2.11: O Western Blot

Western Blotting é uma técnica poderosa utilizada por muitos pesquisadores para identificar a presença de proteínas específicas em uma amostra separada eletroforeticamente usando anticorpos.

Existem 3 estágios principais desta técnica que são essenciais para um resultado de qualidade: Electroblotting, Immunoblotting e Detecção. Antes que esses estágios sejam tentados, SDS-PAGE, no qual as proteínas desnaturadas são separadas por tamanho em um gel de poliacrilamida, deve ser realizado.

Electroblotting, também é conhecido como a "transferência" ocidental? e requer um cassete de transferência para manter unido o "sanduíche" bem como um aparelho para transferir proteínas de um gel de acrilimida para uma membrana fina. O sanduíche de eletroblotting consiste no gel e em uma membrana especializada, imprensada entre dois pedaços de papel de filtro. Durante a transferência, um campo elétrico é usado para mover as proteínas através do gel, onde ficam presas em uma membrana devido a interações carregadas e hidrofóbicas.

O immunoblotting usa anticorpos para "sondar" a membrana para proteínas específicas. Os anticorpos são grandes proteínas em forma de Y que contêm dois fragmentos, também conhecidos como regiões Fab, que se ligam a outras proteínas. A região Fab define o epítopo específico, ou porção específica de uma proteína, à qual um anticorpo se ligará.

Os anticorpos monoclonais são anticorpos que reconhecem um único epítopo e são o tipo de anticorpo preferido usado para immunoblotting devido à sua especificidade. Em contraste, os anticorpos policlonais são uma série de anticorpos diferentes que têm como alvo muitos epítopos no mesmo antígeno ? ou proteína para a qual um anticorpo tem especificidade. Os anticorpos monoclonais que reconhecem um epítopo linear são preferidos, pois garantem que o epítopo possa ser encontrado em uma proteína desnaturada ou linearizada. Isso é importante porque muitos anticorpos reconhecem apenas epítopos conformacionais, o que significa que eles reconhecem proteínas apenas em seu estado 3D nativo.

Além dos fragmentos de Fab, os anticorpos contêm uma região Fc, que é específica do animal que produziu o anticorpo. No immunoblotting, esta região é utilizada principalmente como epítopo para um anticorpo secundário ? um anticorpo que reconhece o primeiro anticorpo que se ligou à proteína que você está tentando detectar.

Para produzir um sinal observável, os anticorpos são frequentemente ligados, por meio de sua região Fc, a uma enzima repórter, como a fosfatase alcalina ou a peroxidase de rábano. Essas enzimas repórter produzem sinais reagindo com substratos para causar mudanças de cor ou produzir mudanças de luz.

Essas mudanças podem então ser quantificadas usando densitometria. A densitometria é a técnica usada para medir a densidade de uma banda de proteína usando um software de análise de imagem para calcular a densidade de cada banda. As bandas podem então ser quantificadas diretamente usando padrões de referência ou controladas internamente usando uma amostra de controle.

Para uma transferência ocidental bem-sucedida, o gel é primeiro equilibrado em tampão de transferência por 15 minutos. A membrana também deve ser equilibrada de acordo com as instruções do fabricante.

Em seguida, o sanduíche de transferência de gel é cuidadosamente preparado em buffer de transferência para evitar que as bolhas fiquem presas dentro do sistema. As bolhas presas no sanduíche podem ser forçadas a sair rolando sobre elas com uma pequena pipeta. Mesmo pequenas bolhas podem interromper a transferência de proteínas, causando transferência incompleta, como pode ser visto nas partes inferiores desta membrana.

Uma vez montado, o tampão de transferência adicional é derramado na câmara de transferência e é executado a 20-30 mA por 2-3 horas. O tampão de transferência contém metanol, que aumenta a ligação das proteínas à membrana.

Uma vez concluída a transferência, o cassete é desmontado e a qualidade da transferência pode ser verificada usando uma coloração de proteína não específica, como Ponceau S. Isso oferece uma detecção rápida e reversível de bandas de proteínas.

O primeiro passo do immunoblotting é cobrir as áreas restantes da membrana com uma solução diluída de proteínas. Esta etapa é chamada de bloqueio e é realizada para bloquear a membrana e reduzir a ligação inespecífica do anticorpo à membrana. Normalmente, a solução de bloqueio consiste em albumina de soro bovino ou leite em pó desnatado dissolvido em uma solução salina tamponada. Esta etapa geralmente é feita por 1 hora a durante a noite em uma coqueteleira.

O próximo passo é incubar a membrana com o anticorpo primário diluído na solução de bloqueio. Esta etapa pode levar de 30 minutos a uma noite e deve ser realizada com agitação suave.

Em seguida, a membrana é completamente enxaguada para reduzir a coloração de fundo inespecífica e o anticorpo secundário é adicionado no tampão de bloqueio à membrana. Após uma curta incubação, a membrana é novamente bem enxaguada.

Os anticorpos secundários são detectáveis graças às enzimas repórteres que estão ligadas a eles. Após a adição do substrato correto, as alterações colorimétricas ou quimioluminescentes podem ser visualizadas e medidas usando técnicas de densitometria. Além disso, a escada de proteínas fornece uma referência de tamanho valiosa para que o tamanho linear de cada proteína possa ser estimado com base em quão longe ela migrou no gel em relação aos marcadores de tamanho na escada. Observar o tamanho das proteínas detectadas por immunoblotting é uma boa maneira de verificar se o anticorpo está reconhecendo a proteína correta e se é um monômero ou várias cópias da proteína que estão sendo vistas.

Existem milhares de anticorpos primários disponíveis comercialmente, o que permite a detecção e quantificação de proteínas específicas em uma amostra. Aqui, um pesquisador usa um anticorpo para HIF-1? medir a quantidade desse fator de transcrição responsivo ao oxigênio em culturas de células para rastrear hipóxia. Eles também usaram um anticorpo para beta-actina para atuar como controle de carga. Como você pode ver, as células cultivadas em condições normais de oxigênio produziram muito menos HIF-1 do que aquelas cultivadas em condições de baixo oxigênio.

A combinação de eletroforese em gel 2D e immunoblotting pode fornecer informações valiosas sobre a presença de complexos proteicos. Aqui, as amostras foram primeiro analisadas por tamanho de complexo de proteínas e, em seguida, desnaturadas para que cada proteína individual do complexo pudesse ser separada por seu tamanho individual. Os anticorpos para três proteínas diferentes mostram três complexos únicos contendo diferentes números dessas proteínas, com cada complexo organizado em uma linha vertical. A coluna mais à esquerda contém beta-2 e MCP-21, bem como outra proteína não mostrada por esses marcadores. A coluna central mostra um complexo que continha todas as 3 proteínas, e a coluna direita continha apenas beta-2 e MCP-21.

O immunoblotting também pode ser usado para visualizar interações proteína-proteína. Isso é realizado primeiro transferindo proteínas de um gel para uma membrana de nitrocelulose e, em seguida, sondando essa membrana com proteínas adicionais. O immunoblotting é então usado para detectar se as proteínas adicionadas se complexaram com qualquer uma das proteínas que foram imobilizadas na membrana.

Você acabou de assistir ao vídeo de JoVE sobre immunoblotting. Agora você deve entender como transferir proteínas para uma membrana, sondar a membrana com anticorpos e detectar o sinal. Como sempre, obrigado por assistir!