Name: Produção de grande número de controladas pelo tamanho Spheroids tumorais usando placas de micropoços (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-11-18T20:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 44 s
Description: Aprenda a produzir esferoides tumorais uniformes e controlados em grande escala usando placas de micropoços. Este método permite gerar milhares de agregados simultaneamente para estudos em oncologia e biologia celular.

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Este trabalho foi financiado pela Universidade de Calgary, no âmbito de um novo investigador arranque concessão ao Dr. Ungrin.

NOTA: placas de micropoços estão disponíveis em diferentes formatos, dependendo dos resultados desejados. Especificações assim como linhas aproximados para os números mínimos e máximos de células que devem ser utilizados com cada formato são mostrados na Tabela 1. Os micropoços menores diminuir para uma ponta afiada, e, portanto, não há limite de tamanho menor, embora a variabilidade entre esferóides se torna mais significativo em tamanhos menores. Produção de rotina de esferóides de uma média de menos de 20 células de cada um é simples 8. Quanto maior o tamanho de micropoços não é totalmente cónica, por conseguinte, as tentativas para formar esferóides de pequenos números de células pode resultar em múltiplos esferóides menores em cada micropoço. Devido a pequenas diferenças nas propriedades da superfície, a preparação com a solução de surfactante (passo 1.2) não é opcional quando se utiliza placas AggreWell 400EX. Este protocolo baseia-se na utilização de AggreWell 400 placas - por outros formatos contrasult Tabela 1. O número de células a serem carregados em cada poço é determinada multiplicando o número de micropoços que contém pelo número de células para ser agrupados para cada esferóide. Por exemplo, para gerar esferóides de 1000 células cada, cada poço tem de ser carregada com 1200 (esferóides vezes cada 1.000 células) = 1,2 x 10 6 células. A densidade celular deve ser calculada tendo em conta que as células serão carregados em um volume de 0,4 ml. Assim, para o exemplo de esferóides formados a partir de 1000 células cada um, 1,2 x 10 6 células em 0,4 ml traduz para uma densidade de 3 x 10 6 culas por ml. 1. Preparar micropoços para recebimento Células <ol><li> Microplacas são estéreis, como previsto, e só deve ser retirado da sua embalagem em um ambiente estéril, como uma cabine de segurança biológica de fluxo laminar. A esterilidade deve ser mantida durante todo o protocolo. Caso a esterilidade ser comprometida, os poços são novamente esterilizado usando etanol a 70% em água, utilizando oseguindo os passos opcionais. <ol><li> Adicionar 0,5 ml de etanol a 70% a cada poço não utilizado. Alguns micropoços bolhas de ar armadilha, embora este possa ser reduzido pela adição de líquido de um lado, e permitindo que ele se espalhe ao longo da superfície, em vez de deixá-la cair verticalmente sobre a superfície. Substituir tampa. </li><li> Embora o vapor de etanol deve permear rapidamente quaisquer bolhas, se houver um grande número pode ser desejável removê-los. Centrifugar durante 2 minutos a 2.000 x g. Note-se que é importante assegurar que o rotor está adequadamente em relação a esta velocidade. </li><li> Usando uma baixa ampliação microscópio invertido, verificar bolhas foram removidos das cavidades. </li><li> Incubar durante 5 minutos com a tampa colocada à temperatura ambiente. </li><li> Aspirar etanol. Placa pode agora ser lavada com água ou PBS estéril para utilização imediata, ou ar seco para o armazenamento. </li></ol></li><li> A fim de assegurar que as células não interagem com a superfície do micropoço, que pode ser preparado usando um surfactante. Em geral, éaconselhável realizar esta etapa, inicialmente, e posteriormente comparar esferóides gerados com e sem micropoços revestida de surfactante. <ol><li> Adicionar 0,5 ml de solução de enxaguamento para cada poço. Alguns micropoços bolhas de ar armadilha, embora este possa ser reduzido pela adição de líquido de um lado, e permitindo que ele se espalhe ao longo da superfície, em vez de deixá-la cair verticalmente sobre a superfície. Substituir tampa. </li><li> Centrifugar durante 2 minutos a 2000 xg para remover bolhas. Note-se que é importante assegurar que o rotor está adequadamente em relação a esta velocidade. </li><li> Usando uma baixa ampliação microscópio invertido, verificar bolhas foram removidos das cavidades. </li><li> Incubar durante pelo menos trinta minutos, com a tampa sobre a temperatura ambiente, ou durante a noite a 4 ° C. As placas podem ser armazenadas em quatro graus, com a solução de agente tensioactivo nos poços até ser necessário, se devidamente selados para evitar a secagem. </li><li> Lavar a placa com água estéril ou com PBS imediatamente antes de usar. Não permita que as placaspara secar após o revestimento. </li></ol></li></ol> 2. Preparando Células NOTA: Os detalhes da preparação de células irá variar um pouco com o tipo específico de célula a ser estudada. No entanto, temos observado essas condições para ser eficaz com uma ampla variedade de células, incluindo as linhas discutidos aqui, assim como as células-tronco embrionárias humanas e de ratinho (ESC), células-tronco pluripotentes induzidas pelo homem (IPSC), fibroblastos, endoderme primitiva putativo, e células estromais. Outros grupos têm utilizado este sistema com sucesso para uma ampla gama de aplicações, incluindo condrogênese a partir de células-tronco mesenquimais 9, a geração de precursores neurais padronizado a partir de células-tronco pluripotentes 10, as análises toxicológicas em hepatócitos 11 e avaliação da regeneração da medula espinhal em salamandras 12. O protocolo específico para trabalhar com células HT29 é mostrado aqui. <ol><li> Comece com um frasco T75 de células HT29, cultivadas em DMEM+ 10% de FBS </li><li> Aspirar o meio de crescimento do balão, e adicionar 3 ml de tripsina. </li><li> Incubar as células durante 5 min a 37 ° C. </li><li> Parar a digestão de tripsina por adição de 3 ml de meio de crescimento. Tomar uma aliquota para contagem de células e transferir o restante para um tubo de centrífuga de 15 ml. </li><li> Centrifugar durante 5 minutos a 200 x g. </li><li> Enquanto a centrifugação está em andamento, a contagem das células. </li><li> Aspirar tripsina / mistura de meio e substituir com meio de crescimento fresco, o volume determinado pela densidade celular necessária como calculado acima. </li><li> (OPCIONAL) Passe a suspensão de células através de um filtro para remover quaisquer aglomerados. NOTA: as condições de colheita de células irá variar um pouco entre linhas. Se um protocolo de dissociação por exemplo passagem das células de interesse está disponível, que deve ser usada como um ponto de partida. Com linhas de células sensíveis a utilização de tripsina pode resultar em morte celular excessiva. Nestes casos temos observado bons resultados usando TrypLE como uma alternativa dissociatiem 8 de reagente. Se as células tornam-se agregada durante dissociação e perder a viabilidade, a adição de DNAse para a solução de enzima pode resolver este problema. A redução dos tempos de dissociação e empregando uma etapa de trituração para quebrar aglomerados de células também pode aumentar a viabilidade. </li></ol> 3. Formação esferóide NOTA: esferóides podem ser gerados numa grande variedade de formulações de meios, no entanto, os ensaios iniciais deve ser efectuada utilizando o meio em que as células foram cultivadas, para distinguir as consequências da transição para um sistema de cultura de 3-dimensional a partir de consequências de alterar a composição do meio. <ol><li> Adicionar 0,4 ml de meio de crescimento em cada poço. </li><li> Centrifugar durante 2 minutos a 2000 xg para remover bolhas. Note-se que é importante assegurar que o rotor está adequadamente em relação a esta velocidade antes da centrifugação. </li><li> Usando uma baixa ampliação microscópio invertido, verificar bolhas foram removidos das cavidades. </li><li> Adicionar 0,4 mlsuspensão de células, a uma densidade requerida (calculado acima). Misture suavemente pipetando cima e para baixo, sem a introdução de bolhas de ar nas cavidades. É importante assegurar que as células são distribuídos uniformemente ao longo do poço, a fim de obter esferóides consistentes. </li><li> Centrifugar durante 5 minutos a 200 x g. Se a placa não auto-nível, durante a centrifugação, as correntes de convecção que podem surgir em resultado de distribuição desigual de células entre os micropoços. Portanto, a chapa deve ser equilibrado internamente, bem como contra a outra placa, de modo que o peso é distribuído de forma uniforme para ambos os lados da placa transportadora. </li></ol> NOTA: Se a evidência da distribuição desigual de células é visto, pode ser necessário aplicar uma pequena quantidade de lubrificação para os pontos de articulação no suporte da placa - consulte o fabricante centrífuga para obter instruções. NOTA: Uma vez que as células foram centrifugadas em micropoços, eles são razoavelmente resistante para lavagem de movimentos da placa de menores. Movimentos bruscos que resultem em chapinha do meio devem ser evitados, mas a transferência da placa de centrífuga para microscópio ou incubadora não deve resultar em deslocamento celular significativa. <ol start="6"><li> Utilizando um microscópio invertido, verificar que as células foram agrupadas dentro dos micropoços, e que estão distribuídos uniformemente ao longo do poço. </li><li> Incubar durante a noite a 37 ° C. </li><li> Utilizando um microscópio invertido, observar o processo de formação de esferóides. Algumas linhas de células irão formar esferóides compactos dentro de 24 horas, outros podem demorar mais tempo. A progressão do aglomerado para agregar em células HT29 é mostrado na Figura 2. </li><li> Recuperar esferóides de micropoços e transferir para cultura de suspensão por gentilmente jorrando-los com uma pipeta. Como alternativa, manter esferóides in situ com a substituição média 8 - a duração depende do seu tamanho inicial e taxa de crescimento, que define o tempo até que eles superam os micropoços em que foram formados. <ol><li> Para substituir o meio, sem a perda de esferóides, meio aspirado na extremidade do poço com uma pipeta de Pasteur. Lentamente traga a ponta para baixo até que comece a desenhar o líquido do menisco, e siga o menisco para baixo como ele cai. Em seguida, adicionar meio fresco, contra a parede do poço, no mesmo local. Algumas esferóides podem ser perdido, no entanto se o meio é aspirado e substituído sempre na mesma posição, este permanecerá número pequeno em comparação com o grande número de poço. </li></ol></li></ol>

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</ol>

Dr. Ungrin tem um interesse financeiro na tecnologia AggreWell como um inventor.

Nós estabelecemos um sistema em que um grande número de esferóides uniformes podem ser gerados a partir de múltiplas linhagens de células de diferentes fontes. Temos ainda encontrar uma linha de células aderentes que não formam esferóides sob estas condições. Nós já observamos perda de células em populações sujeitas a anoikis 5,8, no entanto até o momento esta questão não surgiu com linhagens tumorais. O sistema é escalonável arbitrariamente com a área de superfície, com o comportamento consistente em micropoços de 24 poços e formato de 6 poços, bem como bioreactores protótipo contendo 50.000 micropoços cada actualmente em desenvolvimento. Deve esferóides assimetria ser uma preocupação, o tempo de incubação no passo 4.8 pode ser aumentada para dois ou três dias. Esferóides também pode ser incubada por um período de, após extracção a partir dos micropoços, para aumentar a simetria, no entanto, neste caso, deve ser tomado cuidado para manter as densidades de cultura suficientemente baixo, como esferóides em contacto um com o outro will muitas vezes se fundem em estruturas maiores. Por este motivo, já anteriormente mantidas culturas dentro dos micropoços em que foram formados os agregados, com a principal limitação é o tamanho do esferóide. Este por sua vez é uma função tanto da taxa de crescimento e o tamanho inicial 8, e se a cultura alargada dentro da microplaca está prevista, esta deve ser considerada com antecedência. Opções para evitar crescimento excessivo, se ocorrer, incluir ou começando com esferóides menores, ou empregando os micropoços maiores da placa AggreWell 800. Deve esferóides não conseguem aumentar a coerência ao longo do tempo, uma causa potencial pode ser a morte da célula. Particularmente em grandes agregados de células altamente metabolicamente ativas, as limitações de transporte de massa sobre o fornecimento de oxigênio e nutrientes essenciais pode resultar em um núcleo necrótico 2 - portanto, um esferóide não coeso pode ser simplesmente uma conseqüência da morte excessiva de células. Alternativamente, medições da coesão mecânicação de esferóides foram usadas para avaliar a forças de ligação intercelular, em relação com o potencial metastático de uma dada linha de células 13. Seria interessante investigar a relação entre a forma esferóide e potencial metastático, talvez usando parâmetros morfométricos como arredondamento e perímetro para razão de área. Além de investigar as propriedades mecânicas e morfométricas de esferóides, a montagem do sistema de micropoços permite a produção em larga escala de esferóides mista de composição, que consiste em combinações de vários tipos e / ou de biomateriais 6,7 celulares. As interacções de células tumorais com outros tipos de células é importante para modelar mais de perto o comportamento de tumores in vivo 14, por isso, pode ser de interesse para gerar esferóides de células tumorais em combinação com os fibroblastos e células endoteliais, por exemplo. As micropartículas de vários biomateriais também pode ser incorporado, e pode afectar a esfPropriedades eroid tanto directamente, através das suas interacções com células 7,15, e também como reservatórios para a libertação controlada de factores de crescimento e citocinas para o interior do esferóide 16. Se houver qualquer preocupação com a esterilidade, por exemplo quando se trabalha com uma microplaca em que alguns poços já foram usados, que podem ter passado algum tempo em uma incubadora, como parte de um experimento anterior, os poços podem ser reesterilizado com etanol 70% na água. Uma vez que os esferóides foram formadas, elas podem também ser separadas das células não incorporados residuais por passagem da suspensão ao longo de um filtro de células. As células individuais vai passar, enquanto os esferóides será retida. Se o esferóide é suspeito de derramamento de células potencialmente metastático ao longo do curso da cultura, pode ser desejável para realizar este procedimento várias vezes - inicialmente para remover as células não incorporados, e subsequentemente para isolar purified populações das células fora dado por esferóides.

Existe um crescente corpo de evidências de que as células tumorais se comportam de forma diferente em três culturas tridimensionais do que quando cultivadas em plástico, e que os agentes terapêuticos identificados em plataformas de cultura de tecidos convencionais podem perder eficácia quando a transição para um sistema mais fisiologicamente relevantes 1. É desejável, portanto, para estudar o comportamento de células cancerosas sob estas condições, ambos os a perceber melhor a sua biologia subjacente, e também para aumentar a taxa de sucesso de transição de novos agentes terapêuticos a partir da instalação de rastreio para a clínica. Um sistema de modelo de utilidade, com uma longa história emprega aglomerados tridimensionais das células cancerosas conhecidas como esferóides tumorais 1,2. Idealmente, as técnicas para formação de esferóide iria permitir a produção de grandes números de esferóides uniformes, cuja dimensão e composição são controladas pelo experimentador. Enquanto pendurado soltar e bem-plate aproxima 3,4 são capazes de cumprir algumas dessas resitos, o rendimento é geralmente limitado, e geração de um grande número de esferóides se torna uma tarefa trabalhosa. Recentemente, desenvolveu um sistema para resolver desafios semelhantes no campo da medicina regenerativa 5. Empregando agregação forçada dentro de uma série de poços em escala mícron densamente compactados (ver Figura 1), esta abordagem permite a produção de esferóides de números arbitrários de células, incluindo misturas de vários tipos de células 6, bem como a incorporação de vários biomateriais 7. Esferóides são formados em grande número - milhares de centenas de milhares ou mais - e pode ser extraído imediatamente ou mantidas nos micropoços em que foram formados com troca de meio por pelo menos um 8 a dois (observação não publicada) semanas. Este sistema é, portanto, bem adequado para a geração de um grande número de uniforme e esferóides tumorais reprodutíveis para a avaliação da effectiveness de novos agentes antitumorais ou investigações biológicas básicas.

<table><tbody><tr><td>Placa AggreWell 400</td><td>StemCell Technologies Inc.</td><td>27845/27945</td><td></td></tr><tr><td>Solução de enxágue</td><td>StemCell Technologies Inc.</td><td>07010</td><td></td></tr><tr><td>Filtro de célula (37 <span id="docs-internal-guid-263ae0a0-aa3d-bddd-2a36-2ae1901f1604" style="font-size:15px; família de fontes:Arial; cor:#000000; cor de fundo:#ffffff; peso da fonte: normal; estilo da fonte:normal; variante de fonte: normal; decoração de texto:nenhuma; alinhamento vertical:linha de base; ">&micro; m)</td><td>StemCell Technologies Inc.</td><td>27215</td><td></td></tr><tr><td>PBS</td><td>VWR / LONZA</td><td>CA12001-676</td><td></td></tr><tr><td>Tripsina-versina (EDTA)</td><td>VWR / LONZA</td><td>CA12001-660</td><td></td></tr><tr><td>DMEM</td><td>VWR / LONZA</td><td>CA12002-212</td><td></td></tr><tr><td>FBS</td><td>VWR / LONZA</td><td>CA-95042-112</td><td></td></tr><tr><td>TrypLE</td><td>Invitrogen / Life Technologies</td><td>12605010</td><td></td></tr><tr><td>Microscópio invertido</td><td>VWR / Motic</td><td>CA19000-610</td><td></td></tr><tr><td>Centrífuga Allegra X15R com transportadores para placas de poços padrão</td><td>VWR / Beckman</td><td>CABKA99465, CABK369704, CABK392806</td><td></td></tr><tr><td>Cabine de biossegurança de fluxo laminar</td><td>ESBE / Baker</td><td>BKR-SG603AHEUVSP</td><td></td></tr></tbody></table>

produção de grande número de controladas pelo tamanho spheroids tumorais usando placas de micropoços

Production of Large Numbers of Size-controlled Tumor Spheroids Using Microwell Plates

Esferóides de tumor são cada vez mais reconhecido como uma importante modelo in vitro para o comportamento de células de tumor em três dimensões. Mais fisiologicamente relevante do que as culturas convencionais aderente folhas, eles recapitular com mais precisão a complexidade e as interações presentes em tumores reais. A fim de utilizar este modelo para avaliar melhor a biologia do tumor, ou a eficácia de novos agentes terapêuticos, é necessário ser capaz de gerar esferóides de forma reprodutível, de uma maneira controlada e em números significativos. O sistema AggreWell consiste de uma matriz de alta densidade de micropoços em forma de pirâmide, em que uma suspensão de células isoladas é centrifugado. Os números de células de agrupamento, na parte inferior de cada micropoço, e o número e proporção de diferentes tipos de células envolvidas dependem apenas das propriedades da suspensão introduzida pelo experimentador. Assim, somos capazes de gerar esferóides tumor de tamanho e composição arbitrária coma necessidade de modificar a tecnologia de plataforma subjacente. As centenas de micropoços por centímetro quadrado de superfície da cultura, por sua vez garantir que os níveis de produção extremamente elevados podem ser alcançados através de um processo intensivo de nonlabor simples. Esperamos, portanto, que este protocolo será de grande utilidade para pesquisadores da área esferóide tumor.

Esferóides de várias linhas tumorais de origens anatómicas diferentes pode facilmente ser gerada e extraiu-se em cultura em suspensão. Figura 3 ilustra o controlo de tamanho consistente obtidas através deste método, com populações de esferóides altamente uniformes sob cada condição. Limpar as diferenças inter-linha de comportamento também são visíveis, com células de câncer de cólon HT29 e células cancerosas do esôfago TE6 formando esferóides densamente com fronteiras bem definidas, enquanto as células de câncer de próstata LNCaP deu origem a esferóides menos coerentes com limites irregulares (ver discussão para possíveis razões ). As forças internas mais fortes nos agregados mais coerentes também resultou em colapso para uma forma mais simétrica, mesmo enquanto ainda nos micropoços em que foram formados, enquanto que os agregados LNCaP, particularmente no tamanho maior, visivelmente reter a geometria quadrado-piramidal do micropoços. A relação entre o número de células de entrada e os phys<html> ical tamanho do esferóide resultante irá depender de um número de variáveis. Volumes teóricos baseados no produto do volume de cada célula e o número de células utilizadas pode ser reduzida pela perda de células, o que por sua vez podem incluir perda de células durante a fase de suspensão de células individuais, bem como a perda de demasiado pequenos agregados devido Números insuficientes de vizinhos e de excessivamente grandes agregados devido a limitações de transporte e necrose no núcleo. Tamanho também será influenciada por qualquer proliferação que pode ocorrer durante o processo de agregação. À medida que estes parâmetros irão variar de linha celular para linha celular, se esferóides de dimensões físicas específicas são desejados do número correcto de células para introduzir deve ser determinada experimentalmente. Como uma primeira aproximação, diâmetro esferóide deverá aumentar com a raiz cúbica do número de células incorporadas - por exemplo, um aumento de 8-vezes no número de células deverá resultar na duplicação de diâmetro esferóide. <html> _content &quot;fo: manter-together.within-page =&quot; always &quot;&gt; <img alt="Figura 1" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/50665/50665fig1highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50665/50665fig1.jpg" /> Figura 1. Esquema de produção esferóide. O sistema consiste de micropoços de uma matriz de quadrados micropoços-piramidal embaladas apertadamente (625 por cm 2 para a 400 <span id="docs-internal-guid-263ae0a0-aa35-f9c7-69a1-8c5aa197db53" style="font-size:15px;font-family:Arial;color:#000000;background-color:#ffffff;font-weight:normal;font-style:normal;font-variant:normal;text-decoration:none;vertical-align:baseline;">μ m de tamanho), em que as células podem ser centrifugadas. As células são reunidas pelas paredes laterais inclinadas, e do tamanho do esferóide resultante é controlada pela variação da densidade da suspensão celular empregue. 50665fig2highres.jpg &quot;src =&quot; / files/ftp_upload/50665/50665fig2.jpg &quot;/&gt; Figura 2. Assembléia de células agrupadas em esferóides. Spheroids foram formados a partir de setecentos HT29 células cada. Imediatamente após a centrifugação (A), as células são fracamente aglomeradas no fundo de cada micropoço. Note-se que os aglomerados estão uniformemente deslocamento para a direita inferior, neste caso. Isto é aceitável, desde tamanhos de cluster permanecem consistentes em toda a matriz. Se as diferenças de tamanho significativo conjunto são vistos de um lado da matriz para o outro, ver a Nota no passo 3.5. Após incubação durante 24 horas (B), as forças de adesão intercelular causaram os aglomerados para agregar e formar esferóides coerentes, que podem então ser extraídos (C). <img alt="Figura 3" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/50665/50665fig3highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50665/50665fig3.jpg" /><b<html> r /&gt; Figura 3. Esferóides gerados em placas de microcavidades. Esferóides foram formados a partir de setecentos (A, C, E) ou mil e quinhentos (B, D, F), as células de cancro do cólon HT29 (A, B), células de cancro da próstata LNCaP (C, D) ou TE6 células cancerosas do esôfago (E, F). Note-se a consistência de esferóides no interior de uma preparação, bem como a variação entre as linhas de células, em particular - os agregados LNCaP soltas em comparação com o HT29 mais densamente compactados e células TE6. A barra de escala representa 200 fim. <table border="1"><tbody><tr><td></td><td colspan="3"> Formato Microwell </td></tr><tr><td></td><td> AggreWell 400 </td><td> AggreWell 40EX </td><td> AggreWell 800 </td></tr><tr><td> Largura Microwell (al;color:#000000;background-color:#ffffff;font-weight:normal;font-style:normal;font-variant:normal;text-decoration:none;vertical-align:baseline;&quot;&gt;µm ) </td><td> 400 </td><td> 400 </td><td> 800 </td></tr><tr><td> Micropoços por cm2 </td><td> 625 </td><td> 625 </td><td> 156,25 </td></tr><tr><td> Micropoços por poço </td><td> 1200 </td><td> 4700 </td><td> 300 </td></tr><tr><td> Células mínimos por micropoços * </td><td> N / D </td><td> N / D </td><td> 2000 </td></tr><tr><td> Células máximas por micropoços * </td><td> 2000 </td><td> 2000 </td><td> 10.000 </td></tr><tr><td> Células mínimos por bem * </td><td> N / D </td><td> N / D </td><td> 6 x 10 5 </td></tr><tr><td> Células máximas por bem * </td><td> 2,4 x 10 6 </td><td> 9,4 x 10 6 </td><td> 3 x 10 6 </td></tr><tr><td> 1.1.1 - 70% do volume de etanol (ml) </td><td> 0,5 </td><td> 2.0 </td><td> 0.5 </td></tr><tr><td> 1.2.1 - Lavar volume de solução (ml) </td><td> 0,5 </td><td> 2.0 </td><td> 0,5 </td></tr><tr><td> 3.2 - O volume de pré-carga Médio (ml) </td><td> 0,4 </td><td> 1.6 </td><td> 0,4 </td></tr><tr><td> 3.5 - O volume de carga celular (ml) </td><td> 0,4 </td><td> 1.6 </td><td> 0,4 </td></tr><tr><td colspan="4"> * Os números de células por micropoço são somente uma aproximação, como este valor pode variar com o tamanho das células específicas empregues, e devem ser determinadas empiricamente </td></tr></tbody></table> Tabela 1. AggreWell opções e modificações do protocolo.

Nós introduzimos um protocolo para a geração de um grande número (milhares a centenas de milhares) de tamanho-e esferóides uniformes tumor controlado por composição, usando placas de micropoços disponíveis no mercado.

Produção de grande número de controladas pelo tamanho Spheroids tumorais usando placas de micropoços

Tumor spheroids are increasingly recognized as an important in vitro model for the behavior of tumor cells in three dimensions. More physiologically ...

O objetivo geral do experimento a seguir é gerar grandes quantidades de esferoides tumorais com tamanho uniforme e controlado. Isso é alcançado primeiramente pela preparação das placas de microplacas para agrupar as células a serem formadas em esferoides. Como segundo passo, realiza-se a colheita de um cultivo do tipo celular desejado, o que fornece a suspensão celular que determina o tamanho e a composição dos OID.A suspensão celular é então centrifugada nos micropoços e incubada para permitir a formação do esteroide após a incubação. Os esteroides resultantes são altamente uniformes e podem ser coletados ou cultivados nos micropoços em que foram formados. A principal vantagem desta técnica em relação aos métodos existentes é que um número muito grande de agregados uniformes pode ser produzido simultaneamente.Indivíduos novos neste método podem achar que seu combustível varia muito em tamanho. É importante garantir que a suspensão celular seja distribuída uniformemente pela placa e que os suportes de placa oscilantes no Fuge central se movam livremente, de modo que a força seja perpendicular à superfície. Para começar, prepare uma placa agro bem 400 estéril adicionando 0,5 mililitros de solução de enxágue contendo surfactante a cada poço.O uso de surfactante garante que as células não interajam com a superfície do poço microscópico. Para evitar o aprisionamento de bolhas de ar nos poços microscópicos, adicione o líquido em um dos lados e permita que ele se espalhe pela superfície, em vez de depositá-lo verticalmente sobre a superfície. Após adicionar a solução aos poços, recoloque a tampa.Certifique-se de que o rotor está adequadamente balanceado antes de centrifugar as placas por dois minutos a 2000 vezes G. Para remover bolhas usando um microscópio invertido de baixa ampliação, verifique se as bolhas foram removidas dos micropoços. Incube a placa por pelo menos 30 minutos com a tampa colocada, à temperatura ambiente, ou durante a noite a quatro graus Celsius. Aspire a solução de lavagem dos poços e lave a placa com água estéril ou PBS imediatamente antes do uso.Não permita que as placas sequem após a codificação. Os detalhes da preparação das células variarão conforme o tipo celular específico em estudo. No entanto, observamos que esta condição é eficaz para uma ampla variedade de células, incluindo as linhagens aqui discutidas, bem como células-tronco embrionárias humanas e neurais, células-tronco pluripotentes induzidas humanas, fibroblastos, endone presumíveis, primitivas e células estromais. Para preparar as células, inicie com o frasco T 75 de células HT 29.Aspire o meio de crescimento do frasco e adicione três mililitros de tripsina. Incube as células por cinco minutos a 37 graus Celsius. Interrompa a digestão com tripsina adicionando três mililitros de meio de crescimento.Transfira o restante para um tubo de centrífuga de 15 mililitros. Em seguida, de um tubo de 15 mililitros, retire uma alíquota para contagem celular. Centrifugue as células por cinco minutos a 200 vezes G enquanto a centrifugação estiver em andamento.Conte as células. Em seguida, aspire a mistura do meio de tripano e substitua-a por meio de crescimento fresco, em um volume determinado pela densidade celular necessária previamente calculada, conforme descrito no protocolo do texto, como um passo opcional.Passe a suspensão celular através de um filtro para remover quaisquer agregados. Os esferoides podem ser gerados em diversas formulações de meio, entretanto os ensaios iniciais devem ser realizados utilizando o meio no qual as células foram cultivadas. Para distinguir os efeitos da transição para um sistema de cultura tridimensional dos efeitos da alteração da composição do meio, comece adicionando 0,4 mililitros de meio de crescimento a cada poço e centrifugue por dois minutos a 2000 ×g. Usando um microscópio invertido de baixa magnificação, verifique se as bolhas foram removidas dos micropoços.Em seguida, adicione 0,4 mililitros de suspensão celular na densidade requerida aos poços micro. Depois, misture suavemente pipetando para cima e para baixo sem introduzir bolhas de ar nos poços micro, garantindo que as células estejam uniformemente distribuídas por todo o poço. Para obter esteroides consistentes.Centrifugue a placa por cinco minutos a 200 vezes g. A placa deve ser balanceada internamente, bem como em relação à outra placa, de modo que o peso seja distribuído uniformemente para ambos os lados do suporte da placa. Isso garante que a placa se nivele sozinha durante a centrifugação, evitando que correntes de convecção surjam e resultem em distribuição desigual de células pelos micropoços.Utilizando um microscópio invertido, verifique se as células se agruparam dentro das micropoços e se estão uniformemente distribuídas pelo poço antes de incubar as células durante a noite a 37 graus Celsius. Observe o processo de formação de esferoides utilizando um microscópio invertido. Algumas linhagens celulares formarão esferoides compactos em até 24 horas.Outros podem levar mais tempo. A progressão de agregado a agregação em células HT29 é mostrada aqui. A parte mais difícil deste procedimento é remover os esteroides intestinais sem perturbar as estruturas. Para extrair esteroides de poços microscópicos, pipete suavemente para cima e para baixo para permitir que os esferoides saiam dos micro poços.Em seguida, incline a placa para aspirar a mistura de meio com esteroides. Use ponteiras de pipeta com orifício largo para esteroides de maior tamanho, a fim de evitar a degradação dos esteroides. Após recuperar os esteroides dos poços microscópicos, transfira-os para a cultura em suspensão, expulsando-os suavemente com uma pipeta.Alternativamente, a rosa severa pode ser mantida no ataque com uma substituição do meio. A duração depende do tamanho inicial e da taxa de crescimento, o que define o tempo até que ultrapassem os micropoços. Bem, eles foram formados para substituir o meio sem perder esteroides.Aspire o meio na borda do poço. Usando uma pipeta Pasteur, desça lentamente a ponta até que comece a aspirar o líquido do menisco e siga o menisco à medida que ele desce. Em seguida, adicione meio fresco contra a parede do poço no mesmo local.Ao adicionar o meio fresco, lembre-se de empurrar suavemente o pipetador e manter a ponteira encostada na parede para evitar a perturbação do PHE nos micropoços. Algum esteroide pode ser perdido. No entanto, se o meio for sempre aspirado e substituído na mesma posição, esse número permanecerá pequeno.Em comparação aos grandes números observados nos poços, esteroides provenientes de múltiplas linhagens tumorais de origens anatômicas diferentes podem ser facilmente extraídos em suspensão. O controle consistente do tamanho obtido por meio deste método é demonstrado aqui com populações altamente uniformes de esteroides. Em cada condição formada a partir de 700 ou 1.500 células.Diferenças claras entre linhagens também são visíveis com células de câncer de cólon HT29 e células de câncer esofágico TE seis, formando agregados densamente compactados com limites bem definidos. Por outro lado, células de câncer de próstata lin cap dão origem a agregados menos coerentes, com limites irregulares. As forças internas mais fortes nos agregados mais coerentes também resultaram no colapso para uma forma mais simétrica, mesmo enquanto ainda estavam nas micropoços onde foram formados.No entanto, os agregados de lin cap, particularmente nos tamanhos maiores, retêm visivelmente a geometria parametal quadrada das micropoços. Uma vez dominado, este processo pode ser realizado em cerca de uma hora, mais o período de incubação necessário para que as células adiram e produzam fluidos. Ao tentar este procedimento, é importante lembrar-se de garantir que não haja bolhas, evitando que viajem pelos micropoços antes da adição das células.

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