Name: Ensaios de viabilidade para células em cultura (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-01-20T13:45:00.000+00:00
Duration: 12 min 3 s
Description: Aprenda ensaios de viabilidade celular que combinam medição de ATP, imunomarcação de proteínas do citoesqueleto e imagem infravermelha para avaliar função metabólica e integridade estrutural de células em cultura.

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Reconhecemos Juliann Jaumotte para a idéia de poupar nos volumes de reagentes no ensaio ATP. Estamos profundamente gratos pelo apoio administrativo soberba de Maria Caruso, Deb Willson, e Jackie Farrer e para a Escola de Farmácia Mylan para a prestação de apoio financeiro para estes estudos. Agradecimentos também são devidos às Doenças Hunkele temido Fundação eo Parkinson e Distúrbios do Movimento da Fundação pelo apoio financeiro dos estudos neuronais primários.

Nenhum dos autores tem quaisquer conflitos de divulgar.

Verificou-se que a intensidade do sinal em todos os três ensaios de viabilidade é linear e correlacionada com a densidade do revestimento. No entanto, nem todos os ensaios são igualmente sensíveis a 2 vezes ou alterações de 1,5 vezes na densidade de revestimento. Para células N2a, os ensaios de infravermelhos são menos sensíveis do que o ensaio de ATP, particularmente a densidades mais baixas do chapeamento. Embora os ensaios de infravermelhos são menos sensíveis que o ATP, os DRAQ5 + Safira ensaios e ensaios α-tubulina...

O ensaio de viabilidade mais comum nas ciências biológicas envolve a contagem de células. Isto é evidenciado por uma análise das principais (mais recentes) 200 publicações que apareceram no PubMed com qualquer uma das palavras-chave &quot;in vitro&quot; ou &quot;cultura&quot; em 2013/04/29 e 2013/04/30. Dessas publicações, 23,5% usaram ensaios de contagem de células, incluindo a contagem de número de células manuais, o número de células automatizado conta com software de imagem, e azul exclusão Trypan. O ensaio vivo / morto foi utilizada em 1% destas publicações. O número de publicações com o MTT (brometo de 3 - (4,5-dimetiltiazol-2-il) -2,5-difeniltetrazólio) para ensaio de viabilidade metabólica foi de 11%. Esta pesquisa da literatura também mostra que o número de publicações, utilizando ensaios tais como o MTT em conjunto com os ensaios de contagem de células foi de 3,5%. Apesar da tendência de usar um teste de viabilidade, por si só, avaliar a função celular em combinação com o número de células parece ser a melhor escolha para avaliar i celularntegrity. A contagem celular por si só não é suficiente, porque as células remanescentes poderão não ser funcional ou saudável, embora eles estejam presentes no poço 1,2. Por outro lado, as medidas funcionais, tais como o ATP pode aumentar ou diminuir, na ausência de mudanças paralelas no número de células. O desacoplamento de leituras metabólicas a partir do número de células sugere que o ATP e ensaios MTT nunca deve ser usada como o único ensaio de viabilidade. No presente relatório, três ensaios de viabilidade que pesquisamos ambas as estruturas celulares e função metabólica são descritos, para uma visão mais abrangente da integridade celular de um ensaio por si só, qualquer pode pagar. Dois dos nossos ensaios requerem um imageador infravermelho que mede a fluorescência em 700 nm e 800 canais. O ruído é baixo nos comprimentos de onda infravermelhos, levando ao aumento de sinal-para-ruído relações 3. O gerador de imagens Odyssey que usamos tem uma gama dinâmica 4,5 log e uma profundidade de bits de 16, Translating a 2 16 ou 65.536 tons de infravermelho. Isto pode ser contrastado de imagens a cores de 8 bits, que só oferece 2 8 ou 256 tons de cor para cada comprimento de onda. Assim, a imagem de 16 bits tem resolução mais fina. Deve notar-se que as imagens de infravermelhos originais são frequentemente pseudocolored verde (800 nm) e vermelha (700 nm) em relatórios publicados para apresentação. Imageadores Odyssey são comumente usados ​​tanto para Western blot e In-Cell Westerns 4-7. Em-Cell Westerns em células fixadas em formaldeído usar anticorpos primários contra qualquer proteína de interesse e classificá-los por sua vez, com anticorpos secundários fluorescentes infravermelhos. Esta técnica é conhecida por ser particularmente útil para terminais de fosforilação 6. Na nossa No celular Westerns, que corar as células fixas para as proteínas do citoesqueleto α-tubulina ou a microtúbulos neuronal proteína associada 2 (MAP2) no canal de 800 nm. Estas proteínas são suficientemente abundante para originar elevadas relações sinal-para-ruído. Também manchar nossos pratos no 700nm canal para núcleos com a mancha DRAQ5 e para o citoplasma com a mancha Sapphire. Ambas as proteínas do citoesqueleto e os DRAQ5 + safira manchas assim reflectir estruturas celulares. O ensaio terceiro viabilidade mede a função metabólica e é chamado de &quot;celular Titer Glo.&quot; Neste ensaio baseado luciferase, os valores de luminescência estão em proporção direta com os níveis de ATP. Os ensaios de ATP são comumente usados ​​para quantificar as células viáveis ​​8-12. No entanto, a inclusão da palavra &quot;título&quot; no nome do ensaio é um tanto inapropriado porque saída ATP por célula pode mudar como uma função do tratamento a toxina e é, por conseguinte, não é sempre, em proporção ao número de células 8. Níveis de ATP também pode ser afetada por ritmos circadianos 13 e 14 por divisão celular e diferenciação celular 15. No entanto, o ensaio de ATP mostrado aqui é simples de executar e útil porque o ATP é uma medida robusta de metabólicaviabilidade 16-21, se não o número de células em si. Usando este ensaio para complementar o infravermelho no celular Westerns, portanto, produz uma visão mais abrangente da integridade celular do que qualquer um ensaio sozinha.

<table><tbody><tr><td>Cell Titer Glo</td><td>Promega</td><td>G7572</td><td>Compre em quantidades de 100 ml e alíquota, em vez de comprar a quantidade mais cara de 10 ml. Reagentes reconstituídos e não utilizados podem ser recongelados a -20 &graus; C por pelo menos 21 semanas</td></tr><tr><td>18% Formalina</td><td>Thermo-Shandon</td><td>9990244</td><td>A compra deste fixador evita a pesagem dos pós de formaldeído e a fervura da solução; a exposição a vapores é assim minimizada</td></tr><tr><td>Sacarose</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S0389</td><td>Não é essencial adicioná-lo às soluções de formaldeído, mas melhora a aparência das células fixas</td></tr><tr><td>Odyssey Block</td><td>LI-COR</td><td>927-40003</td><td>Este soro de peixe pode ser comprado a granel e congelado a -20 & C para uso a longo prazo</td></tr><tr><td>Triton-X 100</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>21568</td><td>Armazenamos uma solução estoque de 10% Triton-X 100 em água estéril a 4 &graus; C</td></tr><tr><td>Fosfato de Sódio Monobásico</td><td>Fisher</td><td>S468</td><td>Também se pode comprar comprimidos de PBS ou soluções de PBS 10x, mas são mais caros</td></tr><tr><td>Fosfato de Sódio Dibásico</td><td>Fisher</td><td>S373</td><td>Veja acima</td></tr><tr><td>Azida de Sódio (250x)</td><td>Ricca Chemical Company</td><td>7144.8-16</td><td>Não compre o pó porque a azida de sódio é muito tóxica. Armazenamos todos os nossos anticorpos usados em 1x azida de sódio a 4 &graus; C até que sejam contaminados com detritos</td></tr><tr><td>Camundongo anti-&alfa;-tubulina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T5168</td><td>Este anticorpo é caro, mas pode ser muito diluído e é altamente específico</td></tr><tr><td>Camundongo anti-MAP2</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M9942</td><td>Este anticorpo é caro, mas é altamente específico (um pré-requisito para In-Cell Westerns)</td></tr> <tr><td>800 nm Cabra anti-camundongo IgG</td><td>LI-COR</td><td>926-32210</td><td>Outras empresas também vendem anticorpos secundários infravermelhos. Certifique-se de comprar os anticorpos altamente adsorvidos e observe que as concentrações de IgGs podem variar de acordo com a fonte</td></tr><tr><td>DRAQ5</td><td>Biostatus</td><td>DR50200</td><td>Este composto costumava ser vendido pela LI-COR a 1</td></tr><tr><td>mM Sapphire</td><td>LI-COR</td><td>928-40022</td><td></td></tr><tr><td>Luminômetro</td><td>PerkinElmer</td><td>VICTOR3 1420 contador</td><td></td>multirótulo</tr><tr><td>Odyssey Imager</td><td>LI-COR</td><td>9201-01</td><td></td></tr><tr>Produtos <td>de Pesquisa</td><td>Shaker / Mixer</td><td>International 248555</td><td></td></tr></tbody></table>

ensaios de viabilidade para células em cultura

Viability Assays for Cells in Culture

Contagens de células do manual sobre um microscópio são um meio sensível de avaliar a viabilidade celular, mas são consumidoras de tempo e, por conseguinte, caros. Ensaios de viabilidade computadorizados são caros em termos de equipamento, mas pode ser mais rápido e mais objetivo do que a contagem de células manuais. O presente relatório descreve o uso de três desses ensaios de viabilidade. Dois destes ensaios são infravermelhos e um é luminescente. Ambos os ensaios infravermelhos dependem de um Imager 16 bits Odyssey. Um ensaio de infravermelho usa a mancha DRAQ5 para núcleos combinados com a mancha Sapphire para citosol e é visualizado no canal 700 nm. O outro ensaio de infravermelhos, uma In-Cell Ocidental, utiliza anticorpos contra as proteínas do citoesqueleto (α-tubulina ou do microtúbulo associado à proteína 2) e rotula no canal de 800 nm. O terceiro ensaio de viabilidade é um ensaio luminescente utilizada para o ATP, mas que utilizam um quarto do volume recomendado para economizar no custo. Estas medições são todos linear e correlacionam-se com o número de cells chapeado, mas variam em sensibilidade. Todos os três ensaios de contornar microscopia demorado e amostrar todo o bem, reduzindo assim o erro de amostragem. Finalmente, todos os ensaios facilmente pode ser completada dentro de um dia do final da experiência, o que permite um maior número de experiências para ser executadas dentro de intervalos de tempo curtos. No entanto, todos eles contam com a suposição de que o número de células permanecem em proporção à intensidade do sinal depois de tratamentos, uma suposição de que, por vezes, não é cumprida, especialmente para ATP celular. Além disso, se as células de aumentar ou diminuir de tamanho após o tratamento, esta pode afectar a potência do sinal, sem afectar o número de células. Conclui-se que todos os ensaios de viabilidade, incluindo as contagens manuais, sofrem de uma série de ressalvas, mas que testes computadorizados de viabilidade são bem vale o investimento inicial. Usando todos os três ensaios em conjunto produz uma visão abrangente da estrutura e função celular.

O factor limitante da velocidade nestas experiências é a coloração de infravermelhos, como o ensaio de ATP é relativamente curta duração. Para os ensaios de infravermelhos, prevemos que oito placas de 96 poços pode ser corada e digitalizado no prazo de um dia após escalonamento dois lotes de quatro placas de cada (ver Figura 1). Esta estimativa assume 20 min de fixação, 30 min de lavagem, 30 min de bloqueio, 2 horas de incubação do anticorpo primário seguido por 30 min de lavagens, 1 hora de incubação a...

Os compostos terapêuticos são muitas vezes primeiro analisou in vitro com ensaios de viabilidade. Contagem de células cegos por um observador humano pode ser altamente sensível a pequenas alterações no número de células, mas não avaliar a função. Ensaios de viabilidade computadorizados, como descrito aqui, pode avaliar a estrutura e função de uma forma objectiva.

Ensaios de viabilidade para células em cultura

Manual cell counts on a microscope are a sensitive means of assessing cellular viability but are time-consuming and therefore expensive. Computerized ...

O objetivo geral deste procedimento é realizar múltiplos ensaios de viabilidade que forneçam uma visão mais abrangente da aptidão celular do que qualquer ensaio individual pode oferecer isoladamente. Isso é realizado primeiramente medindo os níveis de ATP em células cultivadas para avaliar a função metabólica. O segundo passo é imunomarcar proteínas do citoesqueleto, como alfa-tubulina ou proteína associada aos microtúbulos dois, utilizando anticorpos de infravermelho com comprimentos de onda de 800 nanômetros.Em seguida, as células são marcadas com drac cinco e safira para colorir o núcleo e o citoplasma em 700 nanômetros. O passo final é obter imagens da alfa tubulina ou mapa dois e do drac cinco mais safira em ambos os comprimentos de onda, 700 e 800 nanômetros, em um imageador de infravermelho. Em última análise, esses ensaios luminescentes e de infravermelho fornecem informações sobre estruturas anatômicas e função fisiológica.A principal vantagem dessas técnicas em relação aos métodos existentes, como o ensaio de viabilidade MTT, é a medição rápida e sensível de múltiplos aspectos da integridade celular. Esses métodos podem ajudar a responder perguntas fundamentais nas áreas

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JoVE Journal

Biology

Biologia

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Muitas vezes é necessário avaliar a citotoxicidade potencial de um conjunto de compostos em células cultivadas. Aqui, nós descrevemos uma estratégia para tela confiável para compostos tóxicos em um formato 96-well.

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Aqui, nós apresentamos diversos métodos simples para avaliar a viabilidade e a morte em spheroids da pilha de cancro 3D, que imitam os gradientes physico-químicos de tumores in vivo muito melhor do que a cultura 2D. O modelo esferóide, portanto, permite a avaliação da eficácia do câncer de drogas com melhor tradução para as condições in vivo.

Avaliando a viabilidade celular e morte em 3D culturas esferóides de células cancerosas

Este protocolo demonstra métodos para permitir a cultura in vitro estendida de xenoenxertos derivados do paciente (PDX). Um passo aumenta a viabilidade geral das culturas de cluster multicelulares em hidrogéis 3D, através da remoção direta de células únicas não viáveis. Um passo secundário demonstra as melhores práticas para a cultura PDX em uma plataforma microfluida perfumada.

Viabilidade aprimorada para culturas de hidrogel 3D Ex vivo de xenoenxertos derivados do paciente em uma plataforma microfluida perfusada

Este protocolo apresenta ensaios de citotoxicidade comumente utilizados (ensaios de Alamar Blue [AB], CFDA-AM, Neutral Red e MTT) adaptados para a avaliação da citotoxicidade em linhagens celulares de embrião de peixe-zebra (ZEM2S) e fígado (ZFL) em placas de 96 poços.

Ensaios de citotoxicidade com linhagens celulares de peixe-zebra

Aqui, apresentamos um protocolo para quantificar a sobrevivência pós-estresse em amostras de leveduras. O ensaio emprega dois corantes fluorescentes, SYTO 9 e iodeto de propídio (PI), para quantificar a integridade da membrana plasmática. Ele usa citometria de fluxo para fornecer estimativas quantitativas e reprodutíveis das frações de células vivas, mortas e danificadas para amostras de estresse pós-oxidativo.

Um ensaio LIVE/DEAD otimizado acoplado à citometria de fluxo para quantificar a sobrevivência pós-estresse em células de levedura

Aprenda ensaios de viabilidade celular que combinam medição de ATP, imunomarcação de proteínas do citoesqueleto e imagem infravermelha para avaliar função metabólica e integridade estrutural de células em cultura.

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