mesma posição do dorso-ventral (DV) (+ 0,1 mm). </li><li> Aplicar uma pequena quantidade de soro fisiológico estéril para a área exposta e usar cotonetes para limpar suavemente o crânio. Então espere 2-3 min para o crânio completamente o ar secoantes de prosseguir. </li><li> Montar uma agulha no braço estereotáxico esquerda para medir a posição de DV bregma e lambda. O posicionamento DV destes dois pontos de referência deve estar dentro de 0,1 milímetros um do outro. Se não, a barra de nariz da estrutura estereotáxica pode ser ajustado para cima e para baixo para alcançar este objectivo. </li><li> Posicione a agulha no bregma para gravar seu ântero-posterior (AP), lateral (LAT) e medições dorsoventral (DV). Verifique se a agulha toca apenas o crânio e não penetrá-la. </li><li> Use um mouse atlas do cérebro, tais como &quot;O Rato do cérebro em estereotáxica Coordenadas&quot; 1, para determinar as coordenadas para as estruturas-alvo: medial via perfurante (MPP) no feixe angular e giro denteado (DG) do hipocampo, em relação a lambda e bregma, respectivamente (ver também Tabela 1). Em seguida, use uma caneta de ponta fina ou lápis para marcar esses pontos no crânio. </li><li> Além disso, marcar mais dois pontos no lado contralateral do crânio. Estes pontos which servirá de terra (GND) e de referência (REF) deve ser cerca de 3 mm a partir da linha média e posicionada longitudinalmente em relação umas às outras (Figura 1A, também a Tabela 1). </li><li> Retire o marcador agulha do braço estereotáxico esquerda e substituí-lo por uma broca dental elétrico equipado com um monte estereotáxica. Posicione a broca sobre cada ponto marcado e fazer pequenos furos rebarba de aproximadamente 0,5 mm de diâmetro. Quando a perfuração, use um movimento para cima e para baixo repetitivo e verificar com freqüência se a broca penetrou no crânio para expor a superfície do cérebro. </li><li> Delicadamente, mas com firmeza, dirigir um eletrodo parafuso (# 0-80 1/8 em parafusos de aço inoxidável, com fenda cabeça oval) em cada um dos buracos contralateral (GND e REF) de tal forma que apenas tocar a superfície cortical, sem penetrá-lo (Figura 1A ). Estes dois eletrodos parafuso servir como base e referência. </li><li> Mount estimulantes e gravação eletrodos em electrode titulares nos braços estereotáxica esquerdo e direito, respectivamente. </li><li> Conecte os terminais do eletrodo estimulando a um estimulador eletrofisiológico com isolamento atual e do terminal de eletrodo de registro a um amplificador diferencial eletrofisiológico (ganho = 1.000, filtro de banda = 1 Hz-3 kHz) e, em seguida, para um osciloscópio digital para inspeção visual de respostas evocadas. Além disso, conecte GND e terminais do eletrodo REF para o amplificador diferencial. </li><li> Suavemente e abaixe lentamente tanto estimulante e eletrodos de registro em incrementos de 0,5 mm enquanto monitorando visualmente a resposta evocada a um choque de estímulo 600-800 uA. Continue a baixar cada um dos eléctrodos, até que eles atinjam a sua posição respectiva DV-alvo e um sinal estereotipado é observado no osciloscópio (Figura 1B). </li><li> Depois disso, use cimento acrílico dental para fazer uma tampa para manter os terminais do eletrodo no lugar, qualquer cimento odontológico que toca a pele deve ser apagadoimediatamente. Uma vez que o cimento dentário é completamente curado transferir o animal a partir do quadro estereotáxico para uma gaiola limpa roedor. Use uma lâmpada de aquecimento ou uma almofada para manter a temperatura do núcleo. </li><li> Monitorar o animal a cada hora até que ele recupere a consciência. Uma injecção de flunixina pode ser administrado como um analgésico. </li></ol> 2. LTP Indução <ol><li> Permitir que o animal de 5-7 dias para se recuperar da cirurgia. Colocar o animal no meio de gravação que consiste de uma gaiola de Faraday (122 centímetros x 43 cm x 43 cm) equipadas com material de isolamento acústico e de um comutador rotativo 5-canal que liga o eléctrodo leva à configuração estimulante / gravação. </li><li> Permitir que o animal se adapte para 1-2 horas no ambiente de gravação antes de conectar os eletrodos para os instrumentos de estímulo e de gravação (consulte a etapa 1.17). </li><li> Defina os controles de estimulador para a saída de 400 uA e registrar a amplitude de uma média de 10 respostas evocadas certificando-them pelo menos 10 seg decorrer entre estímulos. Usar o método mostrado na Figura 1C para quantificar a resposta evocada. Repita este procedimento para 600, 800, 1.000, 1.200, e 1.400 uA. </li><li> Construir uma curva de entrada / saída traçando a amplitude média da resposta evocada versus intensidade de estímulo. A partir deste gráfico determinar a intensidade de estímulo que corresponde a 50% da amplitude máxima de medida. Utilizar a intensidade de 50% para o restante da experiência. </li><li> Em seguida, utilizando a intensidade do estímulo de 50%, se obter uma linha de base através da gravação da amplitude média de 5 respostas evocadas a cada minuto durante 15 min. Mais uma vez certifique-se de que pelo menos 10 seg decorrer entre estímulos. </li><li> Posteriormente entregar a estimulação tetânica composto por 10 rajadas de 10 pulsos entregues a 400 Hz com uma taxa de disparo de 5 Hz para a via perfurante medial. Monitorar o animal de perto para sinais de apreensão, incluindo shakes cachorro molhado. Se o animal tem uma convulsão a experiment deve ser encerrado e todos os dados de que animal deve ser excluída dos resultados do estudo. </li><li> Em seguida, continuar a gravar a amplitude média de 5 respostas evocadas a cada minuto por 30 min posttetanization. Depois disso, comparar esta amplitude à amplitude da linha de base obtido no passo 2.5 calculando a percentagem de alteração a partir da linha de base (Fig. 2). </li><li> Após a conclusão de experimentos, o animal é sacrificado por meio de inalação de isoflurano, um método que é consistente com as orientações sobre eutanásia da American Veterinary Medical Association. </li></ol>

<ol><li>Paxinos, G., Franklin, K. B. J. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aPaxinos%2C+G+%22The+mouse+brain+in+stereotaxic+coordinates%22">The mouse brain in stereotaxic coordinates</a>. , Compact 2nd edn, Elsevier Academic Press. (2004).</li>
<li>Bliss, T. V. P., Lomo, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Long-lasting+potentiation+of+synaptic+transmission+in+the+dentate+area+of+the+anesthetized+rabbit+following+stimulation+of+the+perforant+path%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Physiol%22%5BJournal%5D)">Long-lasting potentiation of synaptic transmission in the dentate area of the anesthetized rabbit following stimulation of the perforant path.</a> J. Physiol. 232, 331-356 (1973).</li>
<li>Blaise, J. H., Bronzino, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+stimulus+frequency+and+age+on+bidirectional+synaptic+plasticity+in+the+dentate+gyrus+of+freely+moving+rats%5BTitle%5D)+AND+%22Exp.+Neurol%22%5BJournal%5D)">Effects of stimulus frequency and age on bidirectional synaptic plasticity in the dentate gyrus of freely moving rats.</a> Exp. Neurol. 182, 497-506 (2003).</li>
<li>Blaise, J. H., Koranda, J. L., Chow, U., Haines, K. E., Dorward, E. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neonatal+isolation+stress+alters+bidirectional+long-term+synaptic+plasticity+in+amygdalo-hippocampal+synapses+in+freely+behaving+adult+rats%5BTitle%5D)+AND+%22Brain+Res%22%5BJournal%5D)">Neonatal isolation stress alters bidirectional long-term synaptic plasticity in amygdalo-hippocampal synapses in freely behaving adult rats.</a> Brain Res. 1193, 25-33 (2008).</li>
<li>Koranda, J. L., Masino, S. A., Blaise, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bidirectional+synaptic+plasticity+in+the+dentate+gyrus+of+the+awake+freely+behaving+mouse%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci.+Methods%22%5BJournal%5D)">Bidirectional synaptic plasticity in the dentate gyrus of the awake freely behaving mouse.</a> J. Neurosci. Methods. 167, 160-166 (2008).</li>
<li>Cooke, S. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Autophosphorylation+of+alphaCaMKII+is+not+a+general+requirement+for+NMDA+receptor-dependent+LTP+in+the+adult+mouse%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Physiol%22%5BJournal%5D)">Autophosphorylation of alphaCaMKII is not a general requirement for NMDA receptor-dependent LTP in the adult mouse.</a> J. Physiol. 574, 805-818 (2006).</li>
<li>Davis, S., Bliss, T. V., Dutrieux, G., Laroche, S., Errington, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Induction+and+duration+of+long-term+potentiation+in+the+hippocampus+of+the+freely+moving+mouse%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci.+Methods%22%5BJournal%5D)">Induction and duration of long-term potentiation in the hippocampus of the freely moving mouse.</a> J. Neurosci. Methods. 75, 75-80 (1997).</li>
<li>Jones, M. W., Peckham, H. M., Errington, M. L., Bliss, T. V., Routtenberg, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synaptic+plasticity+in+the+hippocampus+of+awake+C57BL%2F6+and+DBA%2F2+mice%3A+interstrain+differences+and+parallels+with+behavior%5BTitle%5D)+AND+%22Hippocampus%22%5BJournal%5D)">Synaptic plasticity in the hippocampus of awake C57BL/6 and DBA/2 mice: interstrain differences and parallels with behavior.</a> Hippocampus. 11, 391-396 (2001).</li>
<li>Zhang, T. A., Tang, J., Pidoplichko, V. I., Dani, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Addictive+nicotine+alters+local+circuit+inhibition+during+the+induction+of+in+vivo+hippocampal+synaptic+potentiation%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Addictive nicotine alters local circuit inhibition during the induction of in vivo hippocampal synaptic potentiation.</a> J. Neurosci. 30, 6443-6453 (2010).</li>
<li>Tang, J., Dani, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dopamine+enables+in+vivo+synaptic+plasticity+associated+with+the+addictive+drug+nicotine%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Dopamine enables in vivo synaptic plasticity associated with the addictive drug nicotine.</a> Neuron. 63, 673-682 (2009).</li>
</ol>

Autores têm nada a revelar.

Neste protocolo, demonstramos um método simples e confiável para o estudo de LTP em DG em ratos comportando livremente. Enquanto muitos estudos de LTP em ratos acordados foram realizados 3,4, muito poucos têm sido realizados em ratos acordados, principalmente devido à complexidade técnica colocado pela imobiliária craniana limitada em ratos eo peso do headstages eletrodo em relação ao peso médio de camundongos 5. Os poucos estudos que demonstraram LTP na DG em comportar livremente camundongos utili...

O desenvolvimento da tecnologia para manipular genes produziu modelos de ratos transgênicos e knockout de quase todas as doenças neurodegenerativas e neurológicos. Isso exigiu a tradução de técnicas de pesquisa eletrofisiológicos anteriormente utilizados em espécies de roedores maiores para o modelo animal mouse. Uma tal técnica de investigação neurofisiológicos é o uso de potenciação de longo prazo (LTP), para testar a eficácia das conexões sinápticas nas redes neuronais envolvidas em várias doenças neuropatológicas. Este protocolo descreve técnicas para a investigação eletrofisiológica confiável de LTP em comportar livremente ratos. A vantagem deste protocolo sobre os outros é que é simples e fácil de implementar, é também um pouco menos dispendioso, uma vez que não requer nem a utilização de sistemas de micro-unidade caros controlados por computador nem transistor de efeito de campo headstages, e, para o nosso conhecimento, é o primeiro protocolo de vídeo de registros eletrofisiológicos crônicas to estudo LTP em comportar livremente ratos. Para este fim, descrevemos no artigo metodologias simples para estudar a potenciação a longo prazo em murganhos comportando livremente. Estas metodologias podem ser facilmente traduzido para modelos transgênicos e knockout rato de distúrbios neuropatológicos.

<table><tbody><tr><td>Cetamina (100 mg/ml)</td><td>Henry Schein</td><td>10177</td><td></td></tr><tr><td>Xilazina (20 mg/ml)</td><td>Henry Schein</td><td>33197</td><td></td></tr><tr><td>Acepromazina (10 mg/ml)</td><td>Henry Schein</td><td>2177</td><td></td></tr><tr><td>Pó acrílico dental</td><td>Lang Dental Manufacturing Co.</td><td>1330CLR</td><td></td></tr><tr><td>Dental acrílico líquido</td><td>Lang Dental Manufacturing Co.</td><td>1306CLR</td><td></td></tr><tr><td>Fio de tungstênio (0,127 mm)</td><td>World Precision Instruments</td><td>TGW0515</td><td></td></tr><tr><td>Tubo hipodérmico de aço inoxidável (0,286 mm)</td><td>World Precision Instruments</td><td>832400</td><td></td></tr><tr><td>Flunixin (50 mg/ml)</td><td>Henry Schein</td><td>14165</td><td></td></tr><tr><td>Epoxilyte</td><td>Superior Essex</td><td>EP 6001-M</td><td></td></tr><tr><td>Inserção de fio de aço inoxidável (0,2 mm)</td><td>Mundo Precision Instruments</td><td>792900</td><td></td></tr><tr><td>Aparelho de armação estereotáxica</td><td>Kopf Instruments</td><td>Modelo 902</td><td></td></tr><tr><td>Ear cuffs (fones de ouvido)</td><td>Kopf Instruments</td><td>Modelo 921</td><td></td></tr><tr><td>Estimulador eletrofisiológico</td><td>Astro-Med, Inc.</td><td>Osciloscópio digital S88</td><td></td></tr><tr><td></td><td>B K Precision Corp.</td><td>2542</td><td></td></tr><tr><td>Unidade de isolamento atual</td><td>Astro-Med, Inc.</td><td>Amplificador diferencial PSIU-6</td><td></td></tr><tr><td></td><td>World Precision Instruments, Inc.</td><td>DAM-50</td><td></td></tr><tr><td>Comutador</td><td>Plásticos Uma</td> Broca Dental <td>SLC6</td><td></td></tr><tr><td></td><td>Stoelting</td><td>58650</td><td></td></tr></tbody></table>

potenciação de longo prazo da via perfurante-giro denteado synapse em livremente comportando ratos

Long-term Potentiation of Perforant Pathway-dentate Gyrus Synapse in Freely Behaving Mice

Estudos da potenciação de longa duração de eficácia sináptica, um fenômeno sináptica dependente de atividade que tem propriedades que o tornam atraente como um potencial mecanismo celular subjacente aprendizagem e armazenamento de informações, têm sido muito utilizados para elucidar a fisiologia de vários circuitos neuronais no hipocampo, amígdala e outras estruturas límbicas e corticais. Com isto em mente, os modelos de camundongos transgênicos de doenças neurológicas representam plataformas úteis para conduzir potenciação de longa duração (LTP) estudos para desenvolver uma maior compreensão do papel dos genes na comunicação sináptica normal e anormal em redes neuronais envolvidos na aprendizagem, emoção e informação processamento. Este artigo descreve as metodologias para indução de forma confiável LTP no rato comportando livremente. Estas metodologias podem ser utilizadas em estudos sobre transgênicos e knockout comportando livremente modelos do rato de doenças neurodegenerativas.

A Tabela 1 mostra as coordenadas para DG e MPP, usado neste protocolo Figura 1A apresenta as marcações para as estruturas alvo no crânio;.. Também são indicados a localização da terra e eletrodos de referência Figura 1B ilustra representante resposta evocada traça tanto pre- e posttetanization no mesmo animal. Note-se que a resposta evocada posttetanization é maior do que a resposta pretetanization que é indicativa de indução de LTP 2. Figura 1C</stro...

Modelos de camundongos transgênicos e knockout de doenças neurológicas são úteis para estudar o papel dos genes em neurofisiologia normal e anormal. Este artigo descreve metodologias que podem ser usados ​​para estudar a potenciação a longo prazo, um mecanismo celular que pode ser a base de aprendizagem e de memória, em transgénicos e knockout livremente comportando modelos de rato de neuropatologia.

Potenciação de longo prazo da Via Perfurante-giro denteado Synapse em Livremente Comportando Ratos

Studies of long-term potentiation of synaptic efficacy, an activity-dependent synaptic phenomenon having properties that make it attractive as a potential ...

O objetivo geral deste procedimento é demonstrar a gravação de PPF em um modelo de camundongo livre para se movimentar. Isso é realizado primeiramente por meio da implantação cirúrgica de microeletrodos na via perforante e no giro denteado. O segundo passo consiste em registrar as respostas evocadas de linha de base no giro denteado em resposta à estimulação por pulso único da via perforante.A seguir, a PPF é induzida após um protocolo de estimulação potencializadora. O passo final é registrar as respostas pós-sinápticas e compará-las aos valores basais. Por fim, aumento na amplitude do potencial de ação populacional.Medidas da resposta evocada são utilizadas para demonstrar a indução sucessiva de PTL. A principal vantagem dessa técnica em relação a métodos existentes, como o preparo de fatias in vitro, é que o modelo de camundongo livre para se movimentar fornece a plataforma fisiologicamente mais relevante para testar os efeitos de fármacos neurofarmacológicos ou de manipulações genéticas em modelos animais de doenças neurológicas humanas. Inicie este procedimento raspando os pelos na parte superior da cabeça do camundongo, da região logo acima dos olhos até um pouco à frente das orelhas, tomando cuidado para não raspar os bigodes, pois eles fazem parte do sistema sensorial somatossensorial do camundongo.Em seguida, limpe a área depilada primeiro com álcool isopropílico, depois com Betadine, e então aplique uma pequena quantidade de óleo mineral com cotonetes sobre os olhos para evitar que sequem. Transfira o camundongo para o aparelho estereotáxico. Utilize presilhas auriculares para ratos filhotes em vez das barras auriculares comuns para fixar a cabeça do animal, colocando primeiro a orelha esquerda na presilha auricular esquerda.Em seguida, posicione suavemente a orelha direita sobre a braçadeira direita, apoiando a cabeça do animal com uma das mãos e avançando a braçadeira com a outra mão. Depois disso, coloque uma manta térmica sob o corpo do animal e ajuste-a para 86 graus Fahrenheit para manter a temperatura corporal. Em seguida, verifique a rigidez bilateral tentando mover a cabeça de um lado para o outro; o animal está corretamente posicionado no estereotáxico quando a cabeça estiver rígida e não puder ser movida lateralmente, mas puder girar facilmente para cima e para baixo.Posteriormente, apoie o focinho do camundongo sobre o conjunto da barra dentária e certifique-se de que os incisivos estejam repousando suave, porém firmemente, dentro da abertura dentária da barra. Usando um bisturi estéril, faça uma incisão mediana começando do ponto médio entre os olhos até o centro das orelhas. Certifique-se de que o bisturi seja mantido em um ângulo de 45 graus e que pressão suficiente seja aplicada para cortar a fáscia subjacente, mas sem atingir o crânio, pois isso causaria sangramento excessivo.Em seguida, use cotonetes para separar a fáscia e hemostatos curvos para expor o crânio. Os pontos de referência do crânio, bgma e lambda, devem estar claramente visíveis. Certifique-se de que o crânio do animal esteja nivelado ajustando a barra dental de modo que bgma e lambda estejam na mesma posição DV.Em seguida, limpe o crânio exposto com uma pequena quantidade de solução salina estéril e aguarde dois a três minutos para que o crânio seque completamente ao ar antes de prosseguir. Depois disso, acople uma agulha ao braço estereotáxico esquerdo. Para medir as posições DV de bgma e lambda.Certifique-se de que estejam dentro de 0,1 milímetro um do outro. Caso contrário, ajuste a barra nasal do estereotáxico para cima e para baixo para alcançar essa precisão. Em seguida, posicione a agulha sobre o B bgma e registre suas medidas AP L-A-T-N-D-V.Certifique-se de que a agulha toque levemente o crânio e não o penetre. Utilize um atlas do cérebro de camundongo para determinar as coordenadas das estruturas-alvo em relação a lambda e bgma. No nosso caso, são a via medial perent no feixe angular e o giro denteado do hipocampo.Em seguida, use uma caneta ou lápis de ponta fina para marcar esses pontos no crânio. Depois, marque mais dois pontos no lado contralateral do crânio. Esses pontos, que servirão como referência de terra, devem estar a cerca de três milímetros da linha média e posicionados longitudinalmente um em relação ao outro.Em seguida, remova o marcador de agulha do braço estereotáxico esquerdo e substitua-o por uma broca dentária elétrica equipada com suporte estereotáxico. Posicione a broca sobre cada ponto marcado e faça pequenas cavidades de perfuração com aproximadamente 0,5 milímetro de diâmetro. Durante a perfuração, utilize um movimento repetitivo de subida e descida, verificando frequentemente se a broca já penetrou no crânio para expor suavemente, mas firmemente, a superfície cerebral; em seguida, insira com firmeza um eletrodo de parafuso em cada um dos orifícios contralaterais, de modo que toquem apenas a superfície cortical sem penetrá-la.Esses dois eletrodos parafuso servem como terra e referência. Em seguida, monte os eletrodos de estimulação e gravação nos suportes de eletrodos nos braços estereotáxicos esquerdo e direito, respectivamente. Depois, conecte os terminais do eletrodo de estimulação a um estimulador eletrofisiológico com isolamento de corrente e o terminal do eletrodo de gravação a um amplificador diferencial eletrofisiológico, e então a um osciloscópio digital para inspeção visual das respostas evocadas.Em seguida, conecte os terminais do eletrodo de terra e de referência ao amplificador diferencial e abaixe suave e lentamente o eletrodo estimulante até o trajeto medial perran e o eletrodo de gravação até o giro denteado em incrementos de 0,5 milímetro, utilizando o osciloscópio para monitorar a resposta evocada a um estímulo de pulso único. A cada descida incremental dos eletrodos, continue abaixando-os até que atinjam suas respectivas posições dorsoventrais (DV) alvo e um sinal típico seja observado no osciloscópio posteriormente. Utilize cimento acrílico dentário para confeccionar uma capa que mantenha os terminais dos eletrodos fixos em posição.Qualquer cimento dental que toque a pele deve ser removido imediatamente. Após o cimento dental ter curado completamente, transfira o animal do estereotáxico para uma gaiola limpa para roedores e utilize uma lâmpada de aquecimento ou um tapete aquecido para manter a temperatura corporal central. Monitore o animal a cada hora até que ele recupere a consciência.Pode-se administrar uma injeção de fuxin como analgésico após o animal ter se recuperado da cirurgia por cinco a sete dias. Coloque-o no ambiente de gravação, consistindo de uma gaiola de Faraday equipada com material insonorizante e um comutador rotativo de cinco canais conectado ao eletrodo que conduz ao conjunto de estimulação e gravação. Permita que o animal se aclimate por uma a duas horas no ambiente de gravação antes de conectar os eletrodos aos instrumentos de estimulação e gravação.Em seguida, ajuste os controles do estimulador para emitir 400 microampères. Registre a amplitude de uma média de 10 respostas evocadas, com pelo menos 10 segundos entre cada estímulo, e repita este procedimento para 600, 800, 1.000, 1.200 e 1.400 microampères. Em seguida, utilize o método mostrado nesta figura para quantificar a amplitude das respostas evocadas.Construa uma curva entrada-saída plotando a amplitude média da resposta evocada versus a intensidade do estímulo. Em seguida, determine a intensidade do estímulo que corresponde a 50% da amplitude máxima medida e utilize essa intensidade para o restante do experimento. Agora, obtenha uma linha de base registrando a amplitude média de cinco respostas evocadas a cada minuto durante 15 minutos, com pelo menos 10 segundos transcorridos entre os estímulos.Em seguida, aplique a estimulação Titanic na via medial perent. Enquanto isso, monitore atentamente o animal em busca de sinais de convulsão, incluindo tremores semelhantes aos de um cachorro molhado. Se o animal apresentar convulsão, o experimento deve ser interrompido e todos os dados desse animal devem ser excluídos dos resultados do estudo.Em seguida, continue registrando a amplitude média de cinco respostas evocadas a cada minuto durante 30 minutos. Após a potenciação, compare essa amplitude com a amplitude de linha de base obtida anteriormente, calculando a variação percentual em relação à linha de base. É mostrada aqui a ilustração esquemática da localização relativa dos eletrodos sobre o crânio do camundongo, e esses são os traçados típicos das respostas evocadas tanto antes quanto após a potenciação.Esta figura mostra a indução da PTL na sinapse do giro denteado do caminho periférico medial de um camundongo livremente comportamental. Uma vez dominada, esta técnica pode ser realizada em duas horas, se for executada corretamente. Ao tentar este procedimento, é importante lembrar-se de verificar frequentemente o animal para garantir que a profundidade da anestesia seja mantida.Após assistir a este vídeo, você deverá ter uma boa compreensão de como realizar cirurgia estereotáxica para implantar cronicamente microeletrodos, que são usados posteriormente para registrar a PPL em um camundongo livre para se movimentar.

long-term-potentiation-perforant-pathway-dentate-gyrus-synapse-freely

Research

JoVE Journal

Behavior

Comportamento

Este artigo descreve procedimentos para preparar fatias do hipocampo de ratos e camundongos transgênicos para o estudo de alterações sinápticas do cérebro associadas ao envelhecimento e relacionadas com a idade as doenças neurodegenerativas, como doença de Alzheimer.

Preparação de fatias do hipocampo aguda de ratos e camundongos transgênicos para o Estudo das Alterações Synaptic durante o envelhecimento e amilóide Patologia

Fonte: Zhao, Z. et al. Um método invasivo para a ativação do giro dentado do camundongo por estimulação de alta frequência. J. Vis. Exp. (2018)Este vídeo demonstra o protocolo para fornecer estimulação cerebral profunda de alta frequência a um giro dentado do hipocampo de camundongo, detalhando seus efeitos na ativação neuronal, plasticidade sináptica e neurogênese.

Estimulação de alta frequência para aumentar a ativação neuronal e a neurogênese no giro dentado de camundongo

Este trabalho apresenta uma metodologia completa para se preparar e...

Melhoria da preparação e preservação de fatias do hipocampo de camundongos para uma gravação muito estável e reprodutível de potenciação de longa duração

A técnica de braçadeira do remendo de fatia é um método eficaz para a análise de aprendizagem induzido por alterações nas propriedades intrínsecas e plasticidade de sinapses excitatórias ou inibitórias.

Fatia Patch Clamp técnica para análise de plasticidade induzida pela aprendizagem

Este protocolo mostra como configurar um método confiável de HFS em camundongos. Neurônios em todo giro denteado do hipocampo são estimulados eletricamente por HFS diretamente e indiretamente em vivo. Atividade neuronal e sinalização molecular são examinados por c-fos e coloração imunofluorescente Notch1, respectivamente; neurogênese é quantificada pela bromodeoxyuridine para ensaio de rotulagem.

Um método invasivo para a ativação do giro denteado do Mouse pela estimulação de alta frequência

Este método descreve uma preparação crônica que permite o acesso óptico ao hipocampo de camundongos vivos. Esta preparação pode ser utilizada para realizar imagens ópticas longitudinais de plasticidade estrutural neuronal e plasticidade celular evocada por atividade ao longo de um período de várias semanas.

Imagem latente longitudinal do dois-fotão do hipocampal dorsal CA1 em ratos vivos

Utilizamos eletrodos de gravação e estimulação em fatias de cérebro hipocampal longitudinal e eletrodos de gravação e estimulação longitudinalmente posicionados no hipocampo dorsal in vivo para evocar potenciais pós-sinápticos extracelulares e demonstrar plasticidade sináptica de longo prazo ao longo do CA1 interlamelar longitudinal.

Investigando a plasticidade sináptica de longo prazo no hipocampo interlamelar CA1 por gravação de campo eletrofisiológico

Este artigo tem como objetivo descrever um protocolo sistemático para obter fatias cerebrais hipocampais horizontais em camundongos. O objetivo desta metodologia é preservar a integridade das vias de fibra hipocampal, como o caminho perfurante e o trato de fibra de musgo para avaliar processos neurológicos relacionados ao giro dento.

Fatias hipocampais horizontais do cérebro do rato

Aqui, descrevemos um protocolo para induzir a plasticidade de longo prazo da excitabilidade intrínseca neuronal em neurônios de retransmissão do núcleo geniculado lateral dorsal mantido em fatias cerebrais ex vivo.

Induzindo plasticidade de longo prazo da excitabilidade neuronal intrínseca em neurônios do núcleo geniculado lateral dorsal

Atividade locomotora (LMA) é uma medida simples e de fácil execução de comportamento em camundongos. O acoplamento do software de rastreamento de vídeo (VTS) e LMA permite a melhoria da especificidade e sensibilidade, especialmente quando comparado com o manual, o método de análise cruzando a linha de LMA. Além disso VTS permite o acompanhamento a longo prazo de rato LMA.

Rato de curto e longo prazo da atividade locomotora analisados ​​pelo software Rastreamento Vídeo

Aprenda a registrar a potenciação de longo prazo (LTP) em camundongos livremente comportantes usando eletrodos implantados na via perfurante e no giro denteado. Este método avança a pesquisa em neurofisiologia e doenças neurológicas.

Potenciação de longo prazo da Via Perfurante-giro denteado Synapse em Livremente Comportando Ratos

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