Name: A cultura de células epiteliais nasais Humano na interface ar líquido (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-10-08T17:30:00.000+00:00
Duration: 10 min 38 s
Description: Aprenda a cultivar células epiteliais nasais humanas na interface ar-líquido para criar modelos de mucosa respiratória diferenciados. Este método permite estudar respostas epiteliais in vitro de forma não invasiva.

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Os autores gostariam de agradecer a Lisa Dailey para as entradas úteis. Este trabalho foi financiado por subvenções dos Institutos Nacionais de Saúde (ES013611 e HL095163), o Flight Attendant Instituto de Pesquisa Médica (FAMRI) e da Agência de Proteção Ambiental (CR83346301) e declara não há conflito de interesse. O conteúdo é de responsabilidade exclusiva de seus autores e não representam, necessariamente, a posição oficial do National Institutes of Health. Embora a pesquisa descrita neste artigo foi financiado em parte pela Agência de Proteção Ambiental dos EUA através de um acordo de cooperação CR83346301 com o Centro de Medicina Ambiental, Asma e Biologia pulmão da Universidade da Carolina do Norte em Chapel Hill, que não tenha sido submetido ao A agência do exigido pelos pares e revisão de políticas e, portanto, não refletem necessariamente a opinião da agência, e nenhum endosso oficial deve ser inferida. Mencione onomes comerciais de f ou produtos comerciais não constituem endosso ou recomendação para o uso. Loretta Müller é apoiado pela National Science Foundation suíço com uma doação pessoal.

1. Prepare Plastic Ware: Brasão Placa <ol><li> Adicionar 500 ul PureCol (1:100 diluído em água esterilizada) para cada poço de uma placa de 12 poços. </li><li> Incubar a 37 ° C numa incubadora durante 30 min, remover o PureCol e enxagua-se com HBSS a direita antes as células são adicionadas à placa (ver passo 3.1). </li></ol> 2. Obtenção e pré-tratamento de Biópsia de CNE Humano <ol><li> Biópsia raspar Nasal <ol><li> Obter ECs superficiais que revestem os cornetos nasais sob visão direta através de um espéculo nasal polipropileno reutilizável 9 mm (modelo 22009) em um otoscópio operacional com espéculo (modelo 21700). Este dispositivo proporciona melhor visualização dos cornetos nasais e flexibilidade de movimento. </li><li> Execute as biópsias com o indivíduo sentado ereto em uma cadeira de encosto reto com a cabeça inclinada ligeiramente para trás ou deitado em decúbito dorsal sobre uma mesa de exame. </li><li> Insira o espéculo otoscópio na narina ea Turbi inferiornate visualizado com iluminação. </li><li> Inserir uma cureta termoplástico estéril através do espéculo com a ponta estendida distal à volta da concha. </li><li> Usando uma leve pressão sobre a superfície inferior da concha, a cureta é traçada através da superfície da mucosa 5x e retraída. A recuperação bem sucedida de células da mucosa detidas por ação capilar será evidente no copo da cureta. </li></ol></li><li> Colocar a amostra em um tubo de 15 ml contendo 8 ml de RPMI 1640, o transporte de gelo. </li><li> Use uma pinça para recuperar a sonda, desalojar tecido da sonda rinoceronte com uma pipeta P-1000, descarte sonda </li><li> Centrífuga para sedimentar (4 ° C, 400 xg, 5 min), o sobrenadante aspirado (atenção: cuidado para não aspirar o pellet). </li><li> Ressuspender o sedimento em 1 ml BEGM com 10 ul de DNase 1 100x. </li><li> Incubar à temperatura ambiente durante 20 min. </li><li> Centrífuga (4 ° C, 400 xg, 5 min), NÃO aspirar o sobrenadante! </li></ol> 3. Seed as células em plástico (Dia 0) <ol><li> Remover o PureCol a partir da placa e enxaguar com HBSS (ver também o passo 1.2). </li><li> Adicionar um volume mínimo de BEGM media + + (80-100 ul, até que um menisco de meios de entrada aparece no centro do poço) para poços de 1-4 (dependendo do tamanho da biópsia) da chapa revestida. </li><li> Use uma pipeta P-1000 para remover cuidadosamente o sedimento do tecido da biópsia do tubo, sem aspiração demais meios de comunicação. </li><li> Transfira o granulado para o meio dos poços, manter a biópsia juntamente como um aglomerado de células, e não se rompem para fazer uma suspensão de células individuais. Um bom rendimento de biópsia até quatro poços que podem ser semeadas. Colocar a placa na incubadora de cultura de tecidos (37 ° C, 5% de CO 2,&gt; 90% de humidade relativa). </li><li> Verificar depois de duas horas para assegurar que não há meios de suficiente (sem perturbar o menisco). </li><li> Day1, 24 hr pós-semeadura: coletar todas as células não aderentes de todos os poços (placa de inclinação e recolher mídia com células em um P-1000, collect todos os poços em um tubo de centrífuga de 1,5 ml). </li><li> Centrífuga (4 ° C, a 400 x g, 5 min). </li><li> Enquanto centrifugação suspensão celular: cerca de 250 ul de BEGM + + e 250 ul de mistura media BEGM + para as células semeadas no dia 0. </li><li> Repita os passos de 3,1-3,5 para as células não-aderentes. </li><li> Dia 2-5: mídia alteração das células diárias; adicionar 500 media ul a cada poço, reduzir a quantidade de BEGM + + media por etapas (dia 2 após a semeadura: 125 mL BEGM + + plus 375 mL BEGM +, dia3 após a semeadura e os seguintes dias: 73 ul BEGM + +, mais 427 ul BEGM +). </li></ol> 4. Expansão das células nos frascos <ol><li> Monitorar as células diariamente, uma vez que eles chegaram a 80-90% de confluência (geralmente 5-7 dias após a biópsia, se demorar mais tempo eles não vão crescer com sucesso), as células de elevação da seguinte forma: a mídia cuidadosamente aspirado, adicione 500 mL de tripsina a 0,25% por poço, mantê-los a 37 ° C até as células são separadas (que normalmente leva 2-3 min). </li><li> Prepare a necessidadeed volume de feijão de soja de Inibidor de Tripsina (SBTI) (750 ul por 1 ml de tripsina) em um tubo de 15 ml. </li><li> Desalojar células por pipetagem cima e para baixo várias vezes a solução de tripsina; transferência de células isoladas no tubo cônico de 15 ml com SBTI. </li><li> Lavar todos os poços com um total de 1 ml de HBSS, adiciona HBSS para o tubo com as células. </li><li> Centrífuga para sedimentar (4 ° C, 400 xg, 5 min), aspirar a mídia, ressuspender em 1 ml + media BEGM e vortex o tubo. </li><li> Expandir as células em um frasco T25 ou T75, dependendo do tamanho da pelota (esta é p1; cerca de dois poços confluentes entrar em um frasco T75, um confluente bem é o suficiente para uma T25, geralmente 2 poços confluentes deu um T75). <ol><li> Adicionar BEGM + aos balões (5 ml de cada vez para um T75, 3 ml de cada uma para um T25). </li><li> Adicionar a suspensão de células para os frascos. Transferir os frascos num incubador de cultura de tecido. </li></ol></li><li> 24 horas pós-balão de semeadura: adicionar mídia adicional BEGM + para o balão (3 ml para um T25, 10 ml a um T75). </li><li><strong&gt; manter as células em frascos: Remova a mídia (aspirado a partir do canto) e adicionar BEGM + media (5 ml/T25, 20 ml/T75). A mídia precisa ser trocado a cada 2-3 dias. Manter as células do frasco até que sejam aproximadamente 80% confluentes (confluência pode não ser uniforme em toda a garrafa inteira; normalmente esta demora entre 7-10 dias, se eles não são confluentes depois de 10 dias, eles não irão crescer com sucesso). </li></ol> 5. Semente as células em cultura de tecidos Inserções <ol><li> Remova a mídia do frasco e adicione tripsina (3 ml para T25, 4 ml para frasco T75). </li><li> Incubar a 37 ° C até as células são separadas (aproximadamente 2-3 minutos). </li><li> Prepare SBTI (750 ul por 1 ml de tripsina&gt; 2,25 ml para T25, T75 para 3 ml) num tubo de 15 ml. </li><li> Desalojar células gravando o frasco e pipetando para cima e para baixo e transferir para tubo cônico com o SBTI. </li><li> Lavar o balão com HBSS (1 ml para T25, 2 ml para T75), adicione o HBSS para o tubo de 15 ml. </li><li> Centrifugadorpara sedimentar (4 ° C, a 400 x g, 5 min), remover o sobrenadante cuidadosamente. </li><li> Prepare as placas: decidir quantas placas vão ser semeado, rotular as placas com código de amostra e número, número de passagens (ou seja, p2) e data. Adicionar 700 ul BEGM + meios de comunicação para a câmara de basal. </li><li> Ressuspender o sedimento de células em 1 ml de meio BEGM ALI em vortex do tubo. </li><li> Contar as células com um hemocitómetro (um T25 geralmente produz cerca de 4 milhões de células, um T75 pode ter até 20 milhões de células em função do ilhéu; utilizar de 1-2 milhões de células para uma placa de 12 poços) e dilui-se a suspensão de células com mídia BEGM Ali para o volume total necessário para a quantidade de placas que deve ser semeado (1,2 x 10 6 células em 2,5 ml de mídia por placa) (Nota:. Se parte das células quer ser congelado, o rótulo do tubo e remover as células aqui: nós geralmente congelar 2 x 10 6 células em 2 ml de meio de congelamento) </li><li> Adicionar 200 ul de suspensão de célula para o lado apical de cada célula Corning 12well não revestidoinserir (&gt; este será de cerca de 80,000-150,000 células / inserção; 12 transwells mm com 0,4 mM poros poliéster (Polietileno Tereftalato (PET)) insert membrana); transferir para cultura de tecidos incubadora. </li><li> Após 24 horas, alterar a mídia apical (200 mL meio de expansão). </li><li> A manutenção de culturas de células: Troque a mídia (media BEGM ALI; 700 mL basolateral e apical de 200 mL) a cada dois dias. Inserções tem que ser mantida submersa até que as células são totalmente confluente (sem buracos em monocamada são visíveis). Dependendo do número de células isso geralmente leva entre 2-6 dias, se leva mais tempo as células provavelmente não será viável. </li></ol> 6. Estabelecer Ar Líquido de Interface Uma vez que as células são completamente confluente (Quando as células na Transwells são completamente confluente) <ol><li> Uma vez que as células são completamente confluentes substituir ambos os meios apical e basolateral com a mídia BEGM ALI suplementadas com ácido retinóico 500nM para 48 horas. </li><li> 48 horas após a adição do ácido retinóico suplementado mídia BEGM ALI: Preparar PneumaCult-ALI Meio de Manutenção (instruções seguinte do fabricante): Calcular o volume de meio necessário (para uma placa geralmente de 8,5 ml para os compartimentos basais); adicionar por 1 ml PneumaCult Meio Completo Base de Dados : 10 ul PneumaCult 100x Suplemento Manutenção 2 uL de heparina (de uma solução de estoque a 2 mg / ml) 5 ul de hidrocortisona (de uma solução mãe de 96 ul / ml). </li><li> Remova toda a mídia e adicionar 700 mL PneumaCult-ALI mídia manutenção para o lado basolateral apenas (sem meio no lado apical). </li><li> Manter as culturas de células durante 4 semanas no ALI: <ol><li> Troque a mídia a cada dois dias (segunda, quarta e sexta-feira agenda funciona bem para nós). </li><li> Depois de uma semana a LPA, uma vez por semana (quarta-feira) à superfície apical é lavado: adiciona-se 200 uL de HBSS ao lado apical, mantê-los durante 10 minutos na incubadora, aspirar cuidadosamente oHBSS (usar uma pipeta de vidro 9 em anexo para a armadilha de vácuo na câmara de segurança biológica, a utilização de 200 ul dicas sobre a ponta da pipeta para aspirar para fora da HBSS). </li></ol></li></ol> Nota: Alterar dicas entre as placas, bem como alterar as dicas quando vai da superfície apical contra basolateral. Após cerca de 2 semanas no ALI, as células começam a se diferenciar e cílios aparecem. As culturas celulares alcançar diferenciação completa após cerca de 4 semanas no ALI.

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</ol>

Os autores não têm nada a revelar.

ECs respiratórias fornecer não apenas uma barreira física para proteger o corpo humano a partir de estímulos exógenos 20, mas também funcionam como uma central para iniciar e regular as respostas de defesa imunológico respiratórias 1-3 através da secreção de mediadores solúveis ou interações célula-célula receptor-ligante diretos. A fim de estudar melhor o papel das células endoteliais na resposta imune, para examinar as diferenças de potencial entre os CEs a partir de populações de doentes, ou par...

Objetivo da técnica As células epiteliais (ECS) nas vias aéreas estão entre os primeiros locais a serem diretamente expostos a estressores ambientais inalados, tais como patógenos, alérgenos ou poluentes atmosféricos. ECs são mais do que uma barreira estrutural: Eles agem como uma central para iniciar e regular a resposta imune respiratório 1-3 através da liberação de mediadores solúveis 4-6 ea expressão de ligantes / receptores em sua surfac 7-9. Enquanto as linhas de células imortalizadas podem ser utilizados como modelos para estudar CEs respiratórias in vitro, eles não conseguem diferenciar-se em populações de células heterogéneas compostos de ciliado polarizada e as células produtoras de muco, semelhante ao que se observa in vivo. Para recapitular características importantes do epitélio respiratório observada in vivo, os CEs das vias primárias podem ser usadas. Portanto, nosso objetivo foi otimizar o nosso método utilizando nasal ECs (CNE) obtido de voluntários humanos. Os CNE são expandidas e cultivadas in vitro, produzindo um modelo de cultura de células de CNE diferenciadas que imita muitas das características do epitélio nasal visto in vivo. Análise racional O uso de modelos in vitro com células endoteliais humanas primárias imitando em situação vivo - como descrito neste estudo - dá possibilidades únicas para estudar diferenças de doenças específicas de ECs, parâmetros fisiológicos associados com o epitélio das vias aéreas, ou as interações entre células endoteliais e outros tipos de células, tais como células dendríticas 10, células natural killer 11 ou macrófagos. Vários métodos existentes utilizam CEs brônquicas, que podem ser obtidas de forma invasiva por meio de biópsias da escova durante broncoscopia, ou a partir de tecido de pulmão de outra forma descartadas 12-17. Além disso, as fontes comerciais para a obtenção de culturas de células das vias respiratórias humanas epiteliais completamente diferenciadas existir (modelo EpiAirway da MatTek, Ashland, MA, Cloneticsda Lonza, Basiléia, Suíça, a partir MucilAir Epithelix Sars, Genebra Suíça), onde os investigadores podem escolher entre diferentes doadores. No entanto, por causa do conjunto limitado de células epiteliais disponíveis comercialmente, ou limitadas conjunto prescrito de parâmetros, o custo associado com a obtenção comercialmente vias respiratórias humanas primárias ECs, e o acesso limitado a tecido pulmonar ou tecido descartado biópsia brônquica humana recentemente obtida, proibir muitos investigadores da realização de estudos em ECs vias aéreas humano totalmente diferenciadas. Por isso, nos propusemos a desenvolver uma técnica que irá 1) utilizar CNE humanos não-invasiva obtidos, 2) fornecer um protocolo produzindo culturas do epitélio das vias aéreas humano diferenciado, e 3) ser reprodutível na maioria dos ambientes de laboratório com uma infra-estrutura de cultura de tecido existente. Vantagens sobre as técnicas existentes / Modelos Obtenção CNE frescos, em comparação com brônquica ou pequenas vias aéreas ECs, é muito menos invasivo, individuaiss pode ser biópsia várias vezes, sem efeitos colaterais significativos, e superficiais biópsias raspar nasais podem ser realizadas em populações doentes que de outra forma não se qualificariam para bronchoscopies relacionadas com a investigação. Não-invasivos biópsias raspar superficiais para obter CNE permitir que o investigador para definir especificação doador a priori, incluindo idade, sexo, estado da doença, etc, de acordo com o objetivo da pesquisa a ser realizada. Assim, ao projetar estudos de investigação investigadores não estão limitados pelos tecidos clinicamente disponíveis / amostras epiteliais, comprar modelos de cultura de células diferenciadas caros de fornecedores comerciais, ou de projeto de broncoscopia estudos invasivos. Além disso, a facilidade de obter CNE aumenta a capacidade de realizar as experiências em células a partir de doadores diferentes, o que aumenta a validação estatística dos resultados observados. Por último, o nariz é um dos primeiros locais a serem expostas a qualquer tipo de estressores transmitidas pelo ar. Assim, a geração de organotípicas emsistemas de cultura in vitro que imitam o epitélio nasal são úteis para o estudo de inalação de partículas virais, poluentes, alérgeno, ou gases, que podem ser facilmente obtidos pela utilização deste sistema de cultura de células.

<table><tbody><tr><td>Espéculo nasal</td><td>Welch Allyn</td><td>Modelo 22009</td><td>9 mm, polipropileno reutilizável</td></tr><tr><td>Otoscópio cirúrgico</td><td>Welch Allyn</td><td>Modelo 21700</td><td></td></tr><tr><td>Cubeta de células de sonda de rinoceronte</td><td>Arlington Scientific</td><td>SY-96-092</td><td>dobre a cabeça da cubeta um pouco mais Placas de</td></tr><tr><td>cultura de 12 poços</td><td>Inserções de</td> cultura de células de membrana Corning <td>3512</td><td></td></tr><tr><td>Transwell</td><td>Corning</td><td>3460</td><td></td></tr><tr><td>Frasco de cultura de tecidos </td><td>Corning</td><td>430639 e 430641</td><td>T25 e T75 frasco ventilado</td></tr><tr><td>RPMI 1640 (com L-Glutamina)</td> <td>Gibco</td><td>11875</td><td></td></tr><tr><td>Meio de Crescimento de Células Epiteliais Bronquiais/Traqueais</td><td>aplicações de células</td><td>511-500</td><td></td></tr><tr><td>BEGM Meio de Crescimento de Células Epiteliais Bronquiais</td><td>Lonza</td><td>CC-3170</td><td>Isso vem como um kit de um frasco de meio e frascos com suplementos.</td></tr><tr><td>Solução de bicarbonato de sódio a 7,5%</td><td>Gibco</td><td>25080</td><td>Use como está.</td></tr><tr><td>NuSerum</td><td>BD Biosciences</td><td>355104</td><td>Use como está.</td></tr><tr><td>Mídia de congelamento BAMBANKER</td><td>BAMBANKER</td><td>302-14681</td><td>Use como está.</td></tr><tr><td>CoolCell </td><td>Biocision</td><td>HTBCS-136</td> <td>(recipiente de congelamento de células sem álcool CryoPrep)</td></tr> <tr><td>PureCol</td><td>AdvancedBioMatrix</td><td>5005-B</td><td>diluir 1:100 com água estéril (deve ser aproximadamente 0,03 mg / ml) use 500 &mu; l/poço de uma placa HBSS de 12 poços</td></tr><tr><td>com Ca2 e Mg2+</td><td>Gibco</td><td>14025</td><td></td></tr><tr><td>DNAse 1</td><td>Sigma</td><td>DN25</td><td>Dissolva a 1,5 mg/ml, que é uma solução 100x, adicione 10 &mu; l para cada ml de meio</td></tr><tr><td>Tripsina, 0,25%, 1x, com vermelho de fenol</td><td>Gibco</td><td>25200-056</td><td>Use nele é</td></tr><tr><td>Inibidor de Tripsina de Soja (SBTI)</td><td>Sigma</td><td>T6522</td><td>Use dissolvido em HBSS na concentração de 1 mg/ml</td></tr><tr><td>Ácido retinóico</td><td>Sigma</td><td>R7632</td><td>Composição 100 &mu; M solução estoque (veja abaixo), diluir para 10 &mu; M com álcool absoluto, tome 5 &mu; l deste e adicioná-lo a 1 ml de meio BEGM (nossa solução de trabalho). O retinol All-trans tem um coeficiente de extinção de 52.480 em etanol a 325 nm. Dissolver 25 mg em 50 ml de etanol absoluto. Diluições seriadas devem ser feitas, diluir 50 ml de reserva em 450 ml de etanol absoluto, tomar 50 ml deste, diluir em 450 ml de etanol absoluto, tomar 50 ml deste, diluir em 450 ml de etanol absoluto, e novamente tomar 50 ml deste, diluir em 450 ml de etanol absoluto, tomar 100 ml deste e diluir em 900 ml de etanol absoluto e ler no espectrofotómetro a 325 nm, esse número é então multiplicado por seu ' fator de diluição, então dividido pelo coeficiente de extinção de 52.480, isso dará um número em mM. Faça um estoque de 100 mM (armazene a -20 &deg; C) e a partir deste estoque é feita uma alíquota de 10 mM, o ácido retinóico diário necessário seria de 5 ml desta alíquota de 10 mM em meio ALI de 995 ml. Exemplo: a leitura de 325 nm é 1,15. 1,15 x 10.000 (fator de diluição) / 52.480 = 0,219 = 219 mM, faça um estoque de 100 mM a partir disso, em etanol absoluto.</td></tr><tr><td>DMEM glicose alta (1x), líquido, com L-glutamina e piruvato de sódio</td><td>Gibco</td><td>11995</td><td></td></tr><tr><td>Extrato de hipófise bovina</td><td>Gibco</td><td>13028-014</td><td>Usado para meios BEGM ALI.</td></tr><tr><td>Nistatina</td><td>Sigma</td><td>N4014-50 mg</td><td>Constituir uma solução de 3,3 mg/ml.</td></tr><tr><td>Albumina de soro bovino</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP1600-100</td><td>Faça uma solução de solução de 10 mg / ml em água miliQ.</td></tr><tr><td>PneumaCult-ALI media</td><td>StemCell</td><td>5001</td><td>Isso vem como um kit de um frasco de meio e frascos com suplementos. Para obter detalhes, veja abaixo.</td></tr><tr><td>Hidrocortisona </td><td>StemCell</td><td>7904</td><td>Dissolva 2,4 mg de hidrocortisona em 1 ml de ddH2O (usado para fazer a solução estoque de hidrocortisona 200x)</td></tr><tr><td>Heparina Sal de sódio em PBS (2 mg/ml)</td><td>StemCell</td><td>7980</td><td>Use nisso. </td></tr><tr><td>Balões filtrantes (500 ml)</td><td>Corning</td><td>431097</td><td>0,22 &mu; m tubos de filtro de tamanho de poro</td></tr><tr><td>(50 ml)</td><td>Millipore</td><td>SCGP00525</td><td>Steriflip, 0.22 &mu; Pontas de pipeta de tamanho de poro m</td></tr><tr><td>- Pontas de barreira ART</td><td>Bioprodutos moleculares</td><td>2139RI, 2069RI, 2179RI</td><td></td></tr><tr><td>Tubos cônicos, estéreis, 15 ml e 50 ml</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>ddH><2O, etanol absoluto, gelo</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>CO2 incubadora</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>centrífuga</td><td></td><td></td><td></td> refrigerada</tr>Pipetas de <tr>Cabine <td></td><td></td><td></td><td>de Segurança Biológica</td></tr><tr><td>(P2, P200, P1000), 9 pol. Pipetas de</td><td></td><td></td><td></td>vidro</tr><tr><td>Luvas</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Jaleco com punhos apertados</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><TD colspan="4"> <table border="1"> <tbody> <tr> <td>Mídia e soluções usadas:</td> <td>Receita</td> <td>Usado para</td> </tr> <tr> <td colspan="3">Observação geral: aqueça sempre o meio à temperatura ambiente</td> </tr> <tr> <td rowspan="2">BEGM media</td> <td><ul> <li> 500 ml de mídia de aplicação de células BEGM com uma alíquota de ácido retinóico</li></ul> </td> <td> (misture-os até a metade e filtre)</td> </tr> <tr> <td><ul><li> 500 ml de mídia BEGM Lonza com uma alíquota de suplementos de cota única </li></ul></td> <td>< UL><LI> digestão da biópsia</LI></UL> </TD> </TR> <TR> <TD rowspan="3">BEGM+ media</td> <td><ul><li> 50 ml BEGM Media </li></ul></td> <td><ul><li> mantendo células no plástico nas placas (passagem0) </li></ul></td> </tr> <tr> <td><ul><li> 10 &mu; L Ácido retinóico (solução de trabalho)</Li></ul> </td> <td><ul><li> semeando células no balão (passagem1; parcialmente)</li></ul> </td> </tr> <tr> <td></td> <td><ul><li> manter as células no balão </li></ul></td> </tr> <tr> <td rowspan="3">BEGM++ media</td> <td><ul><li> 50 ml Lonza' s Meios BEGM com suplementos</li></ul> </td> <td><ul><li> semeando células frescas em placa de 12 poços em plástico</li></ul> </td> </tr> <tr> <td><ul><li> 1 ml de bicarbonato de sódio</li></ul> </td> <td><ul> <li> células de manutenção nas placas de plástico (passage0; apenas parcialmente)</li></ul> </td> </tr> <tr> <td><ul><li> 2,5 ml NuSerum</li></ul> </td> <td><ul><li> semeando células no balão (passagem1; parcialmente)</li></ul> </td> </ tr> <tr> <td rowspan="5">BEGM ALI media</td> <td><ul><li> 250 ml DMEM-H </li></ul></td> <td rowspan="5"><ul><li> Manter as células no transwell antes que elas sejam ALI</li></ul> </td> </tr> <tr> <td><ul><li> 250 ml de BGB incluindo suplementos</li></ul> </td> </tr> <tr> <td><ul><li> 2 ml de extrato de hipófise bovina (solução de 12,5 mg/ml)</li></ul> </td> </tr> <tr> <td><ul> <li> 1 ml de nistatina (solução de 3,3 mg/ml)</li></ul> </td> </tr> <tr> <td><ul><li> 75 &mu; l BSA (solução de 10 mg/ml)</li></ul> </td> </tr> <tr> <td rowspan="5">200X Solução estoque de hidrocortisona (96 &mu; L/ml solução)</td> <td><ul><li> 200 &mu; l hidrocortisona dissolvida</li></ul> </td> <td rowspan="5"><ul><li> Como suplemento ao PneumaCult-ALI Complete Base Medium para o último dia no frasco e quando as células estão em inserções</li></ul> </td> </tr> <tr> <td><ul><li> 4250 &mu; l cloreto de sódio dissolvido </li></ul></td> </tr> <tr> <td><ul><li> 540 &mu; l ddH2O</li></ul> </td> </tr> <tr> <td><ul><li> 10 &mu; l etanol absoluto</li></ul> </td> </tr> <tr> <td>Filter solução através de 0,22 &mu; m filtro, solução de alíquota e armazenar a -20 & C, evite ciclos adicionais de congelamento/descongelamento</td> </tr> <tr> <td rowspan="3">PneumaCult-ALI Meio de base completo</td> <td><ul><li> 450 ml PneumaCult-ALI Basal Medium</li></ul> </td> <td><ul><li> Meio de base para todos os três meios de comunicação PneumaCult-ALI </ li></ul></td> </tr> <tr> <td><ul><li> 50 ml Suplemento PneumaCult 10x </li></ul></td> <td><ul><li> A mídia PneumaCult é sensível à luz, portanto, mantenha-a sempre no escuro</li></ul> </td> </tr> <tr> < TD> (isso é estável por 2 semanas em 2-8 &deg; C ou por até 6 meses a -20 &graus; C)</td> <td></td> </tr> <tr> <td rowspan="4">PneumaCult-ALI Maintenance Medium</td> <td>Por 1 ml de PneumaCult-ALI Complete Base Medium add:</td> <td rowspan="4">ALI cultura em inserções</td> </tr> <tr> <td><ul><li> 10 &mu; l PneumaCult 100x Maintenance Suplemento </li></ul></td> </tr> <tr> <td><ul><li> 2 &mu; l Heparina (de uma solução-mãe de 2 mg/ml) </li></ul></td> </tr> <tr> <td><ul><li> 5 &mu; l Hidrocortisona (de um 96 &mu; l/ml de solução-mãe) </li></ul></td> </tr> </tbody> </table> </td></tr></tbody></table>

a cultura de células epiteliais nasais humano na interface ar líquido

Culturing of Human Nasal Epithelial Cells at the Air Liquid Interface

Os modelos in vitro utilizando células epiteliais primárias humanas são essenciais para a compreensão das principais funções do epitélio respiratório no contexto de infecções microbianas ou agentes inalados. Comparações diretas de células obtidas de populações doentes nos permitem caracterizar diferentes fenótipos e dissecar os mecanismos subjacentes mediando mudanças na função da célula epitelial. A cultura de células epiteliais da região traqueobrônquica humana tem sido bem documentada, mas é limitado pela disponibilidade de tecido de pulmão humano ou invasividade relacionado com a obtenção das escovas biópsias brônquicas. Células epiteliais nasais são obtidos através de biópsias superficiais raspar nasal muito menos invasivos e os assuntos podem ser biopsiados várias vezes, sem efeitos colaterais significativos. Além disso, o nariz é o ponto de entrada para o sistema respiratório e, portanto, um dos primeiros locais a serem expostas a qualquer tipo de estressor transportada pelo ar, como agentes microbianos, poluentes, ou alérgenos. Resumidamente, as células epiteliais nasais obtidos a partir de voluntários humanos são expandidos em placas de cultura de tecidos revestidos, e em seguida transferida para inserções de cultura de células. Ao atingir a confluência, as células continuam a ser cultivadas na interface ar-líquido (ALI), durante várias semanas, o que cria condições mais fisiologicamente relevantes. A condição cultura ALI usa a mídia definidas levando a um epitélio diferenciado que apresenta características morfológicas e funcionais semelhantes ao epitélio nasal humano, com células ciliadas e mucosas tanto produzindo. Inserções de cultura de tecidos com células epiteliais nasais diferenciadas pode ser manipulado numa variedade de maneiras dependendo das questões de pesquisa (tratamento com agentes farmacológicos, de transdução com vectores lentivirais, a exposição a gases, ou infecção com agentes microbianos) e analisados ​​por numerosos pontos de extremidade diferentes, desde caminhos celulares e moleculares, ch funcionalanges, morfologia, etc Em modelos in vitro de células epiteliais nasais humanos diferenciados permitirá que os investigadores a abordar novas e importantes questões de pesquisa, utilizando modelos experimentais organotípicas que grande parte imitar o epitélio nasal in vivo.

CNE cultivadas seguindo o protocolo aqui descrito re-diferenciar-se em uma camada de células endoteliais heterogéneo composto por células ciliadas e não ciliadas, que representam a situação in vivo (Figura 1). Alguns dos CNE diferenciadas são muco produtores (células marcadas em azul usando AB / PAS, Figura 1B). Embora o protocolo aqui apresentado é optimizada, a diferenciação pode variar no que diz respeito à distribuição das populações totais de células (isto é, dife...

Células epiteliais nasais, obtidas através de biópsia superficial raspar de voluntários humanos, são expandidas e transferido para tecido inserções de cultura. Ao atingir a confluência, as células são cultivadas na interface ar-líquido, obtendo-se culturas de células ciliadas e não ciliadas. Culturas de células epiteliais nasais diferenciados fornecem modelos experimentais para o estudo de viáveis ​​da mucosa respiratória.

A cultura de células epiteliais nasais Humano na interface ar líquido

In vitro models using human primary  epithelial cells are essential in understanding key functions of the respiratory  epithelium in the context of ...

O objetivo geral deste procedimento é cultivar células epiteliais nasais indiferenciadas na interface ar-líquido. Isso é realizado primeiramente obtendo-se células epiteliais nasais superficiais de um voluntário humano. O segundo passo é semear as células em placas de cultura de tecidos e, em seguida, expandir as células em frascos. Em seguida, as células expandidas são semeadas em transwell e cultivadas até atingirem confluência. O passo final é remover o meio de cultura tecidual apical das culturas celulares confluentes nos transwell para estabelecer condições de cultura em interface ar-líquido. Em última análise, as células cultivadas nessa interface ar-líquido por três a quatro semanas irão readiferenciar-se em uma cultura de células epiteliais nasais mucociliadas, mimetizando o fenótipo do epitélio nasal in vivo.A principal vantagem desta técnica em relação a métodos existentes, como o cultivo de células epiteliais brônquicas ou a obtenção de células epiteliais respiratórias comercialmente disponíveis, é a capacidade do pesquisador de definir previamente a população da qual coletar as células epiteliais nasais. As biópsias nasais são muito menos invasivas do que as biópsias po

culturing-of-human-nasal-epithelial-cells-at-the-air-liquid-interface

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Este protocolo descreve um modelo de co-cultura microfluídicos para a cultura simultânea e localizada de células epiteliais e bactérias. Este modelo pode ser usado para investigar o papel dos diferentes sinais moleculares solúveis na patogênese, bem como tela a eficácia do suposto probiótico cepas bacterianas.

Microfluídicos Co-cultura de células epiteliais e bactérias para a Investigação Solúvel sinal mediada por interações

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Establishing a Co-Culture Model to Study Host-Pathogen Interactions at the Air-Liquid Interface

Fonte: Otter, C. J., et al. Infecção de Células Epiteliais Nasais Primárias Cultivadas em uma Interface Ar-Líquido para Caracterizar Interações entre Coronavírus Humano e Hospedeiro. J. Vis. Exp. (2023)Este vídeo demonstra o crescimento do coronavírus em células epiteliais nasais humanas cultivadas em uma interface ar-líquido, simulando a infecção e a replicação viral na cavidade nasal humana.

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Os recentes avanços nos protocolos de diferenciação de células-tronco pluripotentes induzidos pelo homem permitem a derivação stepwise de tipos celulares específicos de órgãos. Aqui, fornecemos etapas detalhadas para a manutenção e expansão das células basais derivadas das vias aéreas derivadas do iPSC e sua diferenciação em um epitélio mucociliary em culturas de interface ar-líquido.

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O epitélio nasal é o principal sítio de barreira encontrado por todos os patógenos respiratórios. Aqui, descrevemos métodos para usar células epiteliais nasais primárias cultivadas como culturas de interface ar-líquido (LPA) para caracterizar interações coronavírus-hospedeiro humano em um sistema fisiologicamente relevante.

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Apresentamos aqui um método reprodutível, acessível e robusto para o isolamento e expansão de células epiteliais brônquicas primárias para biobanco de longo prazo e geração de células epiteliais diferenciadas por cultura na interface ar-líquido.

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