Quantificação da Resposta explosão respiratória como um indicador da imunitário inatas Saúde em Zebrafish
12 de setembro de 2013
A resposta imune inata protege os organismos contra uma infecção patogénica. Um componente crítico da resposta imune inata, a explosão respiratória de fagócitos, gera espécies reativas de oxigênio, que matam microorganismos invasores. Nós descrevemos um ensaio de explosão respiratória que quantifica as espécies reativas de oxigênio produzidas quando a resposta imune inata é induzida quimicamente.
O objetivo geral deste procedimento é utilizar a fluorescência para quantificar a resposta da explosão respiratória. Primeiro, carregue os embriões de peixe-zebra nos poços de uma placa de 96 poços. Em seguida, adicione um substrato fluorescente e ative a explosão respiratória com um agente químico.
Em seguida, quantifique a fluorescência relativa utilizando um fluorímetro. Em última análise, a fluorescência é usada para demonstrar o potencial de explosão respiratória. Este método pode ser utilizado para estudar como manipulações experimentais afetam a saúde imunológica inata geral.
Aqui, utilizamos esse método para investigar a explosão respiratória de embriões de peixe-zebra, mas ele também pode ser aplicado a outros sistemas, como peixes-zebra adultos, células renais e preparações celulares de outras espécies de peixes. Incube os embriões em placas de Petri profundas a 28 graus Celsius em água de ovo até o estágio de desenvolvimento desejado. Remova diariamente os embriões mortos.
Decante cuidadosamente a água antiga dos ovos e substitua por água fresca diariamente. No dia do experimento, prepare uma solução trabalho de fluoresceína reduzida em um tubo microcentrífugo de 1,7 mililitro envolto em papel alumínio. Prepare também uma solução trabalho com concentração final de 20 microgramas por mililitro de PMA.
Em seguida, prepare cinco mililitros de cada solução de dosagem em tubos cónicos de 15 mililitros conforme descrito no texto acompanhante. Mantenha as soluções de dosagem em gelo; primeiro, ligue o leitor de microplacas e aqueça a fonte de luz para medir a fluorescência. Configure um programa detalhando os comprimentos de onda de excitação e emissão, a sensibilidade da posição óptica e inclua também um passo de agitação de cinco segundos.
Antes da leitura, organize os materiais experimentais, incluindo placas com embriões revestidos. Uma placa de microtitulação preta de 96 poços, um pipetador P200 e ponteiras, um balde de gelo com os reagentes contendo fluoresceína. Um pipetador multicanal P200, dois reservatórios estéreis, papel alumínio e tesoura.
Agora corte a ponta de uma pipeta de modo que os embriões ou rins possam passar pela abertura. Ajuste uma pipeta P200 para 100 microlitros e transfira um embrião junto com água de ovo para quantos poços de uma microplaca preta de 96 poços forem desejados. Agora, despeje a solução de dosagem em um reservatório estéril de 25 mililitros usando uma pipeta multicanal P200.
Adicione 100 microlitros da solução de dosagem H 2D CFDA em uma coluna da microplaca de 96 poços; repita para metade das amostras de embriões controle e metade das amostras de embriões manipulados experimentalmente. Despeje a solução de dosagem contendo PMA em um novo reservatório estéril de 25 mililitros.
Em seguida, alíquota esta solução de dosagem nas colunas restantes da placa microplaaca de 96 poços. Cubra a microplaca com papel alumínio e coloque em agitador por aproximadamente 20 segundos. Incube a microplaca a 150 RPM e 28 graus Celsius quando não estiver sendo lida.
Leia a microplaca após a adição de PMA. Continue realizando as leituras a cada poucos minutos pelo intervalo de tempo desejado, ou incube a microplaca envolta em papel alumínio a 28 graus Celsius até um ponto temporal fixo. Em seguida, recupere os embriões das cavidades e eutanase-os de acordo com o protocolo institucional de cuidados e uso de animais.
Além disso, descarte a microplaca e outros materiais descartáveis no recipiente para resíduos biológicos perigosos. Escolha o ponto temporal no qual deseja comparar a fluorescência. Subtraia o valor médio de fluorescência do grupo controle não induzido dos valores individuais de fluorescência do grupo controle induzido por PMA.
Repita isso para o grupo experimental com e sem PMA. Em seguida, armazene esses valores de fluorescência normalizados em colunas, o grupo controle com PMA e o grupo experimental com PMA. Em seguida, calcule as médias e os desvios padrão dos valores de fluorescência normalizados do grupo controle com PMA e do grupo experimental com PMA.
Compare os valores de fluorescência normalizados utilizando um teste T não pareado para determinar a significância estatística. Em seguida, construa um gráfico com as médias do grupo controle mais PMA e do grupo experimental mais PMA, com barras de erro que reflitam os desvios-padrão apropriados, e registre o nível de significância no gráfico e na legenda da figura. Este experimento compara a resposta de explosão respiratória em embriões de peixe-zebra selvagem da linhagem AB às 48 horas e 72 horas após a fertilização.
A fluorescência bruta foi medida quatro horas após a adição de PMA nos grupos induzidos por PMA. Os valores de fluorescência bruta foram mais altos na população de 72 HPF. Como indicado pelas médias calculadas, os valores de fluorescência foram normalizados para compensar a variabilidade nos níveis de fundo de fluorescência.
Os resultados deste ensaio de explosão respiratória revelaram que os embriões de peixe-zebra de 72 HPF são capazes de produzir significativamente mais espécies reativas de oxigênio e, portanto, desencadear uma resposta de explosão respiratória mais robusta do que embriões de 48 HPF após indução com PMA. Após assistir a este vídeo, você deverá ter uma boa compreensão de como usar fluorescência para quantificar o potencial de explosão respiratória de embriões de peixe-zebra. Não se esqueça de que o trabalho com o pó de PMA pode ser extremamente perigoso; portanto, tome precauções, como o uso de máscara facial ao pesar o pó de PMA.
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Visão Geral
Este artigo descreve um ensaio de explosão respiratória que quantifica as espécies reativas de oxigênio produzidas durante a resposta imune inata. O método utiliza fluorescência para medir a explosão respiratória em embriões de peixe-zebra quando ativado por um agente químico.
Componentes Principais do Estudo
Área da Ciência
- Imunidade Inata
- Função dos Fagócitos
- Espécies Reativas de Oxigênio
Antecedentes
- A resposta imune inata é crucial para a defesa contra patógenos.
- Os fagócitos geram espécies reativas de oxigênio para eliminar microrganismos.
- A quantificação da explosão respiratória pode fornecer informações sobre a saúde imunológica.
- Este ensaio pode ser adaptado para diversas manipulações experimentais.
Objetivo do Estudo
- Desenvolver um método para quantificar a resposta de explosão respiratória.
- Avaliar os efeitos de agentes químicos na função imune inata.
- Fornecer uma ferramenta para estudar a saúde imunológica em modelos de peixe-zebra.
Métodos Utilizados
- Carregamento de embriões de peixe-zebra em uma placa de 96 poços.
- Adição de um substrato fluorescente aos poços.
- Ativação da explosão respiratória com um agente químico.
- Quantificação da fluorescência utilizando um fluorímetro.
Resultados Principais
- O ensaio quantifica com sucesso o potencial da explosão respiratória.
- Os níveis de fluorescência correlacionam-se com a resposta imune inata.
- Este método permite a avaliação da saúde imunológica.
- Manipulações experimentais podem ser avaliadas utilizando este ensaio.
Conclusões
- O ensaio de explosão respiratória é uma ferramenta valiosa para o estudo da imunidade inata.
- A quantificação da fluorescência fornece informações sobre as respostas imunes.
- Este método pode aprimorar a compreensão da saúde imunológica na pesquisa.
Perguntas Frequentes
Relevância Executiva para a Indústria
A quantificação da resposta de explosão respiratória fornece uma leitura funcional do estado de saúde do sistema imunológico inato em modelos de peixe-zebra, permitindo a avaliação precoce de compostos imunomoduladores. Este ensaio apoia a validação de alvos ao associar manipulações genéticas ou farmacológicas a alterações mensuráveis na produção de espécies reativas de oxigênio, um mecanismo efetor fundamental na defesa contra patógenos. A adaptabilidade deste método em diferentes estágios de desenvolvimento e tipos de amostras aumenta sua utilidade na redução de riscos de candidatos imunomoduladores antes do investimento pré-clínico.
Aplicações Estratégicas em P&D de Biotecnologia Farmacêutica
Descoberta Inicial e Validação de Alvo
- Valor Científico: Avalia hipóteses terapêuticas mediante a medição da saída funcional da ativação de fagócitos em resposta a manipulações experimentais.
- Valor Operacional: Permite a redução de riscos biológicos por meio da comparação quantitativa do potencial de explosão respiratória em diferentes condições genéticas ou de tratamento.
- Valor Preditivo: Apoia a triagem de portfólios ao correlacionar os resultados do ensaio com a competência imunológica inata, auxiliando decisões de avançar ou não com candidatos imunomoduladores.
Desenvolvimento de Triagem e Ensaios
- Prontidão para ensaio: Produz saídas padronizadas e quantitativas de fluorescência adequadas para triagem em alta produtividade de bibliotecas de compostos.
- Reprodutibilidade: Utiliza fluorescência normalizada e comparação estatística (teste t não pareado) para garantir comparações confiáveis entre experimentos.
- Escalabilidade: Compatível com formatos de placas de 96 poços, facilitando testes com múltiplas condições e reutilização em plataformas distintas em fluxos de trabalho de perfilagem imunológica.
Pesquisa Translacional e Pré-clínica
- Relevância para Doenças: Modela a resposta imune inata relevante para infecção e inflamação, apoiando o alinhamento translacional de biomarcadores.
- Continuidade Pré-clínica: Conecta descobertas do estágio de pesquisa com a validação funcional da imunidade em organismos inteiros ou preparações de tecidos.
- Avanço Ajustado ao Risco: Orienta decisões sobre otimização de compostos líderes ao identificar substâncias que modulam significativamente a atividade da explosão respiratória.
Integração de Pipeline e Fluxo de Trabalho
O ensaio insere-se no continuum de descoberta, desde a validação do alvo até a identificação de compostos líderes, fornecendo dados funcionais de perfilagem imunológica que complementam as telas de engajamento do alvo e telas fenotípicas.
- Biologia da Descoberta: Apoia a verificação de hipóteses ao associar a redução gênica, superexpressão ou tratamento com fármacos a alterações mensuráveis na função efetora da imunidade inata.
- Triagem: Fornece resultados quantitativos reprodutíveis que permitem comparação confiável dos efeitos de compostos sobre a ativação de fagócitos.
- Análises: Gera valores de fluorescência normalizados e resultados estatísticos (médias, desvios padrão, resultados do teste t) que possibilitam comparação objetiva entre condições experimentais.
- Pesquisa Translacional: Conecta descobertas imunológicas iniciais à relevância pré-clínica por meio do uso em rins de peixes-zebra adultos e preparações celulares interestespécies.
- Reutilização Empresarial: Funciona como uma leitura modular de saúde imunológica aplicável em múltiplos projetos que estudam imunomodulação, modelos de infecção ou vias inflamatórias.
Impacto Operacional e Empresarial
- Valor Científico: Fornece confiança preditiva na validação de alvos ao reduzir a ambiguidade mecanicista em torno dos efeitos imunomoduladores.
- Valor Operacional: Garante padronização e reprodutibilidade por meio de protocolos definidos de incubação com substrato, indução e medição.
- Valor Estratégico: Melhora a eficiência do capital ao permitir a eliminação precoce de riscos associados a compostos imunomoduladores com base em leituras funcionais da saúde imunológica.
- Impacto na Carteira: Apoia a priorização ajustada ao risco ao identificar compostos que alteram significativamente o potencial de explosão respiratória, um indicador da competência imune inata.
Considerações sobre a Implementação
- Exige experiência no manuseio de embriões de peixe-zebra, na medição de fluorescência e na análise estatística de dados normalizados.
- Depende do acesso a um leitor de microplacas com capacidade de detecção de fluorescência e tempo adequado de aquecimento da fonte de luz.
- Necessita padronização entre equipes quanto ao estagiamento dos embriões, ao tempo de dosagem e aos protocolos de subtração do fundo.
- Envolve considerações de adaptação ao aplicar o método a tecidos de adultos ou a outras espécies de peixes, conforme indicado na fonte.
- Inclui limitações práticas, como a natureza perigosa da PMA, exigindo precauções de segurança durante o manuseio e a pesagem.
