Name: Anticorpo de coloração em C. Elegans Usando o Freeze-Cracking (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-10-14T21:15:00.000+00:00
Duration: 13 min 10 s
Description: Aprenda a técnica de freeze-cracking para coloração de anticorpos em C. elegans, minimizando tratamentos químicos e preservando a localização proteica. Ideal para estudos de biologia celular e neurociência.

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O financiamento foi fornecido pela NSF CCLI # 0633618 e da Universidade de Ohio. Algumas cepas foram fornecidos pelo Caenorhabditis Genetics Center. Pós-graduanda Reetobrata Basu aparece no vídeo.

NOTA: Várias etapas do protocolo são apresentados com opções para set-up e preparação, dependendo das condições específicas de cada ensaio. Para estes casos, as etapas alternativas são apresentados como A, B, C, etc O protocolo com passos alternativos é descrito na Figura 1. 1. Preparação de Slides Polilisina revestidos Podem ser utilizados três tipos diferentes de lâminas, dependendo da troca desejada entre a facilidade de preparação, a adesão relativa, e a ligação não específica do anticorpo. Detalhes das alternativas de preparação de diapositivos são apresentados abaixo nas etapas 1A-1C, a fim de aumentar a aderência e complexidade. Lâminas preparadas por estes métodos diferentes podem ser usados ​​em conjunto para uma única experiência. 1A. Sem preparação da lâmina Polilisina revestido lâminas comercialmente disponíveis fornecem baixa adesão e baixo de fundo. 1B. Deslize preparation óptima para a fixação de metanol-acetona Adesão médio e baixo de fundo. <ol><li> Prepara-se uma solução de polilisina por imersão das lâminas: Adicionar 400 mg de peso molecular muito elevado (150.000 - 300.000 D) poli-L-lisina a 200 ml de água bidestilada. Adicionar 2 ml de 10% de estoque de azida de sódio (concentração final 0,1%) como conservante. CUIDADO: seca azida de sódio é reativo e todas as formas são tóxicas. Usar máscara e luvas ao pó de pesagem para fazer 10% de ações em água bidestilada. </li><li> Limpe finais único lâminas de vidro fosco com toalhetes sem fiapos, removendo manchas e partículas. Isto deve ser feito mesmo em lâminas comprados com a designação &quot;previamente limpas.&quot; </li><li> Colocar as lâminas back-to-back em um suporte de slide, jar coplin ou outro recipiente coloração slide, mantendo bordas foscas e não muito perfeitamente alinhados (para fazer a separação depois mais fácil). Colocar o suporte fatia na proveta com 70% de etanol (álcool de grau de reagente não é necessário) com HCl a 1% em diágua acalmou ou preencher tina de coloração para o nível de cobertura. Rocha lâminas em solução de um mínimo de 5 minutos. ATENÇÃO: Esta solução é corrosiva, usar luvas. NOTA: Esta solução pode ser reutilizado várias vezes (até vários meses). </li><li> Lavar as lâminas em água corrente destilada por 1 min. </li><li> Lâminas secar completamente em um ambiente livre de poeira ou por colocação em um forno de 40-60 ° C durante 30-60 min ou por se manter durante a noite à temperatura ambiente. </li><li> Incubar as lâminas em solução polilisina (cobrindo partes unfrosted) no balancim para 15 min. </li><li> Repetir a secagem das lâminas. </li><li> Repita polilisina solução de incubação e as etapas de secagem. </li><li> Separe os slides usando um objeto de metal fino, como uma espátula fina de peso. Se forem devidamente respeitados, eles são difíceis de separar. Usar equipamento de segurança adequado (óculos de segurança) e trabalhar no banco de papel superior (para ser descartado após o uso), desde pequenos pedaços de vidro pode voar solta quando lâminas são separadas. </li><li> Armazenar slides em limpoCaixa (livre de poeira) slides a 4 ° C até ser necessário. </li></ol> 1C. Deslize a preparação ideal para a fixação em formol Maior adesão, mas de alta fundo. <ol><li> Colocar as lâminas preparadas com método 1B plana e em um forno-safe livre de poeira (para a secagem no forno) ou em uma superfície plana livre de poeira (para secagem do ar). </li><li> Colocar uma gota de 20-60 ul da solução de polilisina no meio de cada lâmina. </li><li> Lâminas secar completamente em forno ou em temperatura ambiente. A polilisina vai deixar para trás ovais pálidos como se evapora. Estes ovais são muito adesivas. Infelizmente, eles também se ligam aos anticorpos primário e secundário, até mesmo após o bloqueio. </li><li> Armazenar slides em limpar caixa de slides (livre de poeira) a 4 ° C até ser necessário. </li></ol> 2. Preparação de congelados Nematode Slides Prepare nematóides para coloração por enxaguar completamente livre de bactérias através do método 2A (para placas de nematóides) ou2B (para nemátodos individuais). 2A. Preparação de slides de placas de nematóides <ol><li> Coloque uma peça plana de metal em gelo seco para prechill. </li><li> Use água destilada e uma pipeta de vidro (diminui a perda de vermes) ou micropipeta para enxaguar worms de placa NGM com bactérias em um microtubo de 1,5 ml. As placas podem ser sincronizados ou misturado as idades, não use placas com muitos dauers (difíceis de roer) ou vermes esfomeados (aumento da autofluorescência) a menos que necessário. </li><li> Lave os vermes 3-4x com água destilada até livre de bactérias. (Para diminuir a perda de vermes usar a mesma pipeta de vidro.) Para agregar vermes, ou deixá-los sentar-se no banco para 3-5 min (para coletar principalmente adultos do fundo do tubo) ou spin 30 segundos a ~ 1.000 rpm (~ 500 g) em uma centrífuga de mesa (para coletar adultos, larva e embriões). </li><li> Remover a maior parte da água do tubo de vermes, deixando cerca de duas vezes o volume de água como vermes (mas o volume total de, pelo menos, 25 ul). </li><li&gt; Etiqueta lado fosco do &quot;bottom&quot; (tratado no passo 1) lâminas de polilisina com tinta e colocar as lâminas indeléveis no contador ao lado de recipiente com gelo seco, com a etiqueta para cima. </li><li> Tenha um número igual de regulares (limpo, mas não tratados polilisina) slides &quot;top&quot; disponíveis. </li><li> Lugar ~ 25 ul vermes na água no &quot;fundo&quot; de slides aderente e espalham o líquido contendo os vermes sobre a parte central do slide usando o lado do ponta da pipeta. </li><li> Deixe que os vermes se contentar com 30 seg a 2 min. Se o slide é adequadamente pegajoso, as extremidades dos vermes vai ficar como eles em contato com o slide. </li><li> Segure a lâmina inferior em uma mão e coloque a parte superior de slides sobre a lâmina inferior de modo que todos, mas as áreas congeladas são sobrepostos. O líquido deve manter as lâminas ligeiramente afastadas, de modo que os vermes ainda mover-se ligeiramente Não deixe que as lâminas deslizam uns sobre os outros -. Este torce os vermes. </li><li> Cuidadosamente pressione para baixo slevemente no topo slide, usando os polegares e indicadores de cada mão. Com a quantidade ideal de pressão, alguns dos maiores hermafroditas na borda dos slides irá romper, enquanto a maioria dos adultos e larvas entrará em contato com cada slide, mas vai permanecer intacta. </li><li> Imediatamente e com cuidado (sem escorregar) colocar os slides sobre o pedaço de metal em gelo seco. Os slides devem aparecer congelado dentro de um minuto. Manter em gelo seco por 5 minutos até ficar bem gelado. </li><li> Neste ponto, as lâminas podem ser armazenadas numa caixa marcado a -80 ° C durante vários dias. (Se forem mantidos semanas a -80 ° C, a água começa a sublimar distância e os vermes não mancha bem). Se as lâminas são armazenadas a -80 ° C, deixe-os &#39;aquecer&#39; em gelo seco por 10 min antes de rachar. </li><li> Vá para a etapa 3 (fixação). </li></ol> 2B. Preparação de lâminas de nematóides individuais <ol><li> Coloque uma peça plana de metal em gelo seco para PRECcolina. </li><li> Use uma pick verme para transferir nematóides individuais para uma gota de água sobre uma placa NGM para libertá-los a partir de bactérias. Nematóide (s) deve ser bem alimentado para diminuir autofluorescência, se possível. Repita a transferência para novos pontos de água, conforme necessário, até verme (s) estão livres de bactérias. </li><li> Rotular lado fosco dos &quot;de baixo&quot; slides de polilisina com tinta e colocar as lâminas indeléveis no contador ao lado de recipiente com gelo seco, com a etiqueta para cima. Ter um número igual de menos aderente &quot;top&quot; (não tratadas) desliza disponíveis. </li><li> Coloque uma gota mL 5-10 de água na região da lâmina inferior tratado duplo com polilisina. Use o volume maior se transferir mais vermes, para evitar que a água evapore antes da conclusão. </li><li> Transfira o worm (s) para a gota de água com a pick verme, usando o microscópio para ver como os vermes afundar para tocar a superfície da lâmina pegajosa. Transferir tão poucos como um verme para até 20 + vermes por gota. </li><li> Segure o S fundolide com uma mão e coloque o topo deslizar sobre a lâmina inferior de modo que todos, mas as áreas congeladas são sobrepostos. </li><li> Imediatamente e com cuidado (sem escorregar ou comprimir) colocar os slides sobre o pedaço de metal em gelo seco. Manter em gelo seco para 5-30 min. (Não guarde esses slides longo prazo, como os slides seca facilmente para fora.) </li><li> Vá para a etapa 3 (fixação). </li></ol> 3. Fixação Fixadores são necessárias para &quot;consertar&quot; o antígeno no local na célula, por um ou outro precipitante (&quot;fixação de luz&quot;) ou de ligação cruzada (&quot;fixação duro&quot;) o antígeno. Fixação pode perturbar antigenicidade; anticorpos mais conhecidas funcionam melhor com uma condição fixação particular. Para os novos anticorpos, uma gama de condições de fixação deve ser testado. Para qualquer mecanismo de fixação, o primeiro passo é o de preparar uma solução salina tamponada com fosfato. Próxima dose slides com nematóides para coloração de anticorpos usando o método A (luzcorrigir usando metanol e acetona) ou B (correção mais difícil usando formaldeído ou glutaraldeído). <ol><li> Prepara-se uma solução 10x PBS (tampão fosfato salino) estoque estéril por adição de 80 g de NaCl, 2,0 g de KCl, 27,2 g de Na 2 HPO 4 • H 2 0, 2,4 g de KH 2 PO 4, estoque de azida de sódio a 20 ml de 10%. Para fazer com que esta solução de estoque, pesam-se azida de sódio em pó para fazer uma solução a 10% em água destilada duas vezes. Mexa salina com calor suave até dissolver. CUIDADO: seca azida de sódio é reativo e todas as formas são tóxicas. Usar máscara e luvas ao trabalhar com azida de sódio seco ou soluções. </li><li> Deixe arrefecer salino (Tris pH é sensível à temperatura), em seguida o pH para 7,2 com NaOH 1-10 H. Top para 1 L com água bidestilada e autoclave para esterilizar. Conservar à temperatura ambiente e diluir a 1x, conforme necessário, com água duplamente destilada estéril. CUIDADO: NaOH é cáustico - use luvas durante o uso. </li></ol> 3A. Correção de luz usando metanol-acetona <ol><li> Coloque 100% de metanol, 100% de acetona, e 1 x tampão fosfato salino (PBS), em frascos de coloração em gelo para prechill durante pelo menos 10 min. CUIDADO: O metanol e acetona são tóxicos, use luvas. </li><li> Pegue um par de lâminas inferior e superior do gelo seco, rapidamente torcê-los à parte, e imediatamente mergulhe o slide &quot;fundo&quot; no gelo metanol frio por 2 min. O slide &quot;top&quot; pode ser descartado. </li><li> Transferência de slides de metanol para acetona gelada por 4 min. Se os slides tinha muitos vermes, a maioria (90%) vai cair na correção, mesmo com os slides melhor preparados. Se desliza sem-fim único foram devidamente preparados, os vermes deve ficar aderido. </li><li> Coloque ou mergulhar as lâminas na jarra com PBS (para enxaguar fixador) e vá para a etapa 4 (coloração). </li></ol> 3B. Correção rígido usando formaldeído ou glutaraldeído <ol><li> Diluir reagente formaldeído grau ou solução de glutaraldeído em 1x PBS para 0,5-4% de concentração final. Alíquotas (1,5 ml) may ser armazenados bem tapado a -20 a -30 ° C; descongelar alíquotas em gelo imediatamente antes da utilização. NOTA: As soluções de formaldeído degradar ao longo do tempo e com a exposição ao ar. CUIDADO: formol e glutaraldeído são tóxicos, usar luvas e trabalhar no bairro. </li><li> Pegue um par de lâminas inferior e superior do gelo seco, rapidamente torcê-los à parte, e colocar imediatamente o slide &quot;fundo&quot; com vermes no prato raso com tampa. (A corrediça de topo pode ser descartado). </li><li> Imediatamente pipeta 200 uL fixador tóxico sobre o centro da área da corrediça com vermes. O fixador será parcialmente congelar no lugar, então derreter para cobrir uma região maior do slide. </li><li> Se os vermes não são totalmente cobertos com fixador, adicione imediatamente e com cuidado mais fixador usando uma micropipeta. Não permita que o fixador para fluir ao longo da borda do slide. </li><li> Cobrir a placa com uma tampa e deixar durante 10 minutos a durante a noite à temperatura ambiente. Certifique-se o prato é umidificado se incubações mais are usado - isso pode ser feito através da adição de toalhetes sem fiapos molhadas dobradas para o prato. Não deixe que os toalhetes tocar nos slides. </li><li> Após a fixação estiver concluída, pipetar cuidadosamente o fixador com vermes soltas em um tubo de 1,5 ml e mergulhar o slide em uma tina de coloração com PBS. </li><li> Gire o tubo com vermes que vieram soltos em alta velocidade por 30 segundos para sedimentar. Lave os vermes duas vezes com PBS, em seguida, processar em paralelo com os vermes nos slides (fazendo passos em tubos de microcentrífuga, em vez de em lâminas). </li><li> Vá para a etapa 4 (coloração). </li></ol> 4. Anticorpo de coloração O protocolo de coloração de anticorpo é semelhante para os protocolos padrão para qualquer tecido em lâminas. Este protocolo é o mesmo para todas as lâminas, independentemente de a preparação em passos 1-3. <ol><li> Preparar tampão de anticorpo através da mistura de 700 ml de água destilada duas vezes, com 100 ml de PBS 10x, 5 mL de Triton X-100 (0,5% final), 2 ml de EDTA 0,5 M pH 8 (1 mM final), 1 g de BSA (0,1% final), az sódio 5 ml de 10%solução ide (0,05% final). pH para 7,2 com HCl, em seguida, adicione água bidestilada para 1 L; armazenar a 4 ° C. </li><li> Prepare bloco por soro de burro a reconstituição com água bidestilada, em seguida, a adição de 5 ml de soro de 45 ml de tampão de anticorpo (soro final de 10%). </li><li> Preparar soluções de anticorpos primários e secundários diluindo anticorpo em tampão anticorpo mais 1% BSA. Diluições recomendadas são 1:50-1:2,000 de anticorpos primários e 1:1,000-1:5,000 para anticorpos secundários (anticorpos de burro conjugado Cy3or OG488 contra as espécies usadas para aumentar o anticorpo primário). </li><li> Prepare estoque DAPI misturando 2,5 mg / ml em água bidestilada; loja em 8 mL alíquotas congeladas a -30 ° C. CUIDADO: DAPI é um corante de ligação DNA tóxico, usar luvas durante a pesagem e distribuição em alíquotas. </li><li> Preparar 10 ml de Meio de Montagem, misturando 200 mg de galato de n-propilo, 0,3 ml de Tris 1 M pH 9, 2,7 mL de água bi-destilada num tubo de 15 ml. Aquece-se a 65 ° C durante cerca de 10 minutos até dissolver.Adicionar 7 ml de glicerol e uma alíquota de 8 mL de DAPI e vórtice bem. Médio Alíquota em tubos de 1,5 ml, embrulhe em papel alumínio, e guarde em luz, a 4 ° C (ar e luz degradar o meio - se torna-se mais amarela, descarte no lixo Biohazard). CUIDADO: n-propil galato é um anti-oxidante reativo, usar luvas durante a pesagem. </li><li> Transferir as lâminas para uma tina de coloração com o Bloco por 1 hora em temperatura ambiente ou durante a noite a 4 ° C (overnight preferível para correção difícil). Evite agitação para evitar a perda de worms. </li><li> Transferir as lâminas para coloração frasco com anticorpo primário ou colocar as lâminas planas em um prato umedecido e cubra cada uma com 100-500 anticorpo primário mL. Incubar as lâminas durante a noite a 4 ° C sem agitação. </li><li> Depois de anticorpo primário incubação, transferência desliza a manchas frasco de PBS. </li><li> Filtro de bloco através de funil forrado com papel de filtro e armazenar a 4 ° C; se estéreis filtradas cada 1-2 semanas, Bloco pode ser reutilizado para um ou mais meses. Da mesma forma, filtrar e salvaranticorpo primário a 4 ° C para reutilização (para até 10 ou mais rodadas de coloração). </li><li> Lavar as lâminas três vezes (~ 20 min cada) em tampão de anticorpo. </li><li> Colocar as lâminas em anticorpo secundário de coloração num recipiente à prova de luz e incubar 4 horas a temperatura ambiente ou durante a noite a 4 ° C. </li><li> Transferir as lâminas para coloração frasco de PBS. Filtro e salvar anticorpo secundário a 4 ° C para reutilização (para até 10 ou mais rodadas de coloração). </li><li> Lavar as lâminas três vezes (~ 20 min cada) em tampão de anticorpo. </li><li> Transferir as lâminas para PBS e deixar em PBS (minutos a durante a noite a 4 ° C) até que esteja pronto para montagem. </li><li> Trabalhar rapidamente em slides individuais, de modo que os vermes na frente de slides ficar molhado. Remover uma lâmina da PBS, secar parte de trás da lâmina com uma limpeza sem fiapos, e coloque sobre toalha de papel. </li><li> Lugar ~ 20 l de meio de montagem sobre vermes para que não haja partes aproximadamente iguais médio e PBS em slides e inclinação deslize suavemente para misturar as duas soluções. CAUTION: Meio de montagem é tóxico. </li><li> Tilt slides borda assim fosco é mais baixo e solução reúne perto de geada, em seguida, coloque uma borda de 24 x 60 mm lamela em solução. </li><li> Abaixe cuidadosamente a lamela para minimizar bolhas de ar (que aumentam branqueamento e atrapalhar a visualização). Se formar bolhas, levantar a extremidade da lamela lentamente, em seguida, relower sem deslizamento da lamela entre os vermes. </li><li> Secar cuidadosamente a borda do slide sem mover a lamela, comprimindo as bordas com uma limpeza sem fiapos. A vantagem relativamente seco da lâmina tem de ser visível ao redor da extremidade da lamela </li><li> Selar a lamela com 2-3 camadas de unha polonês. Slides podem ser colocados em um suporte de slides plana durante a preparação e armazenamento para proteger da luz. Uma vez slide é bem fechado e seco, limpe a lamela e de trás do slide. </li><li> Desliza bem fechados podem ser mantidos no escuro durante dias a 4 ° C ou semanas à temperatura de -20 ° C. Durante longos períodos, DAPI staining de DNA ea maioria dos corantes verdes (por exemplo, 488 nm de excitação) fade. Selar a lamela com mais unha polonês, conforme necessário, por exemplo, após o uso de qualquer lente de imersão em óleo. </li></ol>

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</ol>

O autor declara que não tem interesses financeiros concorrentes.

O protocolo de congelamento de craqueamento é um dos vários métodos para a coloração do anticorpo em C. elegans. Ele fornece uma maneira relativamente simples de manchar vermes, mas exige reagentes específicos e prática para os melhores resultados. As etapas críticas (esboçado na Figura 1) incluem: 1) preparação de slides (consulte as etapas 1 e 2) de compressão manual dos nematóides (veja as etapas 2 e 3) de fixação rápida (ver passo 3). Em primeiro lugar, para maximizar a adesão dos nemátodos...

Para determinar a localização celular e subcelular de proteínas, os cientistas têm tradicionalmente marcado tecidos com anticorpos seleccionadas para reconhecer especificamente um especial proteínas. Em alguns organismos modelo, como C. elegans, coloração do anticorpo foi frequentemente substituído por técnicas de genética molecular, que produzem resultados mais rapidamente. Estes incluem a transformação de organismos com construções que consistem de fusões de genes entre as regiões de codificação do gene de interesse e proteína fluorescente verde e promotor. No entanto, as técnicas moleculares estão sujeitas a um número de artefactos, incluindo problemas com a saber o verdadeiro promotor e alterações na expressão de construções no número de cópias alto (as técnicas usuais em C. elegans) 2,3. Portanto, a coloração com anticorpos continua a ser uma meta para muitos cientistas que estudam a função da proteína in vivo. A coloração de tecidos com anticorpos pode ser difícil, uma vez que umtibodies só pode reconhecer o seu antígeno em uma determinada conformação 1. Por exemplo, os anticorpos podem reconhecer apenas antígeno desnaturado ou intacto fixo de uma maneira particular e pode não reconhecer o antígeno in situ. O problema de coloração do anticorpo em nemátodos é exacerbado pelo facto de a cutícula do nemátodo forma uma barreira relativamente impermeável, impedindo o acesso dos anticorpos aos tecidos. Existem vários métodos diferentes usados ​​para a coloração do anticorpo em C. elegans (revisado em nosso trabalho anterior 4). Para manchar intactas &#39;vermes&#39;, métodos foram desenvolvidos para congelar e descongelar em um fixador relativamente duro (formaldeído ou glutaraldeído), os ciclos de congelamento e descongelamento ajudar a quebrar a cutícula para permitir a rápida penetração do fixador 5. Após a fixação, a cutícula foi permeabilizadas para permitir a penetração do anticorpo; métodos incluído o tratamento com agentes, colagenase, ou ambos 5-7 redução. Estes treatments preservada morfologia, mas o reconhecimento de anticorpos frequentemente reduzido ou destruído. Os métodos alternativos incluem a dissecção 8 para permitir a penetração do anticorpo. &quot;Freeze-cracking&quot; é um meio de ganhar acesso ao interior do semi-sem-fim para permitir que o anticorpo intacto de coloração 9-10. Congela-craqueamento pode ser realizada com uma variedade de condições de fixação, evitando tratamentos de colagenase e de redução. Os nemátodos são colocados entre duas lâminas de adesivos, congelado, e, em seguida, as lâminas são separadas, deixando a maior parte do nemátodo na lâmina inferior e a maior parte da cutícula na corrediça superior. A corrediça inferior pode ser colocado em fixador e toda a lâmina com nemátodos aderidas é transferida através do procedimento de coloração do anticorpo. O método não apresenta duas grandes dificuldades. Primeiro, é difícil de aplicar a quantidade correcta de pressão necessária para dividir os nematóides, sem comprometer seriamente deformando-as. Em segundo lugar, muitos dos vermes não vai sassinale a qualquer slide, e serão perdidas no fixador ou lavagens. No entanto, com as lâminas e práticas adequadas, o método irá produzir rapidamente os nemátodos com morfologia razoável que pode ser usado com uma grande variedade de fixadores e anticorpos. O método pode ser ligeiramente variada, dependendo do objetivo do experimentador. Se a coloração de nemátodos individuais se desejado (por exemplo, para determinar se um único transformante alterou coloração do anticorpo) e, em seguida desliza com adesão máxima (mas maior fundo de coloração) pode ser utilizado, tais como lâminas, obtidos em laboratório com polilisina adicional (ver abaixo). Para formaldeído ou glutaraldeído fixação, lâminas de adesão mais elevados (slides de polilisina preparado em laboratório) devem ser utilizados, uma vez que nematóides aderir mais mal ao polilisina depois dessas fixações. Se tipo selvagem nemátodos estão fixadas com metanol e / ou de acetona, em seguida desliza para baixo com a adesão e menor coloração de fundo deve ser utilizada (comercial ou llâminas aboratory preparado). Se uma variedade de anticorpos e fixadores estão a ser utilizados em laboratório, uma variedade de lâminas podem ser preparadas com antecedência e guardadas até serem necessários. Após o acesso ao tecido nematóide foi adquirida, procedimentos de coloração de anticorpos seguir métodos padrão (com incubações mais característicos de tecidos em vez de células 1,11).

<table><tbody><tr><td>corrediça de poli-L-lisina (marca ESCO)</td> <td>Fisher</td><td>12-545-78</td><td>Sigma corrediças da marca também adequado</td></tr><tr><td>bromidrato de poli-L-lisina</td><td>Sigma</td><td>P1524</td><td><forte>IMPORTANTE: </forte> Marca e alto peso molecular de polilisina crítica</td></tr><tr><td>única borda fosca slides</td><td>Fisher</td><td>48312-002</td><td>Outras marcas são adequadas</td></tr><tr><td>azida de sódio</td><td>Sigma</td><td>S2002-25G</td><td>TÓXICO, use luvas e máscara enquanto pesa o pó para fazer 10% de estoque. Use luvas ao canalizar o</td></tr><tr><td>frasco de coloração de coplin</td> de solução de estoque <td>VWR</td><td>47751-792</td><td>Outras marcas são adequadas</td></tr><tr><td>para envelope de 5 lâminas</td><td>Ciência da Microscopia Eletrônica</td><td>71549-01</td><td>Uma das muitas marcas diferentes de porta-lâminas pequeno, adequado para coloração</td></tr><tr><td>de Paraformaldeído</td><td>VWR</td><td>MK262159</td><td><forte>IMPORTANTE:</forte> Soluções regulares de formalina (37% de formaldeído) NÃO são adequadas. 1) Dissolva o paraformaldeído crisatlalina em tampão fosfato e armazene em pequenas alíquotas congeladas. Ou 2) comprar paraformaldeído de grau de microscopia eletrônica em alíquotas. TÓXICO - use luvas; Descarte o excesso da pia com água.</td></tr><tr><td>Solução de glutaraldeído, 25% em água</td><td>Sigma</td><td>G 5882</td><td><forte>IMPORTANTE:</forte> comprar glutaraldeído grau de microscopia eletrônica em ampolas; TÓXICO - use luvas; Descarte o excesso da pia com água.</td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>VWR</td><td>EM-9410</td><td>Outras marcas são adequadas</td></tr><tr><td>Soro bovino Albumina</td><td>Fisher</td><td>ICN820451</td><td>Outras marcas são adequadas</td></tr><tr><td>Soro de burro, liofilizado</td><td>Jackson Immunoresearch</td><td>017-000-121</td><td>Outras marcas são adequadas</td></tr><tr><td>Cy3 Burro anti-rato IgG multi-rotulagem</td><td>Jackson Immunoresearch</td><td>715-165-150</td><td>Esta empresa é recomendada para anticorpos multi-rótulo (esgotados por afinidade) de alta qualidade. Selecione o corante e o antígeno apropriados (animal usado para aumentar o anticorpo primário). </td></tr><tr><td>galato de n-propila</td><td>Fisher</td><td>ICN10274750</td><td>Outras marcas são adequadas</td></tr><tr><td>DAPI, dicloridrato de 4',6'-diamidino-2-fenilindol</td><td>Sigma</td><td>D 9542</td><td>TÓXICO. Use luvas e dispense em pequenas alíquotas e feeze para minimizar a exposição</td></tr><tr><td>Whatman #1 Filtros de 15 cm de diâmetro</td><td>Fisher</td><td>09805G</td><td></td></tr><tr><td>Coverslip #1 1/2 retângulo 24 x 60 mm</td><td>VWR</td><td>48393-252</td><td>#1 1/2 espessura é opticamente melhor</td></tr><tr><td>Pasta de lâminas de microscópio</td><td>VWR</td><td>48429-092</td><td>Outras marcas são adequadas</td></tr></tbody></table>

anticorpo de coloração em<em&gt; c. elegans</em&gt; usando o &quot;freeze-cracking&quot;

Antibody Staining in C. Elegans Using &quot;Freeze-Cracking&quot;

Para manchar C. elegans com anticorpos, a cutícula relativamente impermeável deve ser contornado por métodos químicos ou mecânicos. &quot;Freeze-cracking&quot; é um método usado para puxar fisicamente a cutícula de nematóides comprimindo nematóides entre duas lâminas de aderentes, congelá-los, e puxando os slides separados. Congela-craqueamento proporciona uma maneira simples e rápida para obter acesso aos tecidos sem tratamento químico e pode ser utilizado com uma variedade de fixadores. No entanto, isso conduz a uma perda de muitas das amostras e a compressão necessária distorce mecanicamente a amostra. Prática é necessária para maximizar a recuperação de amostras com boa morfologia. Congela-craqueamento pode ser optimizado para as condições específicas de fixação, a recuperação de amostras, ou a coloração não específica baixos, mas não para todos os parâmetros de uma vez. Para anticorpos que requerem condições de fixação muito rígidos e tolerar os tratamentos químicos necessários para permeabilizar quimicamente a cutícula, tratamentt de nemátodos intactas em solução pode ser preferida. Se o anticorpo requer uma posição mais clara ou se as condições de fixação ideais são desconhecidas, congelar-cracking fornece uma maneira muito útil para analisar rapidamente o anticorpo e pode render informações específicas localização subcelular e celular para o antígeno de interesse.

Quando worms são devidamente compactado, rachado, e levemente fixo, praticamente todo o worm pode ser acessível a coloração de anticorpos (ver Figura 2). A localização dos núcleos, tal como indicado por coloração com DAPI indica quais as partes do sem-fim está intacto Quando os vermes são submetidos a um fixador mais difícil, tal como o formaldeído, a morfologia do verme pode ficar distorcida (como pode ser visto pela aparência não natural ondulada do músculos nas Figuras 3A-D). Um outr...

&quot;Freeze-cracking&quot;, um método para expor os tecidos internos do nemátodo C. elegans para anticorpos para localização de proteínas, é demonstrada.

Anticorpo de coloração em<em&gt; C. Elegans</em&gt; Usando o &quot;Freeze-Cracking&quot;

To stain C.  elegans with antibodies, the relatively impermeable cuticle must be  bypassed by chemical or mechanical methods.  "Freeze-cracking" is one ...

O objetivo geral deste procedimento é realizar a coloração com anticorpos em C. elegans. Para isso, os nematodos são enxaguados, espalhados sobre lâminas e cuidadosamente comprimidos entre duas lâminas adesivas, que são então congeladas em gelo seco. Em seguida, as lâminas são separadas para romper os nematodos e imediatamente colocadas no fixador.Os nematodos são então corados utilizando técnicas padrão de coloração com anticorpos; a análise por microscopia fluorescente revela coloração bem-sucedida com anticorpos em nematodos semi-intactos. A principal vantagem desta técnica em relação a métodos existentes, como a fixação de nematodos intactos, é que ela minimiza o tratamento químico da amostra. Geralmente, indivíduos novos nesta técnica enfrentam dificuldades porque o preparo das lâminas e dos nematodos é um pouco complicado de demonstrar.O procedimento será conduzido por mim e por RTO Basu, um estudante de pós-graduação do meu laboratório. Para preparar placas de nematodos para coloração, comece colocando um pedaço plano de metal sobre gelo seco para resfriá-lo; use água destilada e uma pipeta de vidro para enxaguar. Transfira os vermes cultivados em uma placa NGM de 60 milímetros com bactérias para um tubo microfuga de 1,5 mililitro. Os vermes podem estar sincronizados ou em idades mistas, mas evite usar placas com muitos fungos, que são difíceis de remover, ou vermes em jejum, que aumentarão a autofluorescência, utilizando a mesma pipeta de vidro.Lave os vermes três a quatro vezes com água destilada para removê-los de bactérias. Em seguida, para coletar principalmente adultos, deixe-os repousar na bancada por três a cinco minutos. Após os vermes se sedimentarem no fundo do tubo, remova a maior parte da água do tubo, deixando um volume de água cerca de duas vezes maior que o volume dos vermes, mas com volume total de pelo menos 25 microlitros.Rotule o lado fosco das lâminas de politreolina com tinta indelével e coloque as lâminas sobre a bancada ao lado de um recipiente com gelo seco, com o lado rotulado voltado para cima. Esta servirá como lâmina inferior. Tenha um número igual de lâminas limpas não tratadas com politreolina.Disponíveis lâminas superiores. Em seguida, pipete cerca de 25 microlitros de vermes em água sobre a lâmina inferior aderente e, usando a lateral da ponteira da pipeta, espalhe os vermes pelo centro da lâmina. Deixe-os assentar por 30 segundos a dois minutos.As extremidades das minhocas aderirão ao entrar em contato com a lâmina. O aspecto mais difícil deste procedimento é manter as minhocas de se deformarem excessivamente durante as próximas etapas. A melhor maneira de fazer isso é sendo paciente, tendo tudo preparado previamente e evitando consumir muita cafeína para que suas mãos fiquem firmes e estáveis.Segurando a lâmina inferior com uma das mãos, coloque a lâmina superior sobre ela de modo que apenas as partes foscas não se sobreponham. O líquido deve manter as lâminas ligeiramente separadas, permitindo que os vermes ainda tenham alguma mobilidade. Evite que a lâmina deslize sobre a outra, o que poderia torcer os vermes.Em seguida, usando os polegares e os indicadores de cada mão, pressione cuidadosamente para baixo sobre a lâmina superior. Com a pressão adequada, alguns dos hermafroditas maiores se romperão na borda da lâmina. Enquanto a maioria dos adultos e larvas entrar em contato com a lâmina, permanecerão intactos; nesse momento, coloque-as imediatamente e com cuidado sobre a peça de metal em gelo seco. Dentro de um minuto, as lâminas parecerão congeladas, mas mantenha-as nesse estado por cinco minutos para garantir que congelem completamente.As lâminas estão agora prontas para fixação. Se não for prosseguir imediatamente, armazene as lâminas em uma caixa etiquetada a menos 80 graus Celsius por vários dias. Elas devem ser utilizadas dentro de cerca de uma semana após sua preparação.Não utilize as lâminas após armazenamento de longo prazo. Nematoides individuais também podem ser preparados em lâminas por um método semelhante ao recém-apresentado. Coloque um pedaço plano de metal sobre gelo seco para resfriá-lo.Em seguida, utilize um bastão de dissecação para transferir nematoides individuais para uma gota de água em uma placa NGM para livrá-los das bactérias. Os nematoides devem estar bem alimentados para reduzir a autofluorescência. Sempre que possível, repita a transferência para novos pontos com água conforme necessário, até que o verme esteja livre de bactérias.Em seguida, prepare as lâminas superior e inferior como antes. Então, coloque uma gota de cinco a 10 microlitros de água na área tratada com polilisina da lâmina inferior, observando ao microscópio. Use uma alça de transferência para transferir até 20 vermes para a gota de água.Os vermes devem afundar até tocar a superfície adesiva da lâmina. Em seguida, coloque a lâmina superior como antes, mas não comprima, garantindo que as lâminas não escorreguem imediatamente. Coloque as lâminas sobre o metal na gelo seco.Mantenha em gelo seco por cinco a 30 minutos e prossiga imediatamente para a fixação. Esses lâminas não podem ser armazenados para uso posterior. Para fixar levemente os vermes, comece colocando frascos de coloração contendo soluções de fixação sobre gelo para resfriá-los por 10 minutos.As soluções necessárias são metanol 100%, acetona 100% e solução salina tamponada com fosfato. Pegue um par de lâminas inferior e superior do gelo seco, gire-as rapidamente para separá-las e imerja imediatamente a lâmina inferior em metanol gelado por dois minutos, descartando então a lâmina superior. Em seguida, transfira as lâminas do metanol para acetona gelada por quatro minutos.Se as lâminas tiveram muitos vermes, a maioria deles cairá no fixador mesmo com lâminas bem preparadas. Se as lâminas com um único verme foram devidamente preparadas, os vermes devem permanecer aderidos. Por fim, para remover o fixador, mergulhe as lâminas no frasco com PBS.As lâminas estão agora prontas para coloração para realizar uma fixação rígida usando formaldeído ou glutaraldeído. Comece diluindo solução de formaldeído ou glutaraldeído grau reagente em PBS até uma concentração final de 0,5 a 4%. Aliquotas podem ser armazenadas a menos 20 a menos 30 graus e descongeladas conforme necessário. Lembre-se, o formaldeído e o glutaraldeído são muito tóxicos, portanto você precisa estar usando luvas e trabalhando em uma cabine de segurança química.Retire um par de lâminas inferiores e superiores do gelo seco e separe-as rapidamente com um movimento de torção. Coloque a lâmina inferior, que contém os vermes, em um recipiente raso com tampa e descarte imediatamente a lâmina superior. Pipete 200 microlitros do fixador sobre o centro da região da lâmina com os vermes. O fixador irá parcialmente congelar no local e, em seguida, derreter, cobrindo uma área maior da lâmina.Se os vermes não forem imediatamente e cuidadosamente cobertos por completo com o fixador, adicione mais fixador utilizando uma micropipeta. Não permita que o fixador transborde para fora da borda da lâmina. Adicione lenços umedecidos sem fiapos dobrados ao recipiente para mantê-lo umidificado.Não permita que os lenços toquem as lâminas. Em seguida, cubra o recipiente com uma tampa e deixe de 10 minutos a durante a noite à temperatura ambiente após a fixação estar completa; use uma pipeta para transferir cuidadosamente o fixador com os vermes soltos para um tubo de 1,5 mililitro. Em seguida, mergulhe a lâmina em um frasco de coloração contendo PBS.Centrifugue o tubo contendo os vermes em alta velocidade por 30 segundos para formar o pellet. Lave os vermes duas vezes com PBS. Em seguida, prossiga para corá-los em paralelo com os vermes no lâmina. O protocolo de coloração com anticorpo é semelhante aos protocolos padrão para qualquer tecido em lâminas e está descrito em detalhes no documento anexo. Após a coloração, transfira as lâminas para PBS e deixe-as permanecer ali por até 12 horas a quatro graus Celsius até que estejam prontas para serem montadas. Para montar as lâminas, remova uma lâmina do PBS.Use um lenço livre de fiapos para secar o lado posterior e, em seguida, coloque-o brevemente sobre uma toalha de papel rapidamente. Coloque cerca de 20 microlitros de meio de montagem sobre os vermes, de modo que haja partes aproximadamente iguais de meio e PBS sobre a lâmina.Incline suavemente a lâmina para misturar as duas soluções. Cuidado: o meio de montagem é tóxico. Segure pela borda fosca.Incline o lâmina para que a solução se acumule próximo ao esfriamento. Em seguida, coloque uma borda de uma lamínula de 24 por 60 milímetros sobre a solução para minimizar bolhas de ar, que aumentam o clareamento e prejudicam a visualização. Abaixe a lamínula suavemente.Se bolhas se formarem, levante lentamente a borda da lamínula. Em seguida, sem deslizar sobre os vermes, abaixe-a novamente. Adicione mais PBS, se necessário, para eliminar as bolhas de ar.Usando uma toalha livre de fiapos, comprima cuidadosamente as bordas da lamínula e da lâmina para secar a borda. A borda da lâmina deve estar visível ao redor de toda a borda da lamínula e não deve estar excessivamente úmida. Selle a lamínula e aplique duas a três camadas de esmalte nas bordas.Uma vez que a lâmina esteja bem selada e seca, limpe a lamínula e o verso da lâmina e coloque-a nos compartimentos do porta-lâminas. Lâminas seladas podem ser armazenadas por dias a quatro graus Celsius ou por semanas a menos 20 graus Celsius por períodos mais longos. A coloração DAPI do DNA e a maioria das colorações verdes desvanecem; resele a lamínula com mais esmalte conforme necessário, especialmente após o uso de qualquer objetiva de imersão a óleo.As seguintes imagens representativas foram obtidas a partir de lâminas preparadas durante as primeiras tentativas de coloração com anticorpos por alunos de graduação em um curso de laboratório de biologia celular. Esta imagem mostra um exemplo das cabeças de dois hermafroditas adultos adequadamente comprimidas, fissuradas e levemente fixadas com acetona de metanol. Foram marcadas com múltiplos anticorpos e corantes.Neste caso, praticamente todo o verme está acessível aos anticorpos. Na coloração, a localização dos núcleos indicada pela coloração com DPI indica quais partes do verme estão intactas. Quando os vermes são submetidos a um fixador mais forte, como o formaldeído, a morfologia do verme pode ficar distorcida.Isso pode ser observado nessas imagens como uma aparência ondulada dos músculos mostrados em vermelho. Outro problema comum associado ao uso de fixadores mais duros é a fixação ou penetração desigual de certos tecidos. Isso pode ser visto aqui, onde o músculo mostrado em vermelho está corado apenas em uma parte do verme.Aqui, a presença de outras colorações, incluindo o DNA, mostrado em azul, indica que pelo menos uma parte do corpo estava presente. O padrão resultante de coloração parcial pode ser facilmente identificado com prática, de modo que toda a distribuição da coloração possa ser determinada, mesmo quando qualquer verme individual apresenta coloração irregular. Problemas comuns encontrados com a técnica de fratura por congelamento, utilizando qualquer condição de fixação, são ilustrados aqui.O problema mais comum é a torção da amostra devido ao movimento relativo entre as duas lâminas. Durante a compressão, a morfologia dos tecidos corados indica que o corpo do verme está torcido logo posterior à faringe. Esta imagem também mostra o problema com a coloração de fundo devido à ligação do anticorpo ao revestimento de polilisina na lâmina.Isso pode ser evitado utilizando o microscópio confocal. Observe que, mesmo com prática, muitos vermes individuais podem ser perdidos ou apresentar alguns dos problemas mostrados aqui. Uma vez dominado, o preparo e a fixação podem ser realizados em uma hora e a coloração pode ser feita em um dia.Após este procedimento, uma variedade de métodos de fixação pode ser realizada para otimizar a coloração para qualquer anticorpo e tecido específicos.

antibody-staining-in-c-elegans-using-freeze-cracking

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

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Anticorpo de coloração em

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