Anticorpo de coloração em C. Elegans Usando o "Freeze-Cracking"

O objetivo geral deste procedimento é realizar a coloração de anticorpos na elegância C. Para fazer isso, os nematóides são enxaguados, espalhados em lâminas e cuidadosamente comprimidos entre duas lâminas adesivas, que são então congeladas em gelo seco. Em seguida, as lâminas são separadas para abrir os nematóides e imediatamente colocadas no fixador.

Os nematóides são então corados usando anticorpos padrão A análise das técnicas de coloração por microscopia fluorescente revela uma coloração bem-sucedida de anticorpos de nematóides semi-intactos. A principal vantagem dessa técnica sobre os métodos existentes, como a fixação de nematóides intactos, é que ela minimiza o tratamento químico da amostra. Geralmente, os indivíduos novos neste método terão dificuldades porque preparar as lâminas e os nematóides é um pouco complicado de demonstrar.

O procedimento será eu e RTO Basu, um estudante de pós-graduação do meu laboratório Para preparar placas de nematóides para coloração, comece colocando um pedaço plano de metal em gelo seco para resfriá-lo usando água destilada e um enxágue com pipeta de vidro. Vermes crescidos em uma placa NGM de 60 milímetros com bactérias em um tubo de micro fuge de 1,5 mililitro. Os vermes podem ser sincronizados ou de idades mistas, mas evite usar placas com muitos dotes que são difíceis de quebrar ou vermes famintos, o que aumentará a autofluorescência usando a mesma pipeta de vidro.

Enxágue os vermes três a quatro vezes com água destilada para libertá-los de bactérias. Em seguida, para coletar principalmente adultos, deixe-os sentar no banco por três a cinco minutos. Depois que os vermes se acomodarem no fundo do tubo, remova a maior parte da água do tubo, deixando cerca de duas vezes o volume de água dos vermes, mas pelo menos 25 microlitros de volume total.

Rotule o lado fosco das lâminas de polilisina com tinta indelével e coloque as lâminas na bancada ao lado do recipiente com a etiqueta de gelo seco voltada para cima. Isso servirá como o slide inferior. Tenha um número igual de polilisina limpa tratada.

Slides superiores disponíveis. Em seguida, pipete cerca de 25 microlitros de minhocas em água na lâmina de aderência inferior e, usando a lateral da ponta da pipeta, espalhe as minhocas sobre o centro da lâmina. Deixe-os repousar por 30 segundos a dois minutos.

As extremidades dos vermes grudam ao entrar em contato com a lâmina. O aspecto mais difícil desse procedimento é evitar que os vermes fiquem muito distorcidos quando você estiver executando as próximas etapas. A melhor maneira de fazer isso é ser paciente, ter tudo pronto para ir e não beber muita cafeína para que suas mãos fiquem bonitas e firmes.

Segurando a corrediça inferior com uma mão, coloque a corrediça superior sobre ela de modo que todas as partes, exceto as foscas, fiquem sobrepostas. O líquido deve manter as lâminas ligeiramente afastadas para que os vermes ainda tenham alguma mobilidade. Não deixe o slide escorregar um sobre o outro, o que torcerá os vermes.

Em seguida, usando os polegares e indicadores de cada mão, pressione cuidadosamente a corrediça superior Com a quantidade certa de pressão, alguns dos maiores hermafroditas se romperão na borda da lâmina. Enquanto a maioria dos adultos e larvas entrará em contato com cada lâmina, mas permanecerá intacta imediatamente e com cuidado, sem permitir que as lâminas escorreguem, coloque-as no pedaço de metal em gelo seco. Dentro de um minuto, as lâminas parecerão congeladas, mas mantenha-as lá por cinco minutos para garantir que estejam completamente congeladas.

Os slides agora estão prontos para fixação. Se não prosseguir, guarde imediatamente as lâminas em uma caixa rotulada a 80 graus Celsius negativos por vários dias. Eles devem ser usados dentro de uma semana ou mais após serem feitos.

Não use as lâminas após armazenamento de longo prazo. Nematóides individuais também podem ser preparados em lâminas em um método semelhante ao mostrado anteriormente. Coloque um pedaço plano de metal em gelo seco para resfriá-lo.

Em seguida, use uma picareta de minhoca para transferir nematóides individuais para uma gota de água em uma placa NGM para libertá-los das bactérias. Os nematóides devem ser bem alimentados para diminuir a autofluorescência. Se possível, repita a transferência para novos pontos de água conforme necessário até que o verme esteja livre de bactérias.

Em seguida, prepare os slides superior e inferior como antes. Em seguida, coloque uma gota de cinco a 10 microlitros de água na área tratada com polilisina da lâmina inferior enquanto observa com um microscópio. Use uma picareta de minhoca para transferir até 20 minhocas para a gota d'água.

Os vermes devem afundar para tocar a superfície pegajosa da corrediça. Em seguida, coloque a corrediça superior como antes, mas não comprima, garantindo que as corrediças não escorreguem imediatamente. Coloque as corrediças no metal sobre gelo seco.

Mantenha em gelo seco por cinco a 30 minutos e proceda imediatamente à fixação. Esses slides não podem ser armazenados para uso posterior. Para fixar levemente os vermes, comece colocando frascos de coloração contendo soluções de fixação no gelo para resfriá-los por 10 minutos.

As soluções necessárias são 100% de metanol, 100% de acetona e solução salina tamponada com fosfato. Pegue um par de lâminas inferior e superior do gelo seco, torça-as rapidamente e mergulhe imediatamente a lâmina inferior em metanol gelado por dois minutos, descarte a lâmina superior. Em seguida, transfira as lâminas de metanol para acetona gelada por quatro minutos.

Se as lâminas tiverem muitos vermes, a maioria deles cairá no fixador, mesmo com lâminas bem preparadas. Se as lâminas de minhoca única foram preparadas adequadamente, as minhocas devem permanecer aderentes. Por fim, para enxaguar o fixador, mergulhe as lâminas no frasco com PBS.

As lâminas agora estão prontas para coloração para realizar uma correção dura usando formaldeído ou glutaraldeído. Comece diluindo a solução de formaldeído ou glutaraldeído de grau reagente em PBS até uma concentração final de 0,5 a 4%As alíquotas podem ser armazenadas a menos 20 a menos 30 graus e descongeladas conforme necessário. Lembre-se, sempre o formaldeído e o glutaraldeído são muito tóxicos, então você precisa usar luvas e trabalhar em uma capela de exaustão.

Pegue um par de slides inferior e superior do gelo seco e separe rapidamente imediatamente. Coloque a lâmina inferior que contém as minhocas em um prato plano com tampa, descarte a lâmina superior imediatamente pipeta 200 microlitros do fixador sobre o centro da área da lâmina. Com vermes, o fixador congela parcialmente no lugar e depois derrete para cobrir uma região maior da lâmina.

Se os vermes não estiverem totalmente cobertos com fixador imediatamente e com cuidado, adicione mais fixador usando uma micropipeta. Não permita que o fixador flua sobre a borda da lâmina. Adicione lenços umedecidos dobrados e sem fiapos ao prato para mantê-lo umidificado.

Não permita que os lenços toucem os slides. Em seguida, cubra o prato com uma tampa e deixe-o por 10 minutos durante a noite em temperatura ambiente após a conclusão da fixação, use uma pipeta para transferir cuidadosamente o fixador com vermes soltos para um tubo de 1,5 mililitro. Em seguida, mergulhe a lâmina em um frasco de coloração contendo PBS.

Gire o tubo contendo os vermes em alta velocidade por 30 segundos para pellet-los. Enxágue as minhocas duas vezes com PBS. Em seguida, prossiga para cortá-los em paralelo com os vermes na lâmina.

O protocolo de coloração de anticorpos é semelhante aos protocolos padrão para qualquer tecido em lâminas e é descrito em detalhes no documento que acompanha. Após a coloração, transfira as lâminas para PBS e deixe-as permanecer lá por até 12 horas a quatro graus Celsius até que estejam prontas para serem montadas. Para montar as lâminas, remova uma lâmina do PBS.

Use um pano sem fiapos para secar a parte de trás e, em seguida, coloque-o brevemente sobre uma toalha de papel rapidamente. Coloque cerca de 20 microlitros de meio de montagem sobre as minhocas de modo que haja partes aproximadamente iguais de meio e PBS. No slide.

Incline suavemente a lâmina para misturar as duas soluções. Cuidado: o meio de montagem é tóxico. Segurando a borda fosca.

Incline a lâmina para que a solução se acumule perto do glacê. Em seguida, coloque uma borda de uma lamínula de 24 por 60 milímetros na solução para minimizar as bolhas de ar que aumentam o branqueamento e atrapalham a visualização. Abaixe a lamínula suavemente.

Se houver formação de bolhas, levante lentamente a borda da lamínula. Então, sem deslizar pelas minhocas, abaixe-o novamente. Adicione mais PBS, se necessário, para eliminar bolhas de ar.

Usando um pano sem fiapos, comprima as bordas da lamínula e deslize com cuidado para secar a borda. A borda do slide deve ser visível em toda a borda da lamínula e não deve estar muito molhada. Sele a lamínula e aplique duas a três camadas de esmalte na borda.

Assim que a lâmina estiver bem selada e seca, limpe a lamínula e a parte de trás da corrediça e coloque-a em um compartimento porta-lâminas. As lâminas seladas podem ser mantidas dias a quatro graus Celsius ou semanas a menos 20 graus Celsius por períodos mais longos. A coloração manchada de DNA e a maioria dos corantes verdes desbotam e selam novamente a lamínula com mais esmalte conforme necessário, principalmente após o uso de qualquer lente de imersão em óleo.

As seguintes imagens representativas foram coletadas por meio de lâminas feitas durante as primeiras tentativas de coloração de anticorpos de alunos de graduação em um curso de laboratório de biologia celular. Esta imagem mostra um exemplo das cabeças de dois hermafroditas adultos que estão devidamente comprimidos, rachados e levemente fixados com metanol acetona. Eles foram marcados com vários anticorpos e corantes.

Nesse caso, praticamente todo o verme é acessível aos anticorpos. Coloração aqui, a localização dos núcleos, conforme indicado pela coloração DPI, indica quais partes do verme estão intactas. Quando os vermes são submetidos a um fixador mais duro, como o formaldeído, a morfologia do verme pode ficar distorcida.

Isso pode ser visto nessas imagens como uma aparência ondulada dos músculos mostrados em vermelho. Outro problema comum associado ao uso de fixadores mais duros é a fixação ou penetração irregular de tecidos específicos. Isso pode ser visto aqui, onde o músculo mostrado em vermelho está manchado apenas em uma parte do verme.

Aqui, a presença de outras colorações, incluindo DNA, mostradas em azul indica que pelo menos parte do corpo estava presente. O padrão resultante de coloração parcial pode ser prontamente identificado com a prática, de modo que toda a distribuição da coloração possa ser determinada, mesmo que qualquer verme apresente coloração irregular. Problemas comuns encontrados com rachaduras por congelamento usando qualquer condição de fixação são ilustrados aqui.

O problema mais comum é a torção da amostra devido ao movimento relativo das duas lâminas. Durante a compressão Aqui, a morfologia dos tecidos corados indica que o corpo do verme é torcido logo posterior da faringe. Esta imagem também mostra o problema com a coloração de fundo devido ao anticorpo aderido à polilisina que reveste a lâmina.

Isso pode ser evitado usando o microscópio confocal. Observe que, mesmo com a prática, muitos worms individuais serão perdidos ou mostrarão alguns dos problemas mostrados aqui. Uma vez dominado, a preparação e fixação podem ser feitas em uma hora e a coloração pode ser feita em um dia.

Após este procedimento, uma variedade de métodos de fixação pode ser realizada para otimizar a coloração de qualquer anticorpo e tecido.