A Metodologia Decelularização para a produção de um Intestinal Matrix Natural Acellular
7 de outubro de 2013
O artigo descreve um método para a produção de uma matriz acelular a partir de intestino de rato. A derivação de andaimes intestinal é importante para futuras aplicações em engenharia de tecidos, biologia das células estaminais e testes de drogas.
O objetivo geral deste procedimento é criar um andaime acelular natural para a engenharia do tecido intestinal. Isso é feito primeiro canulando, uma artéria mesentérica superior de rato ou SMA, e colhendo o intestino delgado junto com o acesso vascular. Na segunda etapa, os detritos intraluminais são lavados e as cânulas intraluminais e vasculares são conectadas a uma bomba peristáltica.
Em seguida, o intestino delgado é perfundido com água deionizada por 24 horas a quatro graus Celsius. Na etapa final, o intestino delgado é perfundido com desoxi de sódio, coate e DNAs à temperatura ambiente. Em última análise, a descelularização completa do intestino delgado, bem como sua arquitetura e componentes, podem ser visualizados por histologia e microscopia eletrônica, respectivamente.
Atualmente, enfrentamos o problema clínico da insuficiência intestinal, condição devastadora que afeta crianças e adultos. A nutrição parental e o transplante convencional não fornecem uma cura completa. A produção de andaimes intestinais vascularizados tridimensionais, conforme demonstrado no vídeo a seguir, estende-se para a terapia da insuficiência intestinal.
O que é notável sobre essa técnica é que o uso de produtos químicos de digitalização suaves preserva a microarquitetura intestinal, como evidenciado pelos resultados do microscópio eletrônico. Além disso, a manutenção da rede vascular hierárquica seguindo a civilização permite a semeadura de uma estrutura que pode ser reconectada ao hospedeiro. Suprimento de sangue Comece instalando uma bomba peristáltica com dois tubos, depois passe etanol a 70% pelos tubos da bomba peristáltica por 15 minutos na velocidade máxima, seguido de PBS AA recém-preparado por mais 15 minutos.
Depois de lavar a bomba, borrife e limpe o abdômen de um rato spra spra sacrificado de 250 a 350 gramas com etanol a 70%. Em seguida, usando instrumentos cirúrgicos esterilizados em autoclave, faça uma incisão de laparotomia púbica XO no abdômen para garantir um campo cirúrgico claro, eviscere o intestino delgado para o lado direito do animal em uma toalha de papel borrifada com etanol 70%. Tome cuidado para molhar continuamente o intestino com P-B-S-A-A para evitar a desidratação do tecido e a desnaturação da matriz extracelular.
Em seguida, localize a AME, que surge em um ângulo de 90 graus da aorta em direção ao intestino. Coloque uma sutura ao redor da SMA e prepare um nó. Use uma cânula de calibre 27 para entrar na AMS a partir da aorta e, em seguida, retire rapidamente a agulha para evitar rasgar a parede do vaso.
Agora avance o tubo de plástico da cânula para dentro do SMA, prendendo o tubo com suturas Vicryl five oh e, em seguida, injete 10 mililitros de PBSA para confirmar a canulação. Em seguida, use uma tesoura para incisar a aorta proximal e distal à AMS para liberar a cânula para evitar vazamento de fezes ao dissecar o intestino grosso, coloque um nó de sutura de cinco oh de seda na extremidade proximal da junção ileocecal e um na extremidade distal do cólon sigmóide. Em seguida, corte o íleo terminal e o cólon entre os dois nós e remova o intestino grosso.
Agora corte o intestino delgado na junção duodenal Juno e liberte o intestino de quaisquer conexões de tecido conjuntivo que possa ter com o abdômen. Transfira o intestino delgado para uma placa de Petri contendo PBS aa. Em seguida, use uma pipeta posterior de plástico para canular a seção proximal do intestino, prendendo-a no lugar com suturas.
Por fim, corte a pipeta para que ela se encaixe na trava de isca de uma seringa de 60 mililitros e, em seguida, lave o lúmen intestinal com duas lavagens de 60 mililitros de PBSA para remover quaisquer fezes e detritos Antes de iniciar o processo de descelularização, certifique-se de que não haja bolhas no lúmen intestinal e nas cânulas vasculares. Em seguida, conecte uma torneira de parada de três vias à cânula vascular e coloque a placa de Petri em um recipiente para coletar qualquer solução transbordante. Em seguida, comece a correr água deionizada através da bomba de rolos de velocidade variável master flex LS a 0,6 mililitros por hora.
Manuseie o tecido com cuidado para garantir que as bolhas saiam da extremidade distal. Uma vez que todas as bolhas tenham sido removidas das cânulas, transfira o aparelho para a câmara fria. Em seguida, inicie o processo de descelularização perfundindo o lúmen intestinal e a árvore vascular com água deionizada corrente por 24 horas a 0,6 mililitros por hora durante a primeira hora.
Verifique o aparelho regularmente para garantir que todas as conexões estejam seguras. O vazamento é mínimo e não há bolhas presentes no intestino. Após 24 horas, mova o aparelho de descelularização de volta à temperatura ambiente.
A cor do intestino deveria ter mudado para um rosa claro sob uma coifa de sucção. Pese deoxy coate de sódio suficiente para fazer uma solução a 4% em 300 mililitros de água deionizada. Use um vórtice para misturar a solução até que esteja límpida.
Agora, substitua a solução deionizada pelo collate de desoxi de sódio. Verifique as conexões. Remova todas as bolhas e perfunda o intestino delgado a 0,6 mililitros por hora durante quatro horas.
Após a etapa de colação de desoxi de sódio, o tecido torna-se transparente. A manutenção da rede vascular também se torna aparente após a adição de PBS AA à bomba. Lave o intestino com PBS AA por 30 para evitar qualquer interação entre o desoxi de sódio, coate e DNA.
Em seguida, perfunda o tecido com DNAs recém-preparados, um em temperatura ambiente a uma velocidade de 0,6 mililitros por hora. Após três horas, transfira o andaime para uma capa de cultura de tecidos e, usando uma técnica séptica, troque a placa. Esterilize novamente a tubulação da bomba peristáltica passando etanol.
Lave o intestino uma última vez com P-B-S-A-A por 30 minutos para garantir que todos os restos das soluções de descelularização sejam removidos. Por fim, transfira o andaime para um reticulador UV e execute dois ciclos de esterilização. Em seguida, armazene o andaime em P-B-S-A-A.
Trocando a solução a cada três dias. Após a descelularização bem-sucedida, o andaime deve ter uma aparência macroscópica semelhante à do intestino nativo, mas com paredes translúcidas. A preservação da macroarquitetura também deve ser evidenciada pela perviedade da árvore vascular.
Quando o corante é injetado através da cânula SMA, ele deve se distribuir uniformemente por todo o andaime e atingir a árvore capilar. O andaime deve estar livre de material nuclear e citoplasmático, algo que pode ser avaliado. Usando um kit de quantificação de DNA e análise histológica simples, a coloração de hematina e eoína deve demonstrar ausência de material nuclear e citoplasmático, preservando as camadas do intestino delgado, conforme demonstrado nesta imagem.
Em particular, a manutenção das vilosidades e crips no lado luminal deve ser evidente após a microscopia eletrônica de varredura. Conservação adicional dos componentes da matriz extracelular, como colágeno, elastina e glico Por exemplo, a coloração Massen Tri CHRO permite a demonstração do tecido conjuntivo intacto no andaime.
Depois de assistir a este vídeo, você deve ter uma boa compreensão de como criar o andaime intestinal celular natural.
Visão Geral
Este artigo apresenta uma metodologia para criar uma matriz acelular a partir do intestino de rato, o que é crucial para aplicações em engenharia de tecidos e testes de fármacos.
Componentes Principais do Estudo
Área da Ciência
- Engenharia de Tecidos
- Biologia de Células-Tronco
- Testes de Medicamentos
Contexto
- A falência intestinal é uma condição crítica que afeta tanto crianças quanto adultos.
- Tratamentos convencionais, como nutrição parenteral e transplante, frequentemente são insuficientes.
- O desenvolvimento de um suporte intestinal tridimensional vascularizado poderia oferecer novas opções terapêuticas.
- A preservação da microarquitetura intestinal é fundamental para a funcionalidade do suporte.
Objetivo do Estudo
- Desenvolver um suporte acelular natural para engenharia de tecidos intestinais.
- Visualizar o processo de descelularização e a arquitetura do suporte.
- Resolver o problema clínico da falência intestinal.
Métodos Utilizados
- Canulação da artéria mesentérica superior de rato para colher o intestino delgado.
- Perfusão do intestino com água desionizada e desoxicolanato de sódio.
- Análise histológica e por microscopia eletrônica para avaliar a descelularização.
- Manutenção da rede vascular durante o processo de descelularização.
Resultados Principais
- O processo de descelularização preservou com sucesso a arquitetura intestinal.
- A rede vascular permaneceu intacta, permitindo a possibilidade de revascularização.
- A análise histológica confirmou a remoção completa dos componentes celulares.
- O suporte exibia uma aparência macroscópica semelhante à do intestino nativo.
Conclusões
- A metodologia desenvolvida oferece uma abordagem promissora para a criação de esqueletos intestinais.
- Essa técnica pode aprimorar futuras terapias para insuficiência intestinal.
- São necessárias mais pesquisas para explorar a integração funcional desses esqueletos in vivo.
Perguntas Frequentes
Relevância Executiva para a Indústria
A criação de um suporte intestinal acelular vascularizado aborda uma lacuna crítica na modelagem da insuficiência intestinal e na avaliação de terapias regenerativas. Este método de descelularização preserva o eixo vilosidade-cripta e a arquitetura da matriz extracelular, permitindo avaliações pré-clínicas mais preditivas da integração e função do suporte. Ao manter uma rede vascular pérvia, a abordagem apoia potenciais estratégias de revascularização, reduzindo a ambiguidade mecanicista em programas iniciais de engenharia de tecidos intestinais.
Aplicações Estratégicas em P&D de Biotecnologia e Farmacêuticos
Descoberta Inicial e Validação de Alvo
- Valor Científico: Permite a investigação das interações entre hospedeiro e estrutura de suporte e a sinalização da matriz extracelular em um microambiente intestinal fisiologicamente relevante.
- Valor Operacional: Fornece um modelo de tecido descelularizado reprodutível para avaliar a compatibilidade de biomateriais e a infiltração celular, sem variáveis imunológicas interferentes.
Triagem e Desenvolvimento de Ensaios
- Valor Científico: Oferece um suporte padronizado com microarquitetura preservada para avaliar a eficiência de semeadura celular, migração e diferenciação sob condições controladas de perfusão.
- Valor Operacional: Permite a ampliação do ensaio por meio da produção consistente de suportes mediante cânulação e perfusão vasculares, facilitando a triagem de alto conteúdo de candidatos terapêuticos.
Pesquisa Translacional e Pré-clínica
- Valor Científico: Mantém pistas estruturais relevantes para a doença (eixo vilosidade-cripta, colágeno, elastina, glicosaminoglicanos) que orientam a modelagem preditiva do remodelamento do suporte e sua integração in vivo.
- Valor Operacional: Permite a avaliação longitudinal da patência vascular e da estabilidade da matriz extracelular, essenciais para reduzir riscos nas decisões de avanço em programas de medicina regenerativa intestinal.
Integração de Pipeline e Fluxo de Trabalho
Este método se insere na continuidade entre descoberta e pré-clínica ao fornecer um suporte acelular caracterizado que sustenta testes de hipóteses na engenharia de tecidos intestinais, prontidão para ensaios em estudos de comportamento celular e continuidade translacional por meio da arquitetura e rede vascular preservadas.
- Biologia da Descoberta: Apoia a verificação de hipóteses sobre vias e respostas celulares dependentes da matriz extracelular em um microambiente intestinal semelhante ao nativo.
- Triagem: Fornece suportes prontos para ensaios com microestrutura reprodutível e capacidade de perfusão vascular para avaliação celular padronizada.
- Análises: Permite a avaliação quantitativa da eficácia da descelularização por meio da quantificação de DNA, histologia e microscopia eletrônica para confirmar a pureza do suporte e a integridade estrutural.
- Pesquisa Translacional: Preserva componentes específicos da matriz extracelular intestinal e a arquitetura vascular, apoiando a validação pré-clínica da integração do suporte e da remodelação pelo hospedeiro.
- Reutilização Empresarial: Estabelece uma plataforma escalonável de descelularização baseada em perfusão, aplicável a múltiplos tipos de tecidos, reduzindo os esforços de re-desenvolvimento em programas de suportes específicos por órgão.
Impacto Operacional e Empresarial
- Valor Científico: Aumenta a confiança preditiva ao preservar a microarquitetura intestinal e a composição da matriz extracelular, reduzindo falsos negativos nas avaliações pré-clínicas de eficácia.
- Valor Operacional: Garante reprodutibilidade por meio de parâmetros padronizados de perfusão e concentrações de reagentes de descelularização, minimizando a variabilidade entre lotes.
- Valor Estratégico: Melhora a tomada de decisões de avanço ou interrupção ao fornecer scaffolds vascularizados que predizem melhor a integração in vivo e os resultados funcionais.
- Impacto no Portfólio: Permite a priorização ajustada ao risco de candidatos à regeneração intestinal por meio de modelos de scaffolds validados que reduzem a perda biológica em estágios avançados.
Considerações de Implementação
- Requer experiência em cânula microcirúrgica vascular e configuração de sistema de perfusão para manter a integridade do esqueleto durante a descelularização.
- Depende do acesso a bombas peristálticas, tubos estéreis e ambientes com temperatura controlada (4°C e temperatura ambiente) para etapas sequenciais de perfusão.
- Necessita de protocolos padronizados para o preparo dos reagentes (por exemplo, desoxicolato de sódio 4%, DNAse) e controle de qualidade para garantir a remoção completa das células sem danificar a matriz.
- Requer adaptação das pressões e tempos de perfusão ao escalar para segmentos intestinais maiores ou espécies diferentes, mantendo a arquitetura das vilosidades e criptas.
- As limitações práticas incluem a necessidade de remoção cuidadosa de bolhas durante a perfusão para evitar danos vasculares e assegurar uma descelularização uniforme em todo o esqueleto.
