Secção do nervo tibial - um modelo padronizado para denervação induzida por atrofia muscular em ratos
3 de novembro de 2013
O modelo de corte transversal do nervo tibial é um modelo bem-tolerado, validado, e reprodutível de atrofia do músculo esquelético. O protocolo cirúrgico modelo é descrito e demonstrado em ratinhos C57Black6.
O objetivo geral deste vídeo é demonstrar o modelo de transecção do nervo tibial da atrofia do músculo esquelético em camundongos. Isso é feito isolando o nervo ciático e seus três ramos, os nervos tibial, silar e fibular. Uma vez isolado, o nervo tibial é seccionado.
Após a desnervação, a ferida é selada e a condição do animal é monitorada de perto. Por fim, são obtidas amostras que mostram uma diminuição progressiva da massa muscular após a desnervação. O modelo de transecção do nervo tibial de atrofia do músculo esquelético induzida por desnervação é um modelo comumente empregado em modelos bem validados em ratos, e isso tem muito menos morbidade do que a associada à transecção do nervo ciático.
Adaptamos este modelo para uso em camundongos, que demonstraremos aqui. Isso permite que o investigador aproveite a existência de camundongos geneticamente modificados e estude o processo de atrofia muscular na ausência de proteínas que são cruciais para a regulação da massa muscular esquelética, induzindo morbidade mínima no animal. Primeiro, registre o peso do camundongo após confirmar a anestesia adequada por pinça do dedo do pé, identifique a incisura ciática por palpação e raspe a parte lateral da coxa e da nádega de lá até o joelho.
Em seguida, limpe a área com aplicações repetidas de álcool e pró-iodo. Coloque o mouse de lado sob um microscópio cirúrgico ou de dissecação enquanto usa luvas estéreis. Identifique a incisura ciática por palpação.
Incisar a pele da parte lateral da coxa, desde a incisura ciática até o joelho. Abra suavemente a pele. Identifique o músculo bíceps femoral, que é o músculo superficial plano da parte lateral da coxa imediatamente abaixo da pele, usando uma tesoura fina.
Divida o músculo bíceps femoral ao longo das fibras musculares e insira um afastador de mola. Para expor o nervo ciático e seus ramos, identifique o nervo ciático imediatamente abaixo do músculo bíceps femoral. Pode ser identificado por sua cor branca brilhante característica e tem aproximadamente 0,8 milímetros de diâmetro.
Vai da incisura ciática até o joelho, ramificando-se nos nervos tibial, fibular e sal ao nível da fossa poplítea. Separe suavemente os ramos dos nervos tibial dos fibulares e sais com pinças ultrafinas e tesouras de microdissecação de mola. O nervo tibial é o maior ramo e geralmente é central.
O manuseio suave do nervo ciático e seus ramos é essencial para o sucesso desse procedimento. Tome cuidado para que os ramos dos nervos sal e perineal não sejam danificados ou esticados. Se esses galhos forem danificados ou esticados, isso também destruirá seus alvos.
Segurar o nervo apenas na camada adventícia externa com a pinça ultrafina e manter a folga do nervo evitará o esmagamento do nervo e lesões por tração para desnervação temporária Com reação completa esperada em duas a quatro semanas, esmague o nervo tibial com pinça ultrafina por 15 segundos para desnervação completa e duradoura. Corte o nervo tibial com a tesoura de dissecação micros o mais distalmente possível. Evitar cuidadosamente os vasos poplíteos se for necessária a desnervação completa.
Suturar a extremidade do nervo tibial seccionado à superfície anterior do músculo bíceps femoral com nylon 10 T e aproximar novamente o bíceps femoral com cinco T Vicryl para evitar a reação aberrante dos músculos gastros e sóleo. Assim que a desnervação estiver completa, feche a pele com uma sutura de Vicryl de cinco coisas. Quando estiver pronto, desligue o anestésico inalatório, mas mantenha o fluxo de oxigênio.
Depois de administrar um analgésico isoladamente, coloque o camundongo em uma gaiola limpa e quente, sem roupa de cama. Mantenha o mouse sob observação direta até deambular. Quando totalmente recuperado, transfira o mouse para uma gaiola inferior limpa e sólida com ampla cama macia.
Inspecione o membro operatório e o pé diariamente quanto ao desenvolvimento de úlceras de decúbito no calcanhar ou evidências de mastigação, pequenos problemas podem ser tratados com antibióticos tópicos ou anti-sépticos, como odina. Os indicadores finais que requerem a eutanásia do animal são perda de peso, evidência de autocuidado inadequado e postura curvada. Além disso, animais com ruptura de feridas ou úlceras que não cicatrizam com uma a duas semanas de tratamento de feridas também devem ser sacrificados.
Além disso, quaisquer animais que estejam com dor indevida No momento pós-operatório, os tecidos desejados são coletados para análise. Após a eutanásia, raspe o aspecto medial das pernas de controle operatório e contralateral e limpe com álcool trabalhando sob um microscópio de dissecação, incise a pele medial da panturrilha com um bisturi do tornozelo ao joelho e circunferencialmente ao redor do tornozelo no membro operado. Em seguida, puxe suavemente a pele do músculo e proximalmente em direção à coxa.
Para expor todos os músculos da perna, identifique o músculo gastro, que é o músculo da panturrilha que vai do joelho ao tornozelo na face posterior da perna. Em seguida, localize a inserção distal do músculo bíceps femoral proximal ao músculo gastro na face medial do joelho. Em sua inserção distal, o bíceps femoral parece fino e transparente e se sobrepõe à porção mais proximal do gastro com tesoura e dissecção da extremidade romba.
Separe suavemente a inserção distal do bíceps femoral do músculo gastronômico. Adicione sua inserção distal no calcâneo, o músculo gastros afunila no tendão de Aquiles. Identifique o tendão de Aquiles que parece branco e musculoso.
Segure o tendão de Aquiles com uma pinça. Tomando cuidado para não segurar ou esmagar o músculo gástrico e dividir o tendão de Aquiles da inserção do calcâneo. Usando uma tesoura ainda segurando o tendão, levante suavemente o músculo gastro vermelho pálido do sóleo vermelho mais profundo da inserção distal em direção à sua origem no joelho, usando uma tração muito suave.
Para facilitar o processo, disseque o gastro da perna dividindo a origem do gastro dos côndilos medial e lateral do fêmur. Usando uma tesoura. Tenha cuidado para não esmagar o músculo.
O sóleo agora será claramente visível imediatamente sob a visão dos gastros. Levante o sous de sua inserção no tendão de Aquiles até sua origem na panturrilha posterior. Uma vez removidos, pese os músculos separadamente em uma balança de precisão.
Em seguida, divida os músculos verticalmente, metade para congelamento instantâneo e nitrogênio líquido e metade para histologia. Por fim, repita esses procedimentos no lado de controle sem classificação para colher os músculos gastro e sóleo de controle. Os músculos gastro foram colhidos de membros posteriores desnervados e controle contralateral em uma, duas ou quatro semanas e expressos em proporção.
A desnervação induziu uma perda progressiva de massa muscular ao longo do tempo. A área da seção transversal das fibras miológicas foi medida após a imunocoloração, como visto aqui. As fibras do tipo dois de contração rápida mancham as fibras marrons e as fibras do tipo um de contração lenta, mancham o tipo dois branco rapidamente.
As fibras de contração demonstraram uma diminuição progressiva da área de secção transversa no músculo desnervado. Mais de quatro semanas Depois de assistir a este vídeo, você deve ser capaz de realizar a transecção do nervo tibial em camundongos. Isso fornece um modelo reprodutível, robusto e bem validado de atrofia do músculo esquelético induzida por desnervação.
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Visão Geral
O modelo de secção do nervo tibial é um método validado e reprodutível para o estudo da atrofia muscular esquelética em camundongos. Este modelo envolve o isolamento cirúrgico e a secção do nervo tibial, permitindo a observação de alterações na massa muscular após a desnervação.
Principais Componentes do Estudo
Área da Ciência
- Neurociência
- Fisiologia Muscular
- Modelos Animais
Antecedentes
- O modelo de secção do nervo tibial é comumente utilizado para estudar a atrofia do músculo esquelético.
- Este modelo é menos mórbido em comparação com o modelo de secção do nervo ciático.
- Oferece uma maneira confiável de avaliar as alterações na massa muscular após lesão nervosa.
- Mesocricetus auratus C57Black6 são tipicamente usados para este procedimento.
Objetivo do Estudo
- Demonstrar o protocolo cirúrgico para a secção do nervo tibial.
- Monitorar os efeitos da desnervação na massa muscular.
- Validar o modelo para pesquisas futuras em atrofia muscular.
Métodos Utilizados
- Isolamento do nervo ciático e seus ramos.
- Transecção do nervo tibial.
- Fechamento da ferida após a cirurgia.
- Monitoramento do estado do animal e obtenção de amostras musculares.
Resultados Principais
- Diminuição progressiva da massa muscular observada após a desnervação.
- O modelo demonstra baixa morbidade em comparação com outros métodos de secção nervosa.
- Os resultados apoiam a validade do modelo para o estudo da atrofia muscular.
- Fornece uma estrutura para pesquisas futuras sobre lesão nervosa e perda muscular.
Conclusões
- O modelo de secção do nervo tibial é eficaz para o estudo da atrofia muscular.
- Oferece um método reprodutível com complicações mínimas.
- Este modelo pode ser utilizado em diversos contextos de pesquisa relacionados à saúde neuromuscular.
Perguntas Frequentes
Relevância Executiva para a Indústria
O modelo de secção do nervo tibial fornece um sistema reprodutível e de baixa morbidade para o estudo da atrofia muscular esquelética induzida por desnervação em camundongos, permitindo a investigação mecanicista das vias de perda muscular. Este modelo apoia a validação de alvos e a redução de riscos em estágios pré-clínicos, permitindo a avaliação da atrofia em modelos geneticamente modificados, facilitando a análise de intervenções terapêuticas que afetam a regulação da massa muscular. Sua compatibilidade com leituras histomorfométricas e moleculares aumenta a confiança preditiva em programas de descoberta neuromuscular.
Aplicações Estratégicas em P&D de Biotecnologia Farmacêutica
Descoberta Inicial e Validação de Alvo
- Valor Científico: Permite a investigação de hipóteses terapêuticas relacionadas a vias de atrofia muscular por meio do fenótipo induzido por desnervação em camundongos selvagens e geneticamente modificados.
- Valor Operacional: Oferece uma abordagem cirúrgica padronizada com comprometimento ambulatorial mínimo, favorecendo a indução consistente do fenótipo entre os grupos de estudo.
Triagem e Desenvolvimento de Ensaios
- Valor Científico: Gera parâmetros quantificáveis, como peso muscular e área da seção transversal específica por tipo de fibra, para padronização de ensaios e triagem de compostos.
- Valor Operacional: Permite avaliação longitudinal em 1, 2 e 4 semanas após a desnervação, possibilitando o perfil de eficácia dependente do tempo.
Pesquisa Translacional e Pré-clínica
- Valor Científico: Facilita o estudo dos mecanismos fisiológicos, celulares e moleculares da atrofia em sistemas relevantes para doenças, incluindo as respostas das fibras de contração rápida e lenta.
- Valor Operacional: Preserva o membro contralateral como controle interno, reduzindo a variabilidade e melhorando o poder estatístico em estudos pré-clínicos.
Integração de Pipeline e Fluxo de Trabalho
O modelo se insere no continuum de descoberta, desde a validação do alvo até a avaliação pré-clínica, apoiando testes de hipóteses e a redução de riscos mecanicistas na pesquisa de atrofia muscular.
- Biologia do Descobrimento: Permite a clarificação de vias e a validação de alvos ao induzir um fenótipo reprodutível de atrofia por meio da secção do nervo tibial.
- Triagem: Fornece leituras quantitativas e histomorfométricas (peso muscular, CSA) adequadas para análise de alto conteúdo e avaliação do efeito de compostos.
- Análises: Oferece medições específicas por tipo de fibra (tipos I e II), permitindo a estratificação mecanicista das respostas de atrofia.
- Pesquisa Translacional: Apoia a continuidade desde a descoberta de alvos genéticos até a validação pré-clínica, utilizando fenótipos relevantes de músculo esquelético em doenças.
- Reutilização Corporativa: Representa uma plataforma cirúrgica reutilizável, aplicável a múltiplos alvos e fundos genéticos em programas neuromusculares.
Impacto Operacional e Empresarial
- Valor Científico: Reduz a ambiguidade mecanicista ao isolar a desnervação como uma variável controlada em estudos de perda muscular.
- Valor Operacional: Oferece um modelo bem tolerado e reprodutível, com menor morbidade em comparação à secção do nervo ciático, melhorando o bem-estar animal e a consistência dos dados.
- Valor Estratégico: Aprimora decisões de avançar ou interromper projetos ao fornecer leituras precoces e preditivas do engajamento do alvo nas vias de regulação da massa muscular.
- Impacto no Portfólio: Permite a priorização ajustada ao risco de alvos de atrofia com base no resgate fenotípico em modelos de desnervação validados.
Considerações sobre a Implementação
- Exige experiência em isolamento e manipulação microcirúrgica de nervos para evitar danos aos ramos peroneal e sural.
- Necessita de instrumentos cirúrgicos estéreis, ferramentas para dissecação microcirúrgica e materiais para sutura (nylon, Vicryl) para a secção nervosa e fechamento da ferida.
- Exige protocolos padronizados de monitoramento pós-operatório e analgésicos para garantir a recuperação do animal e minimizar efeitos de estresse confundidores.
- Requer infraestrutura de histologia para inclusão em parafina, imuno-histoquímica (isoformas de miosina) e análise morfométrica da área de secção transversal das fibras.
- Limita-se aos músculos distais da pata traseira (gastrocnêmio, sóleo, plantar), não sendo adequado para o estudo da atrofia muscular proximal ou axial.
