Name: Ensaios de viabilidade para células em cultura (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-01-20T13:45:00.000+00:00
Duration: 12 min 3 s
Description: Aprenda ensaios de viabilidade celular que combinam medição de ATP, imunomarcação de proteínas do citoesqueleto e imagem infravermelha para avaliar função metabólica e integridade estrutural de células em cultura.

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Reconhecemos Juliann Jaumotte para a idéia de poupar nos volumes de reagentes no ensaio ATP. Estamos profundamente gratos pelo apoio administrativo soberba de Maria Caruso, Deb Willson, e Jackie Farrer e para a Escola de Farmácia Mylan para a prestação de apoio financeiro para estes estudos. Agradecimentos também são devidos às Doenças Hunkele temido Fundação eo Parkinson e Distúrbios do Movimento da Fundação pelo apoio financeiro dos estudos neuronais primários.

Nenhum dos autores tem quaisquer conflitos de divulgar.

Verificou-se que a intensidade do sinal em todos os três ensaios de viabilidade é linear e correlacionada com a densidade do revestimento. No entanto, nem todos os ensaios são igualmente sensíveis a 2 vezes ou alterações de 1,5 vezes na densidade de revestimento. Para células N2a, os ensaios de infravermelhos são menos sensíveis do que o ensaio de ATP, particularmente a densidades mais baixas do chapeamento. Embora os ensaios de infravermelhos são menos sensíveis que o ATP, os DRAQ5 + Safira ensaios e ensaios α-tubulina...

O ensaio de viabilidade mais comum nas ciências biológicas envolve a contagem de células. Isto é evidenciado por uma análise das principais (mais recentes) 200 publicações que apareceram no PubMed com qualquer uma das palavras-chave &quot;in vitro&quot; ou &quot;cultura&quot; em 2013/04/29 e 2013/04/30. Dessas publicações, 23,5% usaram ensaios de contagem de células, incluindo a contagem de número de células manuais, o número de células automatizado conta com software de imagem, e azul exclusão Trypan. O ensaio vivo / morto foi utilizada em 1% destas publicações. O número de publicações com o MTT (brometo de 3 - (4,5-dimetiltiazol-2-il) -2,5-difeniltetrazólio) para ensaio de viabilidade metabólica foi de 11%. Esta pesquisa da literatura também mostra que o número de publicações, utilizando ensaios tais como o MTT em conjunto com os ensaios de contagem de células foi de 3,5%. Apesar da tendência de usar um teste de viabilidade, por si só, avaliar a função celular em combinação com o número de células parece ser a melhor escolha para avaliar i celularntegrity. A contagem celular por si só não é suficiente, porque as células remanescentes poderão não ser funcional ou saudável, embora eles estejam presentes no poço 1,2. Por outro lado, as medidas funcionais, tais como o ATP pode aumentar ou diminuir, na ausência de mudanças paralelas no número de células. O desacoplamento de leituras metabólicas a partir do número de células sugere que o ATP e ensaios MTT nunca deve ser usada como o único ensaio de viabilidade. No presente relatório, três ensaios de viabilidade que pesquisamos ambas as estruturas celulares e função metabólica são descritos, para uma visão mais abrangente da integridade celular de um ensaio por si só, qualquer pode pagar. Dois dos nossos ensaios requerem um imageador infravermelho que mede a fluorescência em 700 nm e 800 canais. O ruído é baixo nos comprimentos de onda infravermelhos, levando ao aumento de sinal-para-ruído relações 3. O gerador de imagens Odyssey que usamos tem uma gama dinâmica 4,5 log e uma profundidade de bits de 16, Translating a 2 16 ou 65.536 tons de infravermelho. Isto pode ser contrastado de imagens a cores de 8 bits, que só oferece 2 8 ou 256 tons de cor para cada comprimento de onda. Assim, a imagem de 16 bits tem resolução mais fina. Deve notar-se que as imagens de infravermelhos originais são frequentemente pseudocolored verde (800 nm) e vermelha (700 nm) em relatórios publicados para apresentação. Imageadores Odyssey são comumente usados ​​tanto para Western blot e In-Cell Westerns 4-7. Em-Cell Westerns em células fixadas em formaldeído usar anticorpos primários contra qualquer proteína de interesse e classificá-los por sua vez, com anticorpos secundários fluorescentes infravermelhos. Esta técnica é conhecida por ser particularmente útil para terminais de fosforilação 6. Na nossa No celular Westerns, que corar as células fixas para as proteínas do citoesqueleto α-tubulina ou a microtúbulos neuronal proteína associada 2 (MAP2) no canal de 800 nm. Estas proteínas são suficientemente abundante para originar elevadas relações sinal-para-ruído. Também manchar nossos pratos no 700nm canal para núcleos com a mancha DRAQ5 e para o citoplasma com a mancha Sapphire. Ambas as proteínas do citoesqueleto e os DRAQ5 + safira manchas assim reflectir estruturas celulares. O ensaio terceiro viabilidade mede a função metabólica e é chamado de &quot;celular Titer Glo.&quot; Neste ensaio baseado luciferase, os valores de luminescência estão em proporção direta com os níveis de ATP. Os ensaios de ATP são comumente usados ​​para quantificar as células viáveis ​​8-12. No entanto, a inclusão da palavra &quot;título&quot; no nome do ensaio é um tanto inapropriado porque saída ATP por célula pode mudar como uma função do tratamento a toxina e é, por conseguinte, não é sempre, em proporção ao número de células 8. Níveis de ATP também pode ser afetada por ritmos circadianos 13 e 14 por divisão celular e diferenciação celular 15. No entanto, o ensaio de ATP mostrado aqui é simples de executar e útil porque o ATP é uma medida robusta de metabólicaviabilidade 16-21, se não o número de células em si. Usando este ensaio para complementar o infravermelho no celular Westerns, portanto, produz uma visão mais abrangente da integridade celular do que qualquer um ensaio sozinha.

<table><tbody><tr><td>Cell Titer Glo</td><td>Promega</td><td>G7572</td><td>Compre em quantidades de 100 ml e alíquota, em vez de comprar a quantidade mais cara de 10 ml. Reagentes reconstituídos e não utilizados podem ser recongelados a -20 &graus; C por pelo menos 21 semanas</td></tr><tr><td>18% Formalina</td><td>Thermo-Shandon</td><td>9990244</td><td>A compra deste fixador evita a pesagem dos pós de formaldeído e a fervura da solução; a exposição a vapores é assim minimizada</td></tr><tr><td>Sacarose</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S0389</td><td>Não é essencial adicioná-lo às soluções de formaldeído, mas melhora a aparência das células fixas</td></tr><tr><td>Odyssey Block</td><td>LI-COR</td><td>927-40003</td><td>Este soro de peixe pode ser comprado a granel e congelado a -20 & C para uso a longo prazo</td></tr><tr><td>Triton-X 100</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>21568</td><td>Armazenamos uma solução estoque de 10% Triton-X 100 em água estéril a 4 &graus; C</td></tr><tr><td>Fosfato de Sódio Monobásico</td><td>Fisher</td><td>S468</td><td>Também se pode comprar comprimidos de PBS ou soluções de PBS 10x, mas são mais caros</td></tr><tr><td>Fosfato de Sódio Dibásico</td><td>Fisher</td><td>S373</td><td>Veja acima</td></tr><tr><td>Azida de Sódio (250x)</td><td>Ricca Chemical Company</td><td>7144.8-16</td><td>Não compre o pó porque a azida de sódio é muito tóxica. Armazenamos todos os nossos anticorpos usados em 1x azida de sódio a 4 &graus; C até que sejam contaminados com detritos</td></tr><tr><td>Camundongo anti-&alfa;-tubulina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T5168</td><td>Este anticorpo é caro, mas pode ser muito diluído e é altamente específico</td></tr><tr><td>Camundongo anti-MAP2</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M9942</td><td>Este anticorpo é caro, mas é altamente específico (um pré-requisito para In-Cell Westerns)</td></tr> <tr><td>800 nm Cabra anti-camundongo IgG</td><td>LI-COR</td><td>926-32210</td><td>Outras empresas também vendem anticorpos secundários infravermelhos. Certifique-se de comprar os anticorpos altamente adsorvidos e observe que as concentrações de IgGs podem variar de acordo com a fonte</td></tr><tr><td>DRAQ5</td><td>Biostatus</td><td>DR50200</td><td>Este composto costumava ser vendido pela LI-COR a 1</td></tr><tr><td>mM Sapphire</td><td>LI-COR</td><td>928-40022</td><td></td></tr><tr><td>Luminômetro</td><td>PerkinElmer</td><td>VICTOR3 1420 contador</td><td></td>multirótulo</tr><tr><td>Odyssey Imager</td><td>LI-COR</td><td>9201-01</td><td></td></tr><tr>Produtos <td>de Pesquisa</td><td>Shaker / Mixer</td><td>International 248555</td><td></td></tr></tbody></table>

ensaios de viabilidade para células em cultura

Viability Assays for Cells in Culture

Contagens de células do manual sobre um microscópio são um meio sensível de avaliar a viabilidade celular, mas são consumidoras de tempo e, por conseguinte, caros. Ensaios de viabilidade computadorizados são caros em termos de equipamento, mas pode ser mais rápido e mais objetivo do que a contagem de células manuais. O presente relatório descreve o uso de três desses ensaios de viabilidade. Dois destes ensaios são infravermelhos e um é luminescente. Ambos os ensaios infravermelhos dependem de um Imager 16 bits Odyssey. Um ensaio de infravermelho usa a mancha DRAQ5 para núcleos combinados com a mancha Sapphire para citosol e é visualizado no canal 700 nm. O outro ensaio de infravermelhos, uma In-Cell Ocidental, utiliza anticorpos contra as proteínas do citoesqueleto (α-tubulina ou do microtúbulo associado à proteína 2) e rotula no canal de 800 nm. O terceiro ensaio de viabilidade é um ensaio luminescente utilizada para o ATP, mas que utilizam um quarto do volume recomendado para economizar no custo. Estas medições são todos linear e correlacionam-se com o número de cells chapeado, mas variam em sensibilidade. Todos os três ensaios de contornar microscopia demorado e amostrar todo o bem, reduzindo assim o erro de amostragem. Finalmente, todos os ensaios facilmente pode ser completada dentro de um dia do final da experiência, o que permite um maior número de experiências para ser executadas dentro de intervalos de tempo curtos. No entanto, todos eles contam com a suposição de que o número de células permanecem em proporção à intensidade do sinal depois de tratamentos, uma suposição de que, por vezes, não é cumprida, especialmente para ATP celular. Além disso, se as células de aumentar ou diminuir de tamanho após o tratamento, esta pode afectar a potência do sinal, sem afectar o número de células. Conclui-se que todos os ensaios de viabilidade, incluindo as contagens manuais, sofrem de uma série de ressalvas, mas que testes computadorizados de viabilidade são bem vale o investimento inicial. Usando todos os três ensaios em conjunto produz uma visão abrangente da estrutura e função celular.

O factor limitante da velocidade nestas experiências é a coloração de infravermelhos, como o ensaio de ATP é relativamente curta duração. Para os ensaios de infravermelhos, prevemos que oito placas de 96 poços pode ser corada e digitalizado no prazo de um dia após escalonamento dois lotes de quatro placas de cada (ver Figura 1). Esta estimativa assume 20 min de fixação, 30 min de lavagem, 30 min de bloqueio, 2 horas de incubação do anticorpo primário seguido por 30 min de lavagens, 1 hora de incubação a...

Os compostos terapêuticos são muitas vezes primeiro analisou in vitro com ensaios de viabilidade. Contagem de células cegos por um observador humano pode ser altamente sensível a pequenas alterações no número de células, mas não avaliar a função. Ensaios de viabilidade computadorizados, como descrito aqui, pode avaliar a estrutura e função de uma forma objectiva.

Ensaios de viabilidade para células em cultura

Manual cell counts on a microscope are a sensitive means of assessing cellular viability but are time-consuming and therefore expensive. Computerized ...

O objetivo geral deste procedimento é realizar múltiplos ensaios de viabilidade que forneçam uma visão mais abrangente da aptidão celular do que qualquer ensaio individual pode oferecer isoladamente. Isso é realizado primeiramente medindo os níveis de ATP em células cultivadas para avaliar a função metabólica. O segundo passo é imunomarcar proteínas do citoesqueleto, como alfa-tubulina ou proteína associada aos microtúbulos dois, utilizando anticorpos de infravermelho com comprimentos de onda de 800 nanômetros.Em seguida, as células são marcadas com drac cinco e safira para colorir o núcleo e o citoplasma em 700 nanômetros. O passo final é obter imagens da alfa tubulina ou mapa dois e do drac cinco mais safira em ambos os comprimentos de onda, 700 e 800 nanômetros, em um imageador de infravermelho. Em última análise, esses ensaios luminescentes e de infravermelho fornecem informações sobre estruturas anatômicas e função fisiológica.A principal vantagem dessas técnicas em relação aos métodos existentes, como o ensaio de viabilidade MTT, é a medição rápida e sensível de múltiplos aspectos da integridade celular. Esses métodos podem ajudar a responder perguntas fundamentais nas áreas de neurociência e farmacologia, como por exemplo se compostos terapêuticos podem proteger estruturas anatômicas e a função metabólica. Para iniciar, colete e re-suspenda as células em 100 ou 200 microlitros de meio, com diferentes densidades celulares, em uma placa de 96 poços conforme descrito no protocolo associado, preenchendo os poços periféricos com 200 microlitros de água estéril para reduzir os efeitos de evaporação nas bordas.Deixe as células aderirem durante a noite a 37 graus Celsius em uma incubadora com tampão de CO₂. No dia seguinte, remova 50 dos 100 microlitros de meio ou 150 dos 200 microlitros de meio, de modo a deixar 50 microlitros de meio em cada poço. Em seguida, adicione 25 microlitros do reagente Cell Titer Glow a cada um dos poços internos nas colunas dois a seis.Para obter uma diluição de um para dois nas colunas sete a onze, linhas B a D, adicione 50 microlitros do reagente Cell Titer-Glo para obter uma diluição de um para um nos poços restantes. Colunas sete a onze, linhas E a G. Não remova nenhum meio, mas adicione 100 microlitros do reagente Cell Titer-Glo para obter uma diluição de um para um num volume total de 200 microlitros. Coloque imediatamente a placa em um agitador rotativo ou orbital durante 10 minutos para misturar as amostras enquanto incubam.Em seguida, transfira 60 microlitros de cada poço para uma placa branca de 96 poços. Os valores de luminiscência são mais altos em placas brancas do que em placas transparentes ou pretas, porque refletem a luz para cima, em direção ao detector. Se bolhas se formarem durante a transferência, remova-as usando ar comprimido da pipeta plástica de transferência.Então, dentro de 12 minutos após a adição dos reagentes, coloque a placa em um luminômetro e leia os valores de luminiscência. Calcule a média dos valores luminiscentes das três ou seis poças em cada grupo e represente-os como uma função do número de células, prosseguindo com a maior diluição dos reagentes que ainda forneça resultados lineares e proporcionais, conforme definido no texto complementar. Isso reduzirá os custos dos ensaios infravermelhos, permitindo colher as células e re-suspenderem-nas em diferentes densidades, conforme descrito no protocolo do texto complementar.Encha as placas ao redor com 200 microlitros de água estéril para reduzir o efeito de gradientes de temperatura e evaporação nas bordas. Deixe as células aderirem durante a noite a 37 graus Celsius em uma incubadora com tampão de CO₂ e, em seguida, fixe as células adicionando 100 microlitros de um fixador, como 4% formaldeído e 4% sacarose em tampão fosfato 0,1 molar. Incube a placa à temperatura ambiente por 20 minutos, depois remova o fixador e lave as células três vezes com 200 microlitros de PBS.Em seguida, dilua a solução bloqueadora na proporção de um para um em PBS e adicione Triton X-100 0,3% como agente permeabilizante celular. Em seguida, adicione 35 microlitros da solução bloqueadora a cada poço, tomando cuidado para evitar a formação de bolhas nos poços. Incube a placa com a solução bloqueadora por 30 a 60 minutos à temperatura ambiente.Durante esta incubação, dilua os anticorpos primários para as proteínas de interesse. Por exemplo, dilua o anticorpo primário Antifa tubulina na proporção de um para 10.000 em uma mistura um para um de tampão bloqueador e PBS com 0,3% de TRITON X-100 durante a otimização do procedimento de teste. Nesta etapa, outras diluições de anticorpos também podem ser realizadas; o anticorpo primário Antifa tubulina é igualmente diluído na proporção de um para 5.000 em uma mistura um para um de tampão bloqueador e PBS com 0,3% de Triton X-100.Em seguida, adicione os anticorpos nas concentrações indicadas aqui às células fixadas na placa. Certifique-se de manter os poços do controle negativo na coluna dois na solução bloqueadora, pois eles serão expostos apenas aos anticorpos secundários. Incube as células com os anticorpos primários por uma a duas horas à temperatura ambiente ou durante a noite a quatro graus Celsius.Em seguida, prepare os anticorpos secundários anti-rato IgG de 800 nanômetros diluindo-os na proporção de um para 1000 ou um para 2000 em uma mistura um para um de tampão bloqueador e PBS com 0,3% de Triton X-100, após a incubação com o anticorpo primário. Lave as cavidades três vezes, durante 10 minutos cada, com 200 microlitros de PBS por cavidade. Em seguida, adicione 35 microlitros dos anticorpos secundários às cavidades.Adicione a diluição de um para 1000 à metade superior da placa e a diluição de um para 2000 à metade inferior. Incube as células nos anticorpos secundários por uma hora à temperatura ambiente, protegidas da luz. Em seguida, remova os anticorpos secundários não ligados com três lavagens de 10 minutos com PBS, utilizando 200 microlitros por poço a cada vez.Em seguida, dilua o estoque de DRAC cinco de um para 10.000, obtendo uma concentração final de 0,5 micromolar, e o estoque de safira de um para 1.000 em PBS com 0,3% de Triton X-100. Adicione 35 microlitros dessa mistura à metade esquerda da placa, mas não adicione nada aos poços do controle negativo na coluna dois. Para a metade direita da placa, adicione 35 microlitros de DRAC cinco diluído de um para 20.000 e safira diluída de um para 2.000.Incube nessas soluções por 30 minutos à temperatura ambiente e no escuro. Em seguida, lave a placa três vezes com 200 microlitros de PBS por poço, durante 10 minutos cada lavagem. Inicie escaneando as placas no sistema de imagem infravermelha com intensidade cinco e resolução de 169 micrômetros.Configurações de qualidade média ou baixa são suficientes. Em seguida, faça a varredura com diferentes deslocamentos de foco de 2,5 milímetros, 3,0 milímetros, 3,5 milímetros e 4,0 milímetros para verificar onde é obtida a maior relação sinal-ruído e um sinal nítido. Uma vez otimizado o deslocamento de foco, utilize a função incel western no software para posicionar a grade de tamanho adequado sobre a imagem da placa e exporte os dados para o Microsoft Excel.Subtraia a média das intensidades integradas nos poços de controle negativo de cada ponto de dados correspondente nos canais de 700 e 800 nanômetros. Em seguida, calcule a média das intensidades de sinal integradas para cada grupo de poços e represente os dados em um gráfico de dispersão em função da densidade celular após a otimização. A intensidade do sinal nos três ensaios apresentou correlação significativa com o número de células por poço, embora os três ensaios fossem altamente lineares, eles não foram equivalentes em sensibilidade.O ensaio de ATP demonstrou a maior sensibilidade entre os três, definida como a alteração mais proporcional da saída luminiscente com a redução do número de células em células neuronais primárias de rato. As concentrações ideais de reagentes foram diferentes e os ensaios apresentaram menor linearidade em toda a faixa do ensaio. No entanto, os ensaios foram ambos lineares e sensíveis em densidades de semeadura abaixo de 100.000 células, mostradas aqui.Nossas curvas de resposta à dose de células de neuroblastoma tratadas com MG 132, um inibidor do proteassoma, mostraram que o MG 132 foi aplicado na presença ou ausência do precursor da glutationa e da acetilcisteína. A N-acetilcisteína desloca as três curvas para a direita. Por exemplo, a IC50 medida pelo DRAC cinco mais safira foi de 1,64 micromolar de MG 132 sem N-acetilcisteína e de 4,64 micromolar de MG 132 na presença de N-acetilcisteína. Isso foi semelhante aos valores encontrados no ensaio de alfa-tubulina, de 1,96 micromolar e 6,35 micromolar de MG 132, respectivamente.No entanto, os níveis de ATP aumentaram em baixas concentrações de MG 132, um fenômeno denominado hormese. Esses dados revelam que os níveis de ATP nem sempre são proporcionais à titulação celular após o tratamento e que a N-acetilcisteína também pode proteger a função metabólica. Uma vez dominado o ensaio luminoso de ATP, ele pode ser concluído em até 30 minutos, e a coloração com infravermelho pode ser facilmente realizada em até oito horas.Ao realizar esses procedimentos, é importante lembrar que eles não medem o número de células da mesma forma que um microscópio de alta resolução. Por exemplo, uma ressalva é que os níveis da proteína alfa-tubulina ou os níveis de TP podem ser alterados pelos tratamentos na ausência de mudanças paralelas no número de células.

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