Produção de grande número de controladas pelo tamanho Spheroids tumorais usando placas de micropoços

O objetivo geral do experimento a seguir é gerar um grande número de esferoides tumorais controlados por tamanho uniforme. Isso é conseguido preparando primeiro as placas de micropoços para agrupar as células a serem formadas em esteróides. Como segunda etapa, é colhida uma cultura do tipo de célula desejado, que fornece a suspensão celular que determina o tamanho e a composição dos OIDs.

A suspensão celular é então centrifugada nos micro poços e incubada para permitir a formação de esteróides após a incubação. Os esteróides resultantes são altamente uniformes e podem ser coletados ou cultivados nos micropoços em que foram formados. A principal vantagem dessa técnica sobre os métodos existentes é que um número muito grande de agregados uniformes pode ser feito simultaneamente.

Indivíduos novos neste método podem achar que seu combustível é muito grande. É importante garantir que a suspensão da célula seja distribuída uniformemente pela placa e que os suportes da placa oscilante na fuge central se movam livremente para que a força seja perpendicular à superfície. Para começar, prepare uma placa estéril de poço agrícola 400 adicionando 0,5 mililitros de surfactante contendo solução de enxágue a cada poço.

O uso de surfactante garante que as células não interajam com a superfície do micropoço. Para evitar prender bolhas de ar nos micropoços, adicione líquido de um lado e deixe-o se espalhar pela superfície, em vez de deixá-lo cair verticalmente na superfície. Depois de adicionar a solução aos poços, recoloque a tampa.

Certifique-se de que o rotor esteja devidamente equilibrado antes de centrifugar as placas por dois minutos a 2000 vezes G.To remova as bolhas usando um microscópio invertido de baixa ampliação, verifique se as bolhas foram removidas dos micropoços. Incube a placa por pelo menos 30 minutos com a tampa colocada em temperatura ambiente ou durante a noite a quatro graus Celsius. Aspire a solução de enxágue dos poços e lave a placa com água estéril ou PBS imediatamente antes do uso.

Não permita que as placas sequem após a codificação. Os detalhes da preparação celular variam de acordo com o tipo específico de célula que está sendo estudado. No entanto, observamos que essa condição é eficaz para uma ampla gama de células, incluindo as linhas que discutimos aqui, bem como células-tronco embrionárias humanas e neurais, células-tronco pluripotentes induzidas por humanos, fibroblastos, endona primitiva putativa e células estromais Para preparar as células, comece com o frasco T 75 de células HT 29.

Aspire o meio de crescimento do frasco e adicione três mililitros de tripsina. Incube as células por cinco minutos a 37 graus Celsius. Pare a digestão da tripsina adicionando três mililitros de meio de crescimento.

Transfira o restante para um tubo de centrífuga de 15 mililitros. Em seguida, de um tubo de 15 mililitros, pegue uma alíquota para contagem de células. Centrifugar as células durante cinco minutos a 200 vezes G enquanto a centrifugação estiver em curso.

Conte as células. Em seguida, aspire a mistura de meio de tentina e substitua-a por um crescimento fresco. Meio em um volume determinado pela densidade celular necessária previamente calculada conforme descrito no protocolo de texto como uma etapa opcional.

Passe a suspensão celular por um filtro para remover quaisquer grumos. Os esferoides podem ser gerados em uma variedade de formulações de meios, no entanto, os testes iniciais devem ser realizados usando o meio em que as células foram cultivadas. Para distinguir as consequências da transição para um sistema de cultura tridimensional das consequências da mudança na composição do meio, comece adicionando 0,4 mililitros de meio de crescimento a cada centrífuga de poço por dois minutos a 2000 vezes G.To remova as bolhas usando um microscópio invertido de baixa ampliação, verifique se as bolhas foram removidas dos micropoços.

Em seguida, adicione 0,4 mililitros de suspensão de células na densidade necessária aos micropoços. Em seguida, misture delicadamente pipetando para cima e para baixo sem introduzir bolhas de ar nos micropoços, certifique-se de que as células sejam distribuídas uniformemente por todo o poço. Para obter esteróides consistentes.

Centrifugue a placa por cinco minutos a 200 vezes. G, a placa deve ser balanceada internamente, bem como contra a outra placa, de modo que o peso seja distribuído uniformemente para ambos os lados do suporte da placa. Isso garante que a placa se autonivele durante a centrifugação, de modo que as correntes de convecção não surjam e resultem em distribuição desigual de células pelos micropoços.

Usando um microscópio invertido, verifique se as células se agruparam dentro dos micropoços e se estão distribuídas uniformemente pelo poço antes de incubar as células durante a noite a 37 graus Celsius. Observe o processo de formação de esferóides usando um microscópio invertido. Algumas linhas celulares formarão esteróides compactos dentro de 24 horas.

Outros podem demorar mais. A progressão do cluster para o agregado nas células HT 29 é mostrada aqui. A parte mais difícil deste procedimento é retirar os esteróides intex sem perturbar as estruturas Para extrair esteróides de micro poços pipetar para cima e para baixo muito suavemente para permitir que os esferóides saiam dos micro poços.

Em seguida, incline a placa para aspirar a mistura de esteróides médios. Use pontas de pipeta de orifício largo para esteróides de tamanho maior para evitar quebrar o esteróide. Depois de recuperar o esteróide dos micropoços, transfira para a cultura de suspensão jorrando-os suavemente com uma pipeta.

Alternativamente, a rosa severa pode ser mantida em convulsão com uma substituição média. A duração depende do tamanho inicial e da taxa de crescimento, que define o tempo até que eles superem os micropoços. Bem, eles foram formados para substituir o meio sem perder esteróides.

Aspire o meio na borda do poço. Usando uma pipeta de pastagem, abaixe lentamente a ponta até que comece a retirar o líquido do menisco e siga o menisco para baixo à medida que ele cai. Em seguida, adicione meio fresco contra a parede do poço no mesmo lugar.

Ao adicionar o meio fresco, lembre-se de empurrar a pipeta suavemente e manter a ponta contra a parede para evitar perturbações do PHE nos micropoços. Alguns esteróides podem ser perdidos. No entanto, se o meio for sempre aspirado e recolocado na mesma posição, esse número permanecerá pequeno.

Em comparação com o grande número de esteróides de várias linhagens tumorais de diferentes origens anatômicas podem ser facilmente extraídos em suspensão. O controle de tamanho consistente obtido por meio deste método é demonstrado aqui com populações de esteróides altamente uniformizadas. Sob cada condição formada a partir de 700 ou 1.500 células.

Diferenças claras de comportamento entre linhas também são visíveis com células cancerígenas de cólon HT 29 e células cancerígenas de esôfago TE seis formando esteróides densamente compactados com limites bem definidos. Por outro lado, as células de câncer de próstata lin cap dão origem a esteróides menos coerentes com limites irregulares. As forças internas mais fortes nos agregados mais coerentes também resultaram no colapso para uma forma mais simétrica, mesmo ainda nos micropoços em que foram formados.

No entanto, os agregados de tampa de lin, particularmente no tamanho maior, retêm visivelmente a geometria parametálica quadrada dos micropoços Uma vez dominado, esse processo pode ser realizado em cerca de uma hora mais o período de incubação necessário para que as células adiram e produzam fluidos. Ao tentar este procedimento, é importante lembrar de garantir que borbulha outro, viajando pelos micro poços antes de adicionar as células.