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Basic Methods in Cellular and Molecular Biology

O Western Blot

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JoVE Science Education Basic Methods in Cellular and Molecular Biology

The Western Blot

2.10: Gel Purification

2.12: An Introduction to Transfection

502,249 Views

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08:48 min

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April 30, 2023

Overview

Western Blotting é usado para identificar a presença de proteínas específicas em amostras eletroforeticamente separadas. Após a separação por uma técnica conhecida como sulfato de sódio de poliacrilamida de gel de gel eletroforese, ou SDS-PAGE, a transferência ocidental é usada para mover proteínas de um gel de poliacrilamida para um pedaço de membrana que prende as proteínas em suas respectivas localizações. Em seguida, as membranas são sondadas com anticorpos em um processo chamado imunboblotting. A imunoblotting utiliza proteína de anticorpos e anticorpos de ligação através de locais específicos de reconhecimento, fornecendo a alta especificidade necessária para identificar uma única proteína. A detecção de anticorpos ocorre utilizando sistemas de repórteres que incluem o uso de enzimas. Enzimas podem ser anexadas ao final de um anticorpo e reagir com substratos para produzir mudanças de cor ou luz. Esses sinais podem então ser imagens e quantificados usando um processo chamado densitometria.

Este vídeo-artigo apresenta uma visão geral da técnica de mancha ocidental, descrevendo a transferência ocidental, o uso de detecção de anticorpos e análise de imagem. As etapas envolvidas com a transferência ocidental, como a montagem do sanduíche de transferência e as condições de transferência, são discutidas em detalhes, bem como a teoria por trás da ligação de anticorpos e detecção desses anticorpos. As amplas aplicações dessa técnica são descritas através de vários exemplos, incluindo a detecção de interações proteína-proteína e identificação de proteínas individuais dentro de complexos proteicos.

Procedure

Western Blotting é uma técnica poderosa utilizada por muitos pesquisadores para identificar a presença de proteínas específicas em uma amostra eleforeticamente separada usando anticorpos.

Existem 3 estágios principais desta técnica que são essenciais para um resultado de qualidade: Eletroblotting, Imunoblotting e Detecção. Antes que essas etapas sejam tentadas, o SDS-PAGE, no qual as proteínas desnaturadas são separadas por tamanho em um gel de poliacrilamida, deve ser realizada.

Eletroblotting, também é conhecida como transferência ocidental e requer um de transferência para segurar o sanduíche bem como um aparelho para transferir proteína de um gel de acrilimto para uma membrana fina. O sanduíche de eletroblotting consiste no gel e uma membrana especializada, sanduíche entre dois pedaços de papel filtro. Durante a transferência, um campo elétrico é usado, para mover as proteínas através do gel, onde ficam presas em uma membrana devido a interações carregadas e hidrofóbicas.

A imunoblotting usa anticorpos para “sondar” a membrana para proteínas específicas. Anticorpos são grandes proteínas em forma de Y que contêm dois fragmentos, também conhecidos como regiões fab, que se ligam a outras proteínas. A região da Fab define o epítope específico, ou porção específica de uma proteína, à qual um anticorpo se ligará.

Anticorpos monoclonais são anticorpos que reconhecem um único epítope e são o tipo de anticorpo preferido usado para imunoblotação devido à sua especificidade. Em contraste, os anticorpos policlonais são uma série de anticorpos diferentes que visam muitos epítopos no mesmo antígeno – ou proteína para a qual um anticorpo tem especificidade. Anticorpos monoclonais que reconhecem um epítope linear são preferidos, pois garantem que o epítope possa ser encontrado em uma proteína desnaturada, ou linearizada. Isso é importante porque muitos anticorpos só reconhecem epítopos conformais, o que significa que eles reconhecem proteínas apenas em seu estado 3D nativo.

Além dos fragmentos de Fab, os anticorpos contêm uma região de Fc, que é específica para o animal que produziu o anticorpo. Na imunoblotação, esta região é utilizada principalmente como epítope para um anticorpo secundário – um anticorpo que reconhece o primeiro anticorpo que está ligado à proteína que você está tentando detectar.

A fim de produzir um sinal observável, anticorpos são frequentemente ligados, através de sua região fc, a uma enzima repórter, como fosfattase alcalina ou peroxidase de rabanete. Essas enzimas repórteres produzem sinais reagindo com substratos para causar mudanças de cor ou produzir mudanças de luz.

Essas alterações podem então ser quantificadas usando densitometria. Densitometria é a técnica usada para medir a densidade de uma banda de proteína usando software de análise de imagem para calcular a densidade de cada banda. As bandas podem então ser diretamente quantificadas usando padrões de referência ou controladas internamente usando uma amostra de controle.

Para uma transferência ocidental bem sucedida, o gel é primeiro equilibrado em buffer de transferência por 15 minutos. A membrana também deve ser equilibrada de acordo com as instruções de fabricação.

Em seguida, o sanduíche de transferência de gel é cuidadosamente preparado no buffer de transferência para evitar que bolhas sejam presas dentro do sistema. Bolhas presas no sanduíche podem ser forçadas a sair rolando sobre elas com uma pequena pipeta. Mesmo pequenas bolhas podem interromper a transferência de proteínas causando transferência incompleta, como pode ser visto nas partes inferiores desta membrana.

Uma vez montado, o buffer de transferência adicional é derramado na câmara de transferência e é executado em 20-30 mA por 2-3 horas. O tampão de transferência contém metanol, o que aumenta a ligação das proteínas à membrana.

Uma vez que a transferência é concluída, o é desmontado e a qualidade da transferência pode ser verificada usando uma mancha proteica não específica, como Ponceau S. Isso oferece uma detecção rápida e reversível de bandas de proteínas.

O primeiro passo da imunoblotting é cobrir as demais áreas da membrana com uma solução diluída de proteínas. Esta etapa é chamada de bloqueio e é realizada, a fim de bloquear a membrana e reduzir a ligação inespecífica do anticorpo à membrana. Normalmente, a solução de bloqueio consiste em albumina de soro bovino ou leite seco não gordo dissolvido em uma solução salina tamponada. Esta etapa geralmente é feita por 1 hora para durante a noite em um shaker.

O próximo passo é incubar a membrana com o anticorpo primário diluído na solução de bloqueio. Este passo pode levar de 30 minutos para a noite e deve ser realizado com agitação suave.

Em seguida, a membrana é completamente enxaguada para reduzir a coloração de fundo não específica e o anticorpo secundário é adicionado no bloqueio do buffer à membrana. Após uma breve incubação, a membrana é novamente completamente enxaguada.

Anticorpos secundários são detectáveis graças às enzimas repórteres que estão amarradas a eles. Após a adição do substrato correto, alterações colorimétricas ou quemiluminescentes podem ser imagens e, em seguida, medidas usando técnicas de densitometria. Além disso, a escada proteica fornece uma referência de tamanho valioso para que o tamanho linear de cada proteína possa ser estimado com base no quão longe ela migrou no gel em relação aos marcadores de tamanho na escada. Observar o tamanho das proteínas detectadas através da imunoblotação é uma boa maneira de verificar se o anticorpo está reconhecendo a proteína correta e se é um monômero ou uma cópia múltipla da proteína que está sendo vista.

Existem milhares de anticorpos primários disponíveis comercialmente, o que permite a detecção e quantificação de proteínas específicas dentro de uma amostra. Aqui um pesquisador usa um anticorpo para HIF-1α para medir a quantidade desse fator de transcrição responsiva de oxigênio nas culturas celulares para testar a hipóxia. Eles também usaram um anticorpo para beta-actina para agir como um controle de carregamento. Como você pode ver, as células cultivadas em condições normais de oxigênio produziram muito menos HIF-1 do que aquelas cultivadas em baixas condições de oxigênio.

A combinação de eletroforese de gel 2D e imunoblotting pode fornecer informações valiosas sobre a presença de complexos proteicos. Aqui, as amostras foram primeiramente executadas pelo tamanho complexo proteico, e depois desnaturadas para que cada proteína individual no complexo pudesse ser separada pelo seu tamanho individual. Anticorpos para três proteínas diferentes mostram três complexos únicos contendo diferentes números dessas proteínas com cada complexo disposto em uma linha vertical. A coluna mais à esquerda contém beta-2 e MCP-21, bem como outra proteína não mostrada por esses marcadores. A coluna central mostra um complexo que continha todas as 3 proteínas, e a coluna direita continha apenas beta-2 e MCP-21.

A imunoblotação também pode ser usada para visualizar interações proteína-proteína. Isso é realizado primeiro transferindo proteínas de um gel para uma membrana de nitrocelulose e, em seguida, sondando essa membrana com proteínas adicionais. A imunoblotação é então usada para detectar se as proteínas adicionadas se complexaram com alguma das proteínas que foram imobilizadas na membrana.

Você acabou de ver o vídeo da JoVE sobre imunoblotting. Agora você deve entender como transferir proteínas para uma membrana, sondar a membrana com anticorpos e detectar o sinal. Como sempre, obrigado por assistir!

Transcript

Western Blotting is a powerful technique utilized by many researchers to identify the presence of specific proteins in an electrophoretically-separated sample using antibodies.

There are 3 principal stages of this technique that are essential for a quality outcome: Electroblotting, Immunoblotting, and Detection. Before these stages are attempted, SDS-PAGE, in which denatured proteins are separated by size in a polyacrylamide gel, must be performed.

Electroblotting, is also known as the Western “transfer” and requires a transfer cassette for holding together the “sandwich” as well as an apparatus for transferring protein from an acrylimide gel to a thin membrane. The electroblotting sandwich consists of the gel and a specialized membrane, sandwiched between two pieces of filter paper. During the transfer, an electric field is used, to move the proteins through the gel, where they become trapped on a membrane due to charged and hydrophobic interactions.

Immunoblotting uses antibodies to “probe” the membrane for specific proteins. Antibodies are large Y-shaped proteins that contain two fragments, also known as Fab regions, which bind to other proteins. The Fab region defines the specific epitope, or specific portion of a protein, to which an antibody will bind.

Monoclonal antibodies are antibodies that recognize a single epitope and are the preferred antibody type used for immunoblotting due to their specificity. In contrast, polyclonal antibodies are a series of different antibodies that target many epitopes on the same antigen – or protein for which an antibody has specificity. Monoclonal antibodies that recognize a linear epitope are preferred as that ensures the epitope can be found on a denatured, or linearized, protein. This is important because many antibodies only recognize conformational epitopes, which means that they recognize proteins in their native 3D state only.

In addition to Fab fragments, antibodies contain an Fc region, which is specific to the animal that produced the antibody. In immunoblotting, this region is mainly utilized as the epitope for a secondary antibody – an antibody which recognizes the first antibody that has bound to the protein you’re trying to detect.

In order to produce an observable signal, antibodies are often linked, through their Fc region, to a reporter enzyme, such as alkaline phosphatase or horseradish peroxidase. These reporter enzymes produce signals by reacting with substrates to cause color changes or produce light changes.

These changes can then be quantified using densitometry. Densitometry is the technique used to measure the density of a protein band using image analysis software to calculate the density of each band. The bands can then be directly quantified using reference standards or internally controlled using a control sample.

For a successful Western transfer, the gel is first equilibrated in transfer buffer for 15 minutes. The membrane should also be equilibrated according to manufactures instructions.

Next, the gel transfer sandwich is carefully prepared in transfer buffer to prevent bubbles from being trapped within the system. Bubbles trapped in the sandwich can be forced out by rolling over them with a small pipette. Even small bubbles can interrupt the transfer of proteins causing incomplete transfer as can be seen on the lower parts of this membrane.

Once assembled, additional transfer buffer is poured into the transfer chamber and it is run at 20-30 mA for 2-3 hours. Transfer buffer contains methanol, which enhances the binding of the proteins to the membrane.

Once the transfer is complete the cassette is disassembled and the quality of the transfer can be checked using a non-specific protein stain such as Ponceau S. This offers a quick and reversible detection of protein bands.

The first step of immunoblotting is to cover the remaining areas of the membrane with a dilute solution of proteins. This step is called blocking and is performed, in order to block the membrane and reduce the nonspecific binding of the antibody to the membrane. Typically, the blocking solution consists of either bovine serum albumin or non-fat dry milk dissolved in a buffered saline solution. This step is usually done for 1 hour to overnight on a shaker.

The next step is to incubate the membrane with the primary antibody diluted in the blocking solution. This step can take from 30 minutes to overnight and should be performed with gentle agitation.

Then, the membrane is thoroughly rinsed to reduce nonspecific background staining and the secondary antibody is added in blocking buffer to the membrane. After a short incubation, the membrane is again thoroughly rinsed.

Secondary antibodies are detectable thanks to the reporter enzymes that are tethered to them. Upon addition of the correct substrate, colorimetric or chemiluminescent changes can be imaged and then measured using densitometry techniques. In addition, the protein ladder provides a valuable size reference so that each protein’s linear size can be estimated based on how far it has migrated in the gel relative to the size markers in the ladder. Observing the size of proteins detected via immunoblotting is a good way to verify that the antibody is recognizing the correct protein and whether it is a monomer or a multiple copies of the protein that are being seen.

There are thousands of commercially available primary antibodies, which allows for the detection and quantification of specific proteins within a sample. Here a researcher uses an antibody for HIF-1α to measure the amount of this oxygen responsive transcription factor in cell cultures to screen for hypoxia. They also used an antibody for beta-actin to act as a loading control. As you can see, the cells cultured in normal oxygen conditions produced far less HIF-1 than those cultured in low oxygen conditions.

The combination of 2D gel electrophoresis and immunoblotting can provide valuable information into the presence of protein complexes. Here, samples were first run by protein complex size, and then denatured so each individual protein in the complex could be separated by their individual size. Antibodies for three different proteins show three unique complexes containing different numbers of these proteins with each complex arranged in a vertical line. The left most column contains beta-2 and MCP-21, as well as another protein not shown by these markers. The center column shows a complex that contained all 3 proteins, and the right column contained only beta-2 and MCP-21.

Immunoblotting can also be used to visualize protein-protein interactions. This is performed by first transferring proteins from a gel onto a nitrocellulose membrane and then probing that membrane with additional proteins. Immunoblotting is then used to detect the if the added proteins complexed with any of the proteins that were immobilized on the membrane.

You’ve just watched JoVE’s video on immunoblotting. You should now understand how to transfer proteins to a membrane, probe the membrane with antibodies, and detect the signal. As always, thanks for watching!

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