Name: Alta resolução Monte Whole In Situ Hibridização dentro embriões Zebrafish para estudar a expressão gênica e função (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-10-19T18:30:00.000+00:00
Duration: 10 min 6 s
Description: Aprenda hibridização in situ em montagem inteira de alta resolução em embriões de zebrafish para analisar a expressão gênica espacial e temporal. Este método melhora a detecção de transcritos de baixa abundância com menor ruído de fundo.

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<ol><li>Lieschke, G. J., Currie, P. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Animal+models+of+human+disease%3A+zebrafish+swim+into+view%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Rev.+Genet%22%5BJournal%5D)">Animal models of human disease: zebrafish swim into view.</a> Nat. Rev. Genet. 8, 353-367 (2007).</li>
<li>Wolman, M., Granato, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Behavioral+genetics+in+larval+zebrafish%3A+learning+from+the+young%5BTitle%5D)+AND+%22Dev.+Neurobiol%22%5BJournal%5D)">Behavioral genetics in larval zebrafish: learning from the young.</a> Dev. Neurobiol. 72, 366-372 (2010).</li>
<li>Lawson, N. D., Wolfe, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Forward+and+reverse+genetic+approaches+for+the+analysis+of+vertebrate+development+in+the+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Dev.+Cell%22%5BJournal%5D)">Forward and reverse genetic approaches for the analysis of vertebrate development in the zebrafish.</a> Dev. Cell. 21, 48-64 (2011).</li>
<li>Arkhipova, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+and+regulation+of+the+hb9%2Fmnx1+beta-cell+progenitor+specific+enhancer+in+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Dev.+Biol%22%5BJournal%5D)">Characterization and regulation of the hb9/mnx1 beta-cell progenitor specific enhancer in zebrafish.</a> Dev. Biol. 365, 290-302 (2012).</li>
<li>Kimmel, C. B., Ballard, W. W., Kimmel, S. R., Ullmann, B., Schilling, T. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stages+of+embryonic+development+of+the+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Dev.+Dyn%22%5BJournal%5D)">Stages of embryonic development of the zebrafish.</a> Dev. Dyn. 203, 253-310 (1995).</li>
<li>Chitramuthu, B. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+cloning+and+embryonic+expression+of+zebrafish+PCSK5+co-orthologues%3A+functional+assessment+during+lateral+line+development%5BTitle%5D)+AND+%22Dev.+Dyn%22%5BJournal%5D)">Molecular cloning and embryonic expression of zebrafish PCSK5 co-orthologues: functional assessment during lateral line development.</a> Dev. Dyn. 239, 2933-2946 (2010).</li>
<li>Liao, E. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((SCL%2FTal-1+transcription+factor+acts+downstream+of+cloche+to+specify+hematopoietic+and+vascular+progenitors+in+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+Dev%22%5BJournal%5D)">SCL/Tal-1 transcription factor acts downstream of cloche to specify hematopoietic and vascular progenitors in zebrafish.</a> Genes Dev. 12, 621-626 (1998).</li>
<li>Stainier, D. Y., Weinstein, B. M., Detrich, H. W. 3rd, Zon, L. I., Fishman, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cloche%2C+an+early+acting+zebrafish+gene%2C+is+required+by+both+the+endothelial+and+hematopoietic+lineages%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Cloche, an early acting zebrafish gene, is required by both the endothelial and hematopoietic lineages.</a> Development. 121, 3141-3150 (1995).</li>
<li>Detrich, H. W. 3rd, et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intraembryonic+hematopoietic+cell+migration+during+vertebrate+development%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Intraembryonic hematopoietic cell migration during vertebrate development.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 92, 10713-10717 (1995).</li>
<li>Liao, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+zebrafish+gene+cloche+acts+upstream+of+a+flk-1+homologue+to+regulate+endothelial+cell+differentiation%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">The zebrafish gene cloche acts upstream of a flk-1 homologue to regulate endothelial cell differentiation.</a> Development. , 124-381 (1997).</li>
<li>Krauss, S., Concordet, J. P., Ingham, P. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+functionally+conserved+homolog+of+the+Drosophila+segment+polarity+gene+hh+is+expressed+in+tissues+with+polarizing+activity+in+zebrafish+embryos%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">A functionally conserved homolog of the Drosophila segment polarity gene hh is expressed in tissues with polarizing activity in zebrafish embryos.</a> Cell. 75, 1431-1444 (1993).</li>
<li>Akimenko, M. A., Ekker, M., Wegner, J., Lin, W., Westerfield, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Combinatorial+expression+of+three+zebrafish+genes+related+to+distal-less%3A+part+of+a+homeobox+gene+code+for+the+head%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Combinatorial expression of three zebrafish genes related to distal-less: part of a homeobox gene code for the head.</a> J. Neurosci. 14, 3475-3486 (1994).</li>
<li>Alexander, J., Rothenberg, M., Henry, G. L., Stainier, D. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((casanova+plays+an+early+and+essential+role+in+endoderm+formation+in+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Dev.+Biol%22%5BJournal%5D)">casanova plays an early and essential role in endoderm formation in zebrafish.</a> Dev. Biol. 215, 343-357 (1999).</li>
<li>Milewski, W. M., Duguay, S. J., Chan, S. J., Steiner, D. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Conservation+of+PDX-1+structure%2C+function%2C+and+expression+in+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Endocrinology%22%5BJournal%5D)">Conservation of PDX-1 structure, function, and expression in zebrafish.</a> Endocrinology. 139, 1440-1449 (1998).</li>
<li>Argenton, F., Walker, M. D., Colombo, L., Bortolussi, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+characterization+of+the+trout+insulin+promoter%3A+implications+for+fish+as+a+favorable+model+of+pancreas+development%5BTitle%5D)+AND+%22FEBS+Lett%22%5BJournal%5D)">Functional characterization of the trout insulin promoter: implications for fish as a favorable model of pancreas development.</a> FEBS Lett. 407, 191-196 (1997).</li>
<li>Biemar, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pancreas+development+in+zebrafish%3A+early+dispersed+appearance+of+endocrine+hormone+expressing+cells+and+their+convergence+to+form+the+definitive+islet%5BTitle%5D)+AND+%22Dev.+Biol%22%5BJournal%5D)">Pancreas development in zebrafish: early dispersed appearance of endocrine hormone expressing cells and their convergence to form the definitive islet.</a> Dev. Biol. 230, 189-203 (2001).</li>
<li>Thisse, C., Thisse, B., Schilling, T. F., Postlethwait, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structure+of+the+zebrafish+snail1+gene+and+its+expression+in+wild-type%2C+spadetail+and+no+tail+mutant+embryos%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Structure of the zebrafish snail1 gene and its expression in wild-type, spadetail and no tail mutant embryos.</a> Development. 119, 1203-1215 (1993).</li>
<li>Cadieux, B., Chitramuthu, B. P., Baranowski, D., Bennett, H. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+zebrafish+progranulin+gene+family+and+antisense+transcripts%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Genomics%22%5BJournal%5D)">The zebrafish progranulin gene family and antisense transcripts.</a> BMC Genomics. 6, 156(2005).</li>
<li>Chitramuthu, B. P., Bennett, H. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Use+of+zebrafish+and+knockdown+technology+to+define+proprotein+convertase+activity%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">Use of zebrafish and knockdown technology to define proprotein convertase activity.</a> Methods Mol. Biol. 768, 273-296 (2011).</li>
<li>Thisse, C., Thisse, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High+resolution+in+situ+hybridization+on+whole-mount+zebrafish+embryo%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Protoc%22%5BJournal%5D)">High resolution in situ hybridization on whole-mount zebrafish embryo.</a> Nat. Protoc. 3, 59-69 (2008).</li>
</ol>

Os autores declaram que não têm interesses financeiros concorrentes.

Nós desenvolvemos métodos melhorados para visualizar o RNA com alta resolução. A nos procedimentos de hibridização in situ são realizados através de simples cestos feitos sob medida com fundo poroso (Figura 1). Os embriões são processadas usando soluções sem RNase em placas de 6 cavidades, à temperatura ambiente e sob condições estéreis. Segregar embriões cestas são feitas de diferentes tubos coloridos Eppendorf. Cestas com ou sem um aro são utilizados para...

O peixe-zebra (Danio rerio) tem emergido como um poderoso modelo animal para o estudo do desenvolvimento dos vertebrados, a doença, o comportamento e no rastreio de drogas 1-3. Embriões de peixe-zebra pode ser obtido em grandes quantidades a partir de um único cruzamento. Fertilização e desenvolvimento ocorre ex utero e os embriões opticamente claras desenvolver rapidamente. Eventos críticos de desenvolvimento ocorrem durante as primeiras 48 horas pós-fertilização (hpf). Isto inclui o aparecimento de órgão primórdios e o início de citodiferenciação. Knockdown ou sobre-expressão de proteínas pode ser alcançada através da microinjecção de embriões com anti-sentido morfolino (MO), os oligonucleótidos ou ARNm, respectivamente, no estádio de uma ou duas células (0,75 HPF). O desejo de embriões zebrafish facilita o estudo da expressão espaço-temporal de genes específicos de interesse. Aplicação da técnica DESEJO seguindo microinjeção de embriões com mRNA ou MO para o excesso de express ou os níveis de proteína específicas knockdown revela regulação diferencial de outros genes. As mudanças nos padrões de expressão de genes pode ser correlacionada com as alterações fenotípicas e revelar a função de genes alvo durante a organogénese precoce. Uma vez que as sondas podem ser preparadas e armazenadas de antemão, a técnica pode ser aplicada a ISH para revelar os padrões de expressão de genes para pelo menos 20 genes de cada vez utilizando placas de seis poços e fizeram cestas personalizadas.

<table><tbody>Kit de clonagem <tr><td>Taq Polymerase</td><td>Invitrogen</td><td>10342053</td><td></td></tr><tr><td>TopoTA - Promotor duplo pCRII-TOPO</td><td>Invitrogen</td><td>K4650-01</td><td></td></tr><tr><td>HQ Mini Kit de purificação de plasmídeo</td><td>Invitrogen</td><td>K2100-01</td><td></td></tr><tr><td>Agarose</td><td>Roche</td><td>11 685 660 001</td><td></td></tr><tr><td>Not1 e HindIII Enzimas de restrição</td><td>Invitrogen</td><td>15441-025, 15207-012</td><td></td></tr><tr><td>Tampão Saturado Fenol,</td><td>Invitrogen</td> ultrapuro <td>15513039</td><td>Armazenar a 4 °C. Olhos, pele e trato respiratório irritantes e suspeitos de serem cancerígenos. Deve-se ter cuidado durante o manuseio.</td></tr><tr><td>Clorofórmio</td><td>Fisher</td><td>C607-1</td><td>Tóxico e suspeito de ser cancerígeno. Trabalhe sob a coifa.</td></tr><tr><td>DNAse livre de RNase I</td><td>Roche</td><td>4716728001</td><td>Prepare pequenas alíquotas e armazene a -20 graus C.</td></tr><tr><td>Mistura de marcação de DIG-RNA com Sp6, T7 e T3 RNA polimerase</td><td>Roche</td><td>11277073910</td> Inibidor de <td></td></tr><tr><td>RNase</td><td>Roche</td><td>10777-019</td><td></td></tr><tr><td>3.0 M Acetato de sódio (pH 5.5)</td><td>Fisher</td><td>50-751-7355</td><td></td></tr><tr><td>100% Etanol</td><td>Álcoois</td><td></td><td></td>comerciais</tr><tr><td>Dietil Pirocarbonato (DEPC)</td><td>Sigma</td><td>40718-25ML</td><td>O DEPC é um irritante para os olhos, a pele e as vias respiratórias. Evite o contato com a pele e os olhos. Use óculos de segurança, luvas e máscara.</td></tr><tr><td>NaOH</td><td>Fisher</td><td>SS255-1</td><td></td></tr><tr><td>EDTA 0,5 M (pH 8,0)</td><td>Fisher</td><td>50-751-7404</td><td></td></tr><tr><td>Sistemas de Aquário de Sal Oceânico Instantâneo</td><td></td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>Fosfato Tampolado Salino (PBS)</td><td>Fisher</td><td>FL-03-0900</td><td></td></tr><tr><td>Paraformaldeído (PFA)</td><td>Sigma</td><td>P6148-1KG</td><td>Prepare e armazene a -20 graus; C em alíquotas de 40 ml para utilização posterior. O PFA é tóxico. Use óculos de segurança, luvas e máscara contra poeira.</td></tr><tr><td>Feniltiocarbomida (PTC)</td><td>Sigma</td><td>P7629-25G</td><td>PTC é altamente tóxico. Use óculos de segurança, luvas e máscara contra poeira.</td></tr><tr><td>Metanol</td><td>Fisher</td><td>A947-4</td><td></td></tr><tr><td>Dumont (Relojoeiro s) Padrão de pinça nº 5</td><td>Fine Science Tools</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Cluster de cultura de células de seis poços</td><td>Sarstedt</td><td>83.1839</td><td></td></tr><tr><td>Os cestos são feitos de malha de nylon e tubos Eppendorf</td><td>Preparação</td><td></td> interna <td>Para fazer os cestos, corte tubos Eppendorf (1,5 ml) com ou sem bordas para remover a extremidade cônica. Corte a malha de nylon em pequenos pedaços correspondentes ao tamanho de&nbsp; as extremidades cortadas dos tubos Eppendorf. Coloque os tubos com a malha de nylon cobrindo a extremidade cortada em um elétrico&nbsp; placa quente até que o tubo e a malha de nylon fiquem juntos (realize na capela de exaustão). Corte o excesso de malha dos cestos e guarde-os em 100% de metanol até o uso.</td></tr><tr><td>Monolaurato de polioxietilenoorbitano (Tween 20)</td> <td>Sigma</td><td>P1379-500ML</td><td></td></tr><tr><td>Proteinase K</td><td>Fermentas</td><td>EO0491</td><td></td></tr><tr><td>Anidrido acético</td><td>Sigma</td><td>242845</td><td></td></tr><tr><td>Trietanolamina</td><td>Sigma</td><td>90279-100ML</td><td></td></tr><tr><td>Formamida, grau de pureza alta</td><td>Sigma</td><td>F9037</td><td></td></tr><tr><td>AG501-X8 Resina</td><td>Bio Rad</td><td>142-6424</td><td></td></tr><tr><td>ácido cítrico monohidratado</td><td>Sigma</td><td>C0706-500G</td><td></td></tr><tr><td>sal de heparina sódica</td><td>Sigma</td><td>H3393-25KU</td><td></td></tr><tr><td>tampão de citrato de sódio salino (SSC)</td> <td>Sigma</td><td>S6639</td><td></td></tr><tr><td>tRNA de levedura de padeiro tipo X</td><td>Sigma</td><td>R5636-1ML</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Fisher</td><td>S640-500</td><td></td></tr><tr><td>Tris-HCl</td><td>Fisher</td><td>BP153-1</td><td></td></tr><tr><td>MgCl2</td><td>Fisher</td><td>S25403</td><td></td></tr><tr><td>Cloridrato de Levamisol</td><td>Sigma</td><td>31742</td><td></td></tr><tr><td>N,N-Dimetilformamida anidro (DMF)</td><td>Sigma</td><td>227056</td><td>Teratógeno irritante, tóxico, combustível e suspeito. Manuseie com trajes de segurança adequados, incluindo luvas e óculos de proteção.</td></tr><tr><td>5-Bromo-4-cloro-3-indolil fosfato (BCIP)</td><td>Sigma</td><td>N6639</td><td>Proteger esta solução da luz.</td></tr><tr><td>Nitroblue tetrazólio (NBT)</td><td>Sigma</td><td>840W</td><td>Proteja esta solução da luz.</td></tr><tr><td>Albumina de soro bovino, fração purificada V (BSA)</td> <td>Sigma</td><td>A8806</td><td></td></tr><tr><td>Fragmentos de Fab Anti-digoxigenina-AP de ovelha</td><td>Roche</td><td>1093274910</td><td></td></tr><tr><td>Glicerol</td><td>Sigma</td><td>G5516-500ML</td><td></td></tr><tr><td>Placas de cultura de células de 96 poços</td><td>Sarstedt</td><td>83.1835</td><td></td></tr><tr><td>Tg (mnx1: GFP) ml2 / Tg (hb9: GFP) ml2</td><td>ZIRC</td><td>Tg (mnx1: GFP) ml2</td><td></td></tr><tr><td>Sistemas de aquário oceânico instantâneo</td><td></td><td>N / A</td><td></td></tr></tbody></table>

alta resolução monte whole<em&gt; in situ</em&gt; hibridização dentro embriões zebrafish para estudar a expressão gênica e função

High Resolution Whole Mount In Situ Hybridization within Zebrafish Embryos to Study Gene Expression and Function

Este artigo incide sobre todo o monte de hibridização in situ (desejo) de embriões de peixe-zebra. A tecnologia VONTADE facilita a avaliação da expressão do gene, tanto em termos de distribuição do tecido e fase de desenvolvimento. Protocolos são descritas pela utilização de desejo dos embriões de peixe-zebra utilizando sondas de ARN anti-sentido marcadas com digoxigenina. As sondas são gerados através da incorporação de nucleótidos ligados com digoxigenina, através de transcrição in vitro de modelos de genes que foram clonados e linearizado. Os córions de embriões colhidos em estádios de desenvolvimento definidos são removidos antes da incubação com sondas específicas. Seguindo um processo de lavagem para remover o excesso de sonda, os embriões foram incubados com o anticorpo anti-digoxigenina conjugado com fosfatase alcalina. Com o emprego de um substrato cromogénico para a fosfatase alcalina, a expressão do gene específico pode ser avaliada. Dependendo do nível de expressão do gene de todo o processo pode ser completado dentro de 2-3 dias.

Usando o protocolo com 50 embriões por cesto (por gene de / por condição experimental), o padrão de expressão do gene, que podem ser obtidos numa experiência. Quase todos os embriões mostram padrões de expressão semelhantes para um determinado gene. Os exemplos representativos da coloração em hibridação in situ são mostrados nas Figuras 3-6. Tanto o sentido e anti-sentido riboprobes foram sintetizados a partir dos cDNAs correspondentes a PC5.1, PC5.2 6...

O peixe-zebra, um pequeno peixe tropical, tornou-se um modelo popular para estudar a função do gene durante o desenvolvimento de vertebrados e doença. A expressão espacial e temporal dos genes alvo pode ser determinada pela<em&gt; In situ</em&gt; Hibridação. Nosso protocolo melhorado permite a detecção de transcritos abundantes de baixo com baixo sinal de fundo não específico.

Alta resolução Monte Whole<em&gt; In Situ</em&gt; Hibridização dentro embriões Zebrafish para estudar a expressão gênica e função

This article focuses on whole-mount in situ hybridization (WISH) of zebrafish embryos. The WISH technology facilitates the assessment of gene expression ...

O objetivo geral deste procedimento é avaliar a expressão espaço-temporal de genes específicos de interesse em embriões de peixe-zebra em estágios. Isso é feito primeiro gerando sondas CD NA, incorporando oxigênio digo em nucleotídeos ligados usando transcrição in vitro. Em seguida, os embriões são colhidos em estágios de desenvolvimento definidos.O cório é removido e os embriões são armazenados em metanol a 20 graus Celsius negativos. Em seguida, após a digestão e pós-fixação, os embriões são hibridizados com as sondas apropriadas. Finalmente, os embriões são corados com gene antide e anticorpos e o sinal desenvolvido com substratos para fosfatase alcalina.Em última análise, podem ser obtidos resultados que mostram a distribuição tecidual da expressão gênica em um determinado estágio de desenvolvimento por meio de hibridização in situ de montagem completa e imagem. Embora este método possa fornecer grandes insights sobre a expressão normal do gene alvo, ele também pode ser aplicado a outras condições, como a expressão do gene alvo no modelo de doença e quando outros genes são superexpressos ou subexpressos. Usando a tecnologia de microinjeção Usando CDNA para um gene de interesse, configure uma reação de marcação de RNA para sintetizar sondas de RNA marcadas com oxigênio digo em um frasco de reação livre de RNAs, adicionando de um a cinco microgramas de DNA modelo purificado a RNAs estéreis livres de água duplamente destilada tratada até um volume de 13 microlitros.Resfrie a reação no gelo e adicione os seguintes reagentes após misturar suavemente a centrífuga a 2000 RPM por 30 segundos à temperatura ambiente antes de incubar a reação por duas horas a 37 graus Celsius após a incubação, remova o DNA molde adicionando dois microlitros de RNAs livres. Os DNAs incubam por 30 minutos a 37 graus Celsius e param a reação adicionando dois microlitros de EDTA 0,2 molar, precipitam os produtos da reação adicionando 2,5 microlitros de cloreto de lítio de quatro molares e 75 microlitros de etanol 100%. Misturar a solução e incubar a 20 graus Celsius negativos durante 45 minutos ou durante a noite.Centrifugar a suspensão durante 30 minutos a 13 000 rpm e a quatro graus Celsius. Em seguida, lave o pellet com gelo frio, 70% de etanol após girar por 10 minutos. Seque o pellet por dois minutos antes de resus, suspendendo-o em 50 microlitros de nuclease, água bidestilada livre.Em seguida, incube-o por 30 minutos. A 37 graus Celsius, execute de um a dois microlitros da sonda em um gel 1%aros por cerca de 30 minutos para verificar sua qualidade e integridade. Em seguida, use um espectrofotômetro para quantificar a sonda para reidratar embriões previamente fixados e congelados.Comece fazendo cestos cortando as extremidades cônicas de microtubos de 1,5 mililitro. Em seguida, remova os aros superiores da metade deles. Corte pequenos pedaços de malha de náilon para cobrir as pontas e, em seguida, em alguns capôs, aqueça as extremidades do tubo em uma placa elétrica e pressione-as na malha depois de esfriarem.Remova o excesso de malha de náilon e armazene os cestos em 100% de metanol em temperatura ambiente. Depois de preparar a diluição sucessiva de metanol em PBS, de acordo com o protocolo de texto e adicionar quatro mililitros de cada um nos poços de um prato de seis poços, coloque os embriões em cestos individuais para cada sonda e incube-os na série de PBS de metanol por cinco minutos por poço, terminando com três lavagens em PBST. Permee os embriões com proteinase K à temperatura ambiente, usando os seguintes tempos de incubação por estágio de desenvolvimento.Em seguida, fixe os embriões em aldeído paraforme a 4% em PBS por 20 minutos e lave-os em PBST três vezes por cinco minutos cada. Em seguida, prepare a mistura de acetilação de acordo com o protocolo de texto e incube os embriões duas vezes por 10 minutos cada. Em seguida, lave os embriões e o PBST duas vezes por 10 minutos cada.Transfira os embriões para microtubos estéreis e incube com 200 microlitros de mistura de hibridização ou HM, em banho-maria a 70 graus Celsius por duas a quatro horas. Adicione 100 a 200 nanogramas de sonda à solução e incube durante a noite a 70 graus Celsius em banho-maria. Substitua a solução da sonda por HM pré-aquecido e incube as amostras a 70 graus Celsius por 15 minutos.Depois de colocar as amostras em uma série H-M-S-S-C e bloquear os embriões de acordo com o protocolo de texto, incubar os embriões em uma diluição de um a 5.000 de anticorpo anti-D AP em tampão de bloqueio durante a noite a quatro graus Celsius com agitação suave no dia seguinte. Lave os embriões seis vezes por 15 minutos cada. Após a pré-coloração dos embriões, incube-os em BCIP e NBT.Adicione a temperatura ambiente no escuro por 30 minutos. Use um microscópio estéreo para monitorar a reação de coloração a cada 30 minutos para interromper a reação. Transfira os cestos de embriões para poços contendo solução de parada duas vezes por 10 minutos cada com agitação suave.Após a pós-fixação dos embriões com 4% de paraformaldeído em PBS por 20 minutos. Monte os embriões transferindo-os com o mínimo de PBS possível para seis placas de poços contendo 100% de glicerol. Balance suavemente os embriões no escuro à temperatura ambiente, imagem durante a noite em 100% glicerol sob um microscópio estéreo.Exemplos representativos de coloração situ para hibridização são mostrados aqui. A coloração roxa observada após a hibridização com sonda ribo de interesse representa tanto a abundância quanto os locais de expressão de um gene específico. Por exemplo, o PC 5.1 mostra expressão muito discreta na parte anterior e posterior da vesícula ótica e na linha lateral primordial 24 horas após a fertilização e está fortemente localizado nos mastros neurológicos da linha lateral anterior e posterior 72 horas após a fertilização.Em contraste, o PC 5.2 mostra expressão ubíqua no SNC com regionalização distinta dentro da vesícula ótica somitos e do ducto frico prono, e é altamente expresso no fígado e no intestino 96 horas após a fertilização. A ausência de expressão gênica ao usar as respectivas sondas Ribo sensoriais serve como um controle negativo, como visto aqui. As análises de expressão dos marcadores sanguíneos mostraram coloração de SCL T um dentro das células cranianas bilaterais e na massa celular intermediária ou ICM.Embora a coloração para gata one também seja vista dentro do ICM, o padrão de expressão é diferente. A expressão de F-L-K-K-D-R-L foi observada nos vasos principais e intersegmentares do rombencéfalo, e na coloração ICM para ouriço sônico foi observada no cordão sem cordão. Nestes exemplos, a expressão de DLX dois 34 horas após a fertilização está localizada nos arcos hipotálamo e crânio mesenquimal de Talon Cephalon e FK D seven Fox, uma expressão de um em 24 horas após a fertilização é vista principalmente na placa de piso e na expressão de HypoChlor.Os padrões dos marcadores pancreáticos mostraram coloração de insulina no pâncreas endócrino e tripsina no pâncreas exócrino. Os resultados mostrando padrões de expressão com alta resolução confirmam o sucesso do protocolo delineado para a detecção da expressão de genes de alta e baixa abundância mostrados. Aqui estão alguns exemplos de experimentos realizados em algumas condições ideais.Por exemplo, um sinal de fundo alto com baixa expressão de ouriço sônico resultou de hibridização inadequada, permeável e entre 55 e 60 graus Celsius. Depois de assistir a este vídeo, você deve ter uma boa compreensão de como realizar a montagem inteira em duas hibridações de embriões de peixe-zebra usando sondas de RNA marcadas com vala, coloração pós-hibridização e imagem.

high-resolution-whole-mount-situ-hybridization-within-zebrafish

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Montar toda a hibridização in situ é uma das técnicas mais utilizadas em biologia do desenvolvimento. Aqui, apresentamos uma alta resolução de dupla fluorescentes em protocolo de hibridização in situ para analisar o padrão de expressão precisa de um único gene e para determinar a sobreposição dos domínios de expressão dos dois genes. Incluímos uma propidium iodeto nuclear contra-coloração para destacar a organização do tecido.

Zebrafish Whole Mount Alta Resolução Duplo Fluorescente In Situ Hibridização

Usando Monte Whole In situ Hibridação a ligação de Biologia Molecular e Organísmicos

Uma maneira rápida de realizar imunocoloração do coração embrionário zebrafish é descrito. Em comparação com toda a abordagem montagem imunocoloração, este método aumenta drasticamente a penetração dos anticorpos, o que permite obter imagens de alta resolução que revelam estruturas celulares / subcelulares no coração dentro de um tempo de processamento muito reduzido.

Imunomarcação de Dissecada Coração Zebrafish embrionárias

O embrião de peixe-zebra é um excelente modelo para investigação em biologia do desenvolvimento. Durante a embriogênese, peixe-zebra desenvolver com uma massa de gema, que apresenta desafios tridimensionais para observação de amostras e análise. Este protocolo descreve como criar bidimensionais planas montagem preparações de toda montagem in situ (desejo) manchadas espécimes embrião de peixe-zebra.

Monte Preparação Plano de observação e análise de amostras de embriões Zebrafish manchado por inteiro Monte<em&gt; Em situ</em&gt; Hibridização

Técnicas são descritas a imunocoloração fosfo-epitopos em embriões de peixe-zebra inteiros e em seguida, realizar duas cores localização confocal fluorescente em estruturas celulares tão pequenos quanto cílios. As técnicas de fixação e de imagem pode definir a localização e cinética da aparência ou a activação de proteínas específicas.

Imunocoloração fosfo-epitopos em ciliadas Órgãos da Whole Mount embriões Zebrafish

Desenvolvimento de cílios é vital para a organogênese adequada. Este protocolo descreve um método otimizado para rotular e Visualizar células ciliadas do zebrafish.

Visualização de células Multiciliated no Zebrafish através de um protocolo combinado de toda montagem fluorescente In Situ da hibridação e imunofluorescência

As tecnologias de edição de genes permitiram que os pesquisadores gerassem mutantes de zebrafish para investigar a função genética com relativa facilidade. Aqui, fornecemos um guia para realizar genotipagem e quantificação de embriões paralelos em sinais de hibridização in situ em zebrafish. Essa abordagem imparcial proporciona maior precisão em análises fenotípicas baseadas na hibridização do situ.

Genotipagem e Quantificação da Coloração de Hibridização in Situ em Zebrafish

Este artigo descreve um método para montar embriões frágeis do zebrafish para a microscopia confocal prolongada do tempo-lapso. Este método de baixo custo é fácil de executar usando pratos regulares de microscopia com fundo de vidro para imagens em qualquer microscópio invertido. A montagem é realizada em camadas de agarose em diferentes concentrações.

Um método de montagem em camadas para a microscopia confocal de lapso de tempo prolongado de embriões zebrafish inteiros

Aqui, apresentamos um protocolo para detecção de proteínas mediadas por anticorpos fluorescentes em preparações inteiras de embriões e larvas de zebrafish.

Imunohistoquímica do Monte Inteiro em Embriões e Larvas de Zebrafish

O zebrafish é um modelo importante para entender o desenvolvimento renal. Aqui, um protocolo de hibridização in situ é otimizado para detectar expressão genética em larvas de zebrafish e juvenis durante o desenvolvimento de mesonepros.

In situ Hibridização em Larvas de Zebrafish e Juvenis durante o Desenvolvimento de Mesonephros

Este protocolo descreve como obter imagens combinando hibridização in situ e imunohistoquímica de cortes embrionários de zebrafish. A hibridização in situ foi realizada antes da criossecção, seguida da coloração de anticorpos. É útil detectar os padrões de expressão de dois genes em peixes-zebra se houver escassez de anticorpos.

In situ Hibridização Combinada com Imunohistoquímica em Embriões de Zebrafish Crioseccionados

Aprenda hibridização in situ em montagem inteira de alta resolução em embriões de zebrafish para analisar a expressão gênica espacial e temporal. Este método melhora a detecção de transcritos de baixa abundância com menor ruído de fundo.

Alta resolução Monte Whole

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