Name: Alta resolução Monte Whole In Situ Hibridização dentro embriões Zebrafish para estudar a expressão gênica e função (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-10-19T18:30:00.000+00:00
Duration: 10 min 6 s
Description: Aprenda hibridização in situ em montagem inteira de alta resolução em embriões de zebrafish para analisar a expressão gênica espacial e temporal. Este método melhora a detecção de transcritos de baixa abundância com menor ruído de fundo.

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<ol><li>Lieschke, G. J., Currie, P. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Animal+models+of+human+disease%3A+zebrafish+swim+into+view%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Rev.+Genet%22%5BJournal%5D)">Animal models of human disease: zebrafish swim into view.</a> Nat. Rev. Genet. 8, 353-367 (2007).</li>
<li>Wolman, M., Granato, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Behavioral+genetics+in+larval+zebrafish%3A+learning+from+the+young%5BTitle%5D)+AND+%22Dev.+Neurobiol%22%5BJournal%5D)">Behavioral genetics in larval zebrafish: learning from the young.</a> Dev. Neurobiol. 72, 366-372 (2010).</li>
<li>Lawson, N. D., Wolfe, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Forward+and+reverse+genetic+approaches+for+the+analysis+of+vertebrate+development+in+the+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Dev.+Cell%22%5BJournal%5D)">Forward and reverse genetic approaches for the analysis of vertebrate development in the zebrafish.</a> Dev. Cell. 21, 48-64 (2011).</li>
<li>Arkhipova, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+and+regulation+of+the+hb9%2Fmnx1+beta-cell+progenitor+specific+enhancer+in+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Dev.+Biol%22%5BJournal%5D)">Characterization and regulation of the hb9/mnx1 beta-cell progenitor specific enhancer in zebrafish.</a> Dev. Biol. 365, 290-302 (2012).</li>
<li>Kimmel, C. B., Ballard, W. W., Kimmel, S. R., Ullmann, B., Schilling, T. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stages+of+embryonic+development+of+the+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Dev.+Dyn%22%5BJournal%5D)">Stages of embryonic development of the zebrafish.</a> Dev. Dyn. 203, 253-310 (1995).</li>
<li>Chitramuthu, B. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+cloning+and+embryonic+expression+of+zebrafish+PCSK5+co-orthologues%3A+functional+assessment+during+lateral+line+development%5BTitle%5D)+AND+%22Dev.+Dyn%22%5BJournal%5D)">Molecular cloning and embryonic expression of zebrafish PCSK5 co-orthologues: functional assessment during lateral line development.</a> Dev. Dyn. 239, 2933-2946 (2010).</li>
<li>Liao, E. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((SCL%2FTal-1+transcription+factor+acts+downstream+of+cloche+to+specify+hematopoietic+and+vascular+progenitors+in+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+Dev%22%5BJournal%5D)">SCL/Tal-1 transcription factor acts downstream of cloche to specify hematopoietic and vascular progenitors in zebrafish.</a> Genes Dev. 12, 621-626 (1998).</li>
<li>Stainier, D. Y., Weinstein, B. M., Detrich, H. W. 3rd, Zon, L. I., Fishman, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cloche%2C+an+early+acting+zebrafish+gene%2C+is+required+by+both+the+endothelial+and+hematopoietic+lineages%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Cloche, an early acting zebrafish gene, is required by both the endothelial and hematopoietic lineages.</a> Development. 121, 3141-3150 (1995).</li>
<li>Detrich, H. W. 3rd, et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intraembryonic+hematopoietic+cell+migration+during+vertebrate+development%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Intraembryonic hematopoietic cell migration during vertebrate development.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 92, 10713-10717 (1995).</li>
<li>Liao, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+zebrafish+gene+cloche+acts+upstream+of+a+flk-1+homologue+to+regulate+endothelial+cell+differentiation%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">The zebrafish gene cloche acts upstream of a flk-1 homologue to regulate endothelial cell differentiation.</a> Development. , 124-381 (1997).</li>
<li>Krauss, S., Concordet, J. P., Ingham, P. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+functionally+conserved+homolog+of+the+Drosophila+segment+polarity+gene+hh+is+expressed+in+tissues+with+polarizing+activity+in+zebrafish+embryos%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">A functionally conserved homolog of the Drosophila segment polarity gene hh is expressed in tissues with polarizing activity in zebrafish embryos.</a> Cell. 75, 1431-1444 (1993).</li>
<li>Akimenko, M. A., Ekker, M., Wegner, J., Lin, W., Westerfield, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Combinatorial+expression+of+three+zebrafish+genes+related+to+distal-less%3A+part+of+a+homeobox+gene+code+for+the+head%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Combinatorial expression of three zebrafish genes related to distal-less: part of a homeobox gene code for the head.</a> J. Neurosci. 14, 3475-3486 (1994).</li>
<li>Alexander, J., Rothenberg, M., Henry, G. L., Stainier, D. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((casanova+plays+an+early+and+essential+role+in+endoderm+formation+in+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Dev.+Biol%22%5BJournal%5D)">casanova plays an early and essential role in endoderm formation in zebrafish.</a> Dev. Biol. 215, 343-357 (1999).</li>
<li>Milewski, W. M., Duguay, S. J., Chan, S. J., Steiner, D. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Conservation+of+PDX-1+structure%2C+function%2C+and+expression+in+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Endocrinology%22%5BJournal%5D)">Conservation of PDX-1 structure, function, and expression in zebrafish.</a> Endocrinology. 139, 1440-1449 (1998).</li>
<li>Argenton, F., Walker, M. D., Colombo, L., Bortolussi, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+characterization+of+the+trout+insulin+promoter%3A+implications+for+fish+as+a+favorable+model+of+pancreas+development%5BTitle%5D)+AND+%22FEBS+Lett%22%5BJournal%5D)">Functional characterization of the trout insulin promoter: implications for fish as a favorable model of pancreas development.</a> FEBS Lett. 407, 191-196 (1997).</li>
<li>Biemar, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pancreas+development+in+zebrafish%3A+early+dispersed+appearance+of+endocrine+hormone+expressing+cells+and+their+convergence+to+form+the+definitive+islet%5BTitle%5D)+AND+%22Dev.+Biol%22%5BJournal%5D)">Pancreas development in zebrafish: early dispersed appearance of endocrine hormone expressing cells and their convergence to form the definitive islet.</a> Dev. Biol. 230, 189-203 (2001).</li>
<li>Thisse, C., Thisse, B., Schilling, T. F., Postlethwait, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structure+of+the+zebrafish+snail1+gene+and+its+expression+in+wild-type%2C+spadetail+and+no+tail+mutant+embryos%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Structure of the zebrafish snail1 gene and its expression in wild-type, spadetail and no tail mutant embryos.</a> Development. 119, 1203-1215 (1993).</li>
<li>Cadieux, B., Chitramuthu, B. P., Baranowski, D., Bennett, H. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+zebrafish+progranulin+gene+family+and+antisense+transcripts%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Genomics%22%5BJournal%5D)">The zebrafish progranulin gene family and antisense transcripts.</a> BMC Genomics. 6, 156(2005).</li>
<li>Chitramuthu, B. P., Bennett, H. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Use+of+zebrafish+and+knockdown+technology+to+define+proprotein+convertase+activity%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">Use of zebrafish and knockdown technology to define proprotein convertase activity.</a> Methods Mol. Biol. 768, 273-296 (2011).</li>
<li>Thisse, C., Thisse, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High+resolution+in+situ+hybridization+on+whole-mount+zebrafish+embryo%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Protoc%22%5BJournal%5D)">High resolution in situ hybridization on whole-mount zebrafish embryo.</a> Nat. Protoc. 3, 59-69 (2008).</li>
</ol>

Os autores declaram que não têm interesses financeiros concorrentes.

Nós desenvolvemos métodos melhorados para visualizar o RNA com alta resolução. A nos procedimentos de hibridização in situ são realizados através de simples cestos feitos sob medida com fundo poroso (Figura 1). Os embriões são processadas usando soluções sem RNase em placas de 6 cavidades, à temperatura ambiente e sob condições estéreis. Segregar embriões cestas são feitas de diferentes tubos coloridos Eppendorf. Cestas com ou sem um aro são utilizados para...

O peixe-zebra (Danio rerio) tem emergido como um poderoso modelo animal para o estudo do desenvolvimento dos vertebrados, a doença, o comportamento e no rastreio de drogas 1-3. Embriões de peixe-zebra pode ser obtido em grandes quantidades a partir de um único cruzamento. Fertilização e desenvolvimento ocorre ex utero e os embriões opticamente claras desenvolver rapidamente. Eventos críticos de desenvolvimento ocorrem durante as primeiras 48 horas pós-fertilização (hpf). Isto inclui o aparecimento de órgão primórdios e o início de citodiferenciação. Knockdown ou sobre-expressão de proteínas pode ser alcançada através da microinjecção de embriões com anti-sentido morfolino (MO), os oligonucleótidos ou ARNm, respectivamente, no estádio de uma ou duas células (0,75 HPF). O desejo de embriões zebrafish facilita o estudo da expressão espaço-temporal de genes específicos de interesse. Aplicação da técnica DESEJO seguindo microinjeção de embriões com mRNA ou MO para o excesso de express ou os níveis de proteína específicas knockdown revela regulação diferencial de outros genes. As mudanças nos padrões de expressão de genes pode ser correlacionada com as alterações fenotípicas e revelar a função de genes alvo durante a organogénese precoce. Uma vez que as sondas podem ser preparadas e armazenadas de antemão, a técnica pode ser aplicada a ISH para revelar os padrões de expressão de genes para pelo menos 20 genes de cada vez utilizando placas de seis poços e fizeram cestas personalizadas.

<table><tbody>Kit de clonagem <tr><td>Taq Polymerase</td><td>Invitrogen</td><td>10342053</td><td></td></tr><tr><td>TopoTA - Promotor duplo pCRII-TOPO</td><td>Invitrogen</td><td>K4650-01</td><td></td></tr><tr><td>HQ Mini Kit de purificação de plasmídeo</td><td>Invitrogen</td><td>K2100-01</td><td></td></tr><tr><td>Agarose</td><td>Roche</td><td>11 685 660 001</td><td></td></tr><tr><td>Not1 e HindIII Enzimas de restrição</td><td>Invitrogen</td><td>15441-025, 15207-012</td><td></td></tr><tr><td>Tampão Saturado Fenol,</td><td>Invitrogen</td> ultrapuro <td>15513039</td><td>Armazenar a 4 °C. Olhos, pele e trato respiratório irritantes e suspeitos de serem cancerígenos. Deve-se ter cuidado durante o manuseio.</td></tr><tr><td>Clorofórmio</td><td>Fisher</td><td>C607-1</td><td>Tóxico e suspeito de ser cancerígeno. Trabalhe sob a coifa.</td></tr><tr><td>DNAse livre de RNase I</td><td>Roche</td><td>4716728001</td><td>Prepare pequenas alíquotas e armazene a -20 graus C.</td></tr><tr><td>Mistura de marcação de DIG-RNA com Sp6, T7 e T3 RNA polimerase</td><td>Roche</td><td>11277073910</td> Inibidor de <td></td></tr><tr><td>RNase</td><td>Roche</td><td>10777-019</td><td></td></tr><tr><td>3.0 M Acetato de sódio (pH 5.5)</td><td>Fisher</td><td>50-751-7355</td><td></td></tr><tr><td>100% Etanol</td><td>Álcoois</td><td></td><td></td>comerciais</tr><tr><td>Dietil Pirocarbonato (DEPC)</td><td>Sigma</td><td>40718-25ML</td><td>O DEPC é um irritante para os olhos, a pele e as vias respiratórias. Evite o contato com a pele e os olhos. Use óculos de segurança, luvas e máscara.</td></tr><tr><td>NaOH</td><td>Fisher</td><td>SS255-1</td><td></td></tr><tr><td>EDTA 0,5 M (pH 8,0)</td><td>Fisher</td><td>50-751-7404</td><td></td></tr><tr><td>Sistemas de Aquário de Sal Oceânico Instantâneo</td><td></td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>Fosfato Tampolado Salino (PBS)</td><td>Fisher</td><td>FL-03-0900</td><td></td></tr><tr><td>Paraformaldeído (PFA)</td><td>Sigma</td><td>P6148-1KG</td><td>Prepare e armazene a -20 graus; C em alíquotas de 40 ml para utilização posterior. O PFA é tóxico. Use óculos de segurança, luvas e máscara contra poeira.</td></tr><tr><td>Feniltiocarbomida (PTC)</td><td>Sigma</td><td>P7629-25G</td><td>PTC é altamente tóxico. Use óculos de segurança, luvas e máscara contra poeira.</td></tr><tr><td>Metanol</td><td>Fisher</td><td>A947-4</td><td></td></tr><tr><td>Dumont (Relojoeiro s) Padrão de pinça nº 5</td><td>Fine Science Tools</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Cluster de cultura de células de seis poços</td><td>Sarstedt</td><td>83.1839</td><td></td></tr><tr><td>Os cestos são feitos de malha de nylon e tubos Eppendorf</td><td>Preparação</td><td></td> interna <td>Para fazer os cestos, corte tubos Eppendorf (1,5 ml) com ou sem bordas para remover a extremidade cônica. Corte a malha de nylon em pequenos pedaços correspondentes ao tamanho de&nbsp; as extremidades cortadas dos tubos Eppendorf. Coloque os tubos com a malha de nylon cobrindo a extremidade cortada em um elétrico&nbsp; placa quente até que o tubo e a malha de nylon fiquem juntos (realize na capela de exaustão). Corte o excesso de malha dos cestos e guarde-os em 100% de metanol até o uso.</td></tr><tr><td>Monolaurato de polioxietilenoorbitano (Tween 20)</td> <td>Sigma</td><td>P1379-500ML</td><td></td></tr><tr><td>Proteinase K</td><td>Fermentas</td><td>EO0491</td><td></td></tr><tr><td>Anidrido acético</td><td>Sigma</td><td>242845</td><td></td></tr><tr><td>Trietanolamina</td><td>Sigma</td><td>90279-100ML</td><td></td></tr><tr><td>Formamida, grau de pureza alta</td><td>Sigma</td><td>F9037</td><td></td></tr><tr><td>AG501-X8 Resina</td><td>Bio Rad</td><td>142-6424</td><td></td></tr><tr><td>ácido cítrico monohidratado</td><td>Sigma</td><td>C0706-500G</td><td></td></tr><tr><td>sal de heparina sódica</td><td>Sigma</td><td>H3393-25KU</td><td></td></tr><tr><td>tampão de citrato de sódio salino (SSC)</td> <td>Sigma</td><td>S6639</td><td></td></tr><tr><td>tRNA de levedura de padeiro tipo X</td><td>Sigma</td><td>R5636-1ML</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Fisher</td><td>S640-500</td><td></td></tr><tr><td>Tris-HCl</td><td>Fisher</td><td>BP153-1</td><td></td></tr><tr><td>MgCl2</td><td>Fisher</td><td>S25403</td><td></td></tr><tr><td>Cloridrato de Levamisol</td><td>Sigma</td><td>31742</td><td></td></tr><tr><td>N,N-Dimetilformamida anidro (DMF)</td><td>Sigma</td><td>227056</td><td>Teratógeno irritante, tóxico, combustível e suspeito. Manuseie com trajes de segurança adequados, incluindo luvas e óculos de proteção.</td></tr><tr><td>5-Bromo-4-cloro-3-indolil fosfato (BCIP)</td><td>Sigma</td><td>N6639</td><td>Proteger esta solução da luz.</td></tr><tr><td>Nitroblue tetrazólio (NBT)</td><td>Sigma</td><td>840W</td><td>Proteja esta solução da luz.</td></tr><tr><td>Albumina de soro bovino, fração purificada V (BSA)</td> <td>Sigma</td><td>A8806</td><td></td></tr><tr><td>Fragmentos de Fab Anti-digoxigenina-AP de ovelha</td><td>Roche</td><td>1093274910</td><td></td></tr><tr><td>Glicerol</td><td>Sigma</td><td>G5516-500ML</td><td></td></tr><tr><td>Placas de cultura de células de 96 poços</td><td>Sarstedt</td><td>83.1835</td><td></td></tr><tr><td>Tg (mnx1: GFP) ml2 / Tg (hb9: GFP) ml2</td><td>ZIRC</td><td>Tg (mnx1: GFP) ml2</td><td></td></tr><tr><td>Sistemas de aquário oceânico instantâneo</td><td></td><td>N / A</td><td></td></tr></tbody></table>

alta resolução monte whole<em&gt; in situ</em&gt; hibridização dentro embriões zebrafish para estudar a expressão gênica e função

High Resolution Whole Mount In Situ Hybridization within Zebrafish Embryos to Study Gene Expression and Function

Este artigo incide sobre todo o monte de hibridização in situ (desejo) de embriões de peixe-zebra. A tecnologia VONTADE facilita a avaliação da expressão do gene, tanto em termos de distribuição do tecido e fase de desenvolvimento. Protocolos são descritas pela utilização de desejo dos embriões de peixe-zebra utilizando sondas de ARN anti-sentido marcadas com digoxigenina. As sondas são gerados através da incorporação de nucleótidos ligados com digoxigenina, através de transcrição in vitro de modelos de genes que foram clonados e linearizado. Os córions de embriões colhidos em estádios de desenvolvimento definidos são removidos antes da incubação com sondas específicas. Seguindo um processo de lavagem para remover o excesso de sonda, os embriões foram incubados com o anticorpo anti-digoxigenina conjugado com fosfatase alcalina. Com o emprego de um substrato cromogénico para a fosfatase alcalina, a expressão do gene específico pode ser avaliada. Dependendo do nível de expressão do gene de todo o processo pode ser completado dentro de 2-3 dias.

Usando o protocolo com 50 embriões por cesto (por gene de / por condição experimental), o padrão de expressão do gene, que podem ser obtidos numa experiência. Quase todos os embriões mostram padrões de expressão semelhantes para um determinado gene. Os exemplos representativos da coloração em hibridação in situ são mostrados nas Figuras 3-6. Tanto o sentido e anti-sentido riboprobes foram sintetizados a partir dos cDNAs correspondentes a PC5.1, PC5.2 6...

O peixe-zebra, um pequeno peixe tropical, tornou-se um modelo popular para estudar a função do gene durante o desenvolvimento de vertebrados e doença. A expressão espacial e temporal dos genes alvo pode ser determinada pela<em&gt; In situ</em&gt; Hibridação. Nosso protocolo melhorado permite a detecção de transcritos abundantes de baixo com baixo sinal de fundo não específico.

Alta resolução Monte Whole<em&gt; In Situ</em&gt; Hibridização dentro embriões Zebrafish para estudar a expressão gênica e função

This article focuses on whole-mount in situ hybridization (WISH) of zebrafish embryos. The WISH technology facilitates the assessment of gene expression ...

O objetivo geral deste procedimento é avaliar a expressão espaço-temporal de genes específicos de interesse em embriões de peixe-zebra em estágios. Isso é feito primeiro gerando sondas CD NA, incorporando oxigênio digo em nucleotídeos ligados usando transcrição in vitro. Em seguida, os embriões são colhidos em estágios de desenvolvimento definidos.O cório é removido e os embriões são armazenados em metanol a 20 graus Celsius negativos. Em seguida, após a digestão e pós-fixação, os embriões são hibridizados com as sondas apropriadas. Finalmente, os embriões são corados com gene antide e anticorpos e o sinal desenvolvido com substratos para fosfatase alcalina.Em última análise, podem ser obtidos resultados que mostram a distribuição tecidual da expressão gênica em um determinado estágio de desenvolvimento por meio de hibridização in situ de montagem completa e imagem. Embora este método possa fornecer grandes insights sobre a expressão normal do gene alvo, ele também pode ser aplicado a outras condições, como a expressão do gene alvo no modelo de doença e quando outros genes são superexpressos ou subexpressos. Usando a tecnologia de microinjeção Usando CDNA para um gene de interesse,

high-resolution-whole-mount-situ-hybridization-within-zebrafish

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JoVE Journal

Biology

Biologia

Montar toda a hibridização in situ é uma das técnicas mais utilizadas em biologia do desenvolvimento. Aqui, apresentamos uma alta resolução de dupla fluorescentes em protocolo de hibridização in situ para analisar o padrão de expressão precisa de um único gene e para determinar a sobreposição dos domínios de expressão dos dois genes. Incluímos uma propidium iodeto nuclear contra-coloração para destacar a organização do tecido.

Zebrafish Whole Mount Alta Resolução Duplo Fluorescente In Situ Hibridização

Usando Monte Whole In situ Hibridação a ligação de Biologia Molecular e Organísmicos

Uma maneira rápida de realizar imunocoloração do coração embrionário zebrafish é descrito. Em comparação com toda a abordagem montagem imunocoloração, este método aumenta drasticamente a penetração dos anticorpos, o que permite obter imagens de alta resolução que revelam estruturas celulares / subcelulares no coração dentro de um tempo de processamento muito reduzido.

Imunomarcação de Dissecada Coração Zebrafish embrionárias

Descrito aqui é um protocolo para a imagem semi-automatizada de fluorescência de tecido específico em embriões de peixe-zebra.

Imagem semi-automatizada de Fluorescência de tecidos específicos em embriões Zebrafish

O embrião de peixe-zebra é um excelente modelo para investigação em biologia do desenvolvimento. Durante a embriogênese, peixe-zebra desenvolver com uma massa de gema, que apresenta desafios tridimensionais para observação de amostras e análise. Este protocolo descreve como criar bidimensionais planas montagem preparações de toda montagem in situ (desejo) manchadas espécimes embrião de peixe-zebra.

Monte Preparação Plano de observação e análise de amostras de embriões Zebrafish manchado por inteiro Monte<em&gt; Em situ</em&gt; Hibridização

Técnicas são descritas a imunocoloração fosfo-epitopos em embriões de peixe-zebra inteiros e em seguida, realizar duas cores localização confocal fluorescente em estruturas celulares tão pequenos quanto cílios. As técnicas de fixação e de imagem pode definir a localização e cinética da aparência ou a activação de proteínas específicas.

Imunocoloração fosfo-epitopos em ciliadas Órgãos da Whole Mount embriões Zebrafish

Desenvolvimento de cílios é vital para a organogênese adequada. Este protocolo descreve um método otimizado para rotular e Visualizar células ciliadas do zebrafish.

Visualização de células Multiciliated no Zebrafish através de um protocolo combinado de toda montagem fluorescente In Situ da hibridação e imunofluorescência

Este protocolo demonstra a imunofluorescência seqüencial e immunohistochemistry em Cryosections dos embriões do zebrafish do cedo-estágio permitindo análises precisas da colocalização em populações específicas da pilha.

Imunofluorescência sequencial e imuno-histoquímica em embriões de zebrafish Crioseccionados

Este artigo descreve um método para montar embriões frágeis do zebrafish para a microscopia confocal prolongada do tempo-lapso. Este método de baixo custo é fácil de executar usando pratos regulares de microscopia com fundo de vidro para imagens em qualquer microscópio invertido. A montagem é realizada em camadas de agarose em diferentes concentrações.

Um método de montagem em camadas para a microscopia confocal de lapso de tempo prolongado de embriões zebrafish inteiros

Aqui, apresentamos um protocolo para detecção de proteínas mediadas por anticorpos fluorescentes em preparações inteiras de embriões e larvas de zebrafish.

Imunohistoquímica do Monte Inteiro em Embriões e Larvas de Zebrafish

Este protocolo descreve como obter imagens combinando hibridização in situ e imunohistoquímica de cortes embrionários de zebrafish. A hibridização in situ foi realizada antes da criossecção, seguida da coloração de anticorpos. É útil detectar os padrões de expressão de dois genes em peixes-zebra se houver escassez de anticorpos.

In situ Hibridização Combinada com Imunohistoquímica em Embriões de Zebrafish Crioseccionados

Aprenda hibridização in situ em montagem inteira de alta resolução em embriões de zebrafish para analisar a expressão gênica espacial e temporal. Este método melhora a detecção de transcritos de baixa abundância com menor ruído de fundo.

Alta resolução Monte Whole

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