À base de ácido Polymalic Nano Biopolímeros para Segmentação de múltiplos marcadores tumorais: uma oportunidade para a medicina personalizada?

O objetivo geral é estabelecer uma plataforma em escala nanométrica aberta para um protocolo universal de síntese de medicina personalizada com base no perfil genético da doença de uma pessoa, especialmente no câncer. Primeiro, produza e purifique o ácido polimalico a partir do microrganismo frum polycephalum, ative quimicamente o PMLA purificado em seus grupos carboxílicos laterais. Prenda grupos funcionais pequenos e o ligante MEA pela substituição dos grupos ativados e reverta os grupos ativados não utilizados em grupos carboxílicos por hidrólise.

Em seguida, adicione os anticorpos e as moléculas antissenso por meio dos grupos sulfidrila do espaçador, MEA e tampa. O espaçador não utilizado pela reação com PDP ao final do teste avalia a composição e a função do eletrodo. Os resultados com nanofármacos derivam de um modelo animal, como camundongos portadores de tumores humanos agressivos.

O câncer de mama positivo para HER2 pode determinar a eficácia do tratamento e também se o tratamento ocorre sem efeitos colaterais indesejados. A principal vantagem da bioprodução em relação aos métodos sintéticos existentes, como a polimerização convencional, é que o biopolímero mantém pureza óptica completa e não é contaminado por subprodutos. Essa família de nanofármacos PolyPhen pode direcionar-se a qualquer tipo celular com base em direcionamento específico e regular a expressão proteica.

De modo geral, o tratamento do câncer por nano fármacos à base de PHE é muito eficiente em diversos modelos animais, especialmente em cânceres primários do cérebro e da mama. Tivemos inicialmente a ideia deste método para bloquear a síntese da laminina específica de glioblastoma em suas formas isoformas e, posteriormente, demonstramos o direcionamento e a inibição das proteínas HER2 e de câncer de mama triplo negativo para impedir o crescimento tumoral. As implicações desta técnica estendem-se ao diagnóstico do câncer por meio de imagem óptica e ressonância magnética.

As nano drogas poliméricas podem fornecer informações sobre a entrega de medicamentos para o tratamento do câncer. Elas também podem ser aplicadas a outras condições patológicas, como doenças infecciosas, alívio da dor e distúrbios neurológicos. Após cultivar uma cultura inicial de plasmódio a partir de spial em auger, inocular 100 mililitros de meio de cultura basal e cultivar a cultura a 25 graus Celsius.

O incubador Thermos indicado produz uma quantidade de microplasma modia compactada por gravidade, sob exclusão de luz. Para evitar esporulação em um biorreator de 10 litros, dissolva 80 gramas de carbonato de cálcio em oito litros de meio basal, transfira então o microplasma modia compactado para o vaso de reação montado e configure o biorreator por 75 horas. A 25 graus Celsius, com fluxo de ar filtrado de 10 litros por minuto e agitação de 150 RPM por um agitador segmentado.

Quando o caldo de cultura atingir um pH de 4,8, interrompa o cultivo para medir a produção de ácido polimaléico. Agora, resfrie o caldo a 17 graus Celsius e deixe as células sedimentarem por gravidade, removendo o sobrenadante da cultura do reator. Ajuste o pH para 7,5.

Agora, aspire o sobrenatante a partir da base através de uma coluna de celulose DEAE de 1,5 litro equilibrada com cloreto de tris 20 milimolar pH 7,5 a cinco graus Celsius. Em seguida, passe três volumes de coluna do tampão de lavagem contendo cloreto de sódio 0,3 molar de baixo para cima na coluna e elua a PMLA na presença de cloreto de sódio 0,7 molar. Ajuste a fração eluída de PMLA para cloreto de cálcio 0,1 molar e adicione etanol gelado a 80% para precipitar o cálcio de PMLA. Em seguida, fracione por tamanho o cálcio de PMLA usando cidex G 25 e água.

Finalmente, passe cada fração por uma coluna de luz âmbar e congele imediatamente o fluxo de ácido polimalico em nitrogênio líquido, liofilize e armazene a menos 20 graus Celsius. Para ativar os grupos carboxila do PMLA, misture um milimol de unidades de ácido málico do P-M-L-A-H em um mililitro de acetona anidra e um milimol, de cada, de anidrido hidroxissucínico e carbodiimida cicloexílica, em dois mililitros de dimetilformamida; após agitar a 20 graus Celsius por três horas, adicione 0,05 milimol de metil-Pega em um mililitro de DMF, seguido por 0,05 milimol de trietilamina.

Em seguida, adicione gota a gota 0,4 milimol de éster etílico da leucina e, após uma hora, verifique a conclusão da reação por meio da resposta negativa ao teste de hyn em cromatografia em camada delgada. De maneira semelhante, adicione 0,1 milimol de dois mercapto, 1-etilamina e 0,5 milimol de TEA. Remova o éster NHS remanescente por hidrólise espontânea com solução salina tamponada com fosfato.

Desalinize em uma coluna PD 10 e liofilize para obter um pó branco; armazene este pré-conjugado seco a menos 20 graus Celsius. Em seguida, adicione 30 miligramas de anticorpo em 4,5 mililitros de cloreto de sódio 150 milimolar em fosfato de sódio 100 milimolar, pH 5,5. Reduza as ligações dissulfeto com tris 5 milimolar, cloreto de tris(2-carboxietil)fosfina, e purifique em uma coluna PD 10.

Agora, dissolva o IDE PEG IDE em dois mililitros do tampão acima, mas a pH 6,3. Adicione o anticorpo reduzido e agite a 20 graus Celsius por uma hora. Concentre até 2,5 mililitros sobre AVEVA spin 20 com exclusão de 30 quilodaltons e, em seguida, purifique sobre cidex G 75.

Agora, verifique o produto por meio de CLAE em coluna de exclusão por tamanho. Meça a quantidade em 280 nanômetros e também confirme a ausência de impurezas em outros comprimentos de onda. Em seguida, misture 50 miligramas do pré-conjugado com 200 UMEs do PEG IDE conjugado ao anticorpo em cinco mililitros do tampão pH 6,3.

Ajuste a concentração de sulfidrila para dois milimolares e incube a 20 graus Celsius por três horas. Para obter um rendimento de 98%, solubilize o oligonucleotídeo antissenso amino trissubstituído reagindo com um volume de SPDP, purifique o A-O-N-P-D-P em coluna de Sephadex LH-20 em metanol, evapore então o metanol, dissolva o produto em água e liofilize. Incube agora 800 nanomols do aos ativado com o conjugado anticorpo-PEG prévio a MEA-SH durante a noite. Quando a reação de troca de dissulfetos for concluída, incorpore então o bloqueio com corante fluorescente, remova o excesso de sulfidrilas com PDP e purifique em coluna de Sephadex G-75.

Armazene o nano fármaco final à base de ácido polimalico a menos 20 graus Celsius para estimar o teor de ácido polimaléico durante a produção, proceda da seguinte forma: a 320 microlitros da amostra, adicione 160 microlitros de cloreto de hidroxilamônio a 10% e 160 microlitros de hidróxido de sódio a 10%. Após 10 a 15 minutos, misture com 160 microlitros de solução de cloreto férrico a 5% e visualize a formação de uma coloração roxa escura a 540 nanômetros. Em seguida, hidrolise o nano fármaco durante a noite em ácido clorídrico dois molar a 110 graus Celsius usando um ensaio com ampola selada para ácido maléico por cromatografia de fase reversa.

Utilizando amostras enriquecidas com padrões de ácido maleico. Agora, clive o nano fármaco com dietiol a 100 milimolar e meça os oligonucleotídeos antisense morpholino por CLAE reversa quantitativa contra padrões de ON morpholino. Utilizando o nano fármaco clivado, meça o teor de anticorpo utilizando um kit de ensaio proteico para quantificar o teor de PEG Malik.

Primeiro, reaja com tiocianato de amônio OT, depois extraia com clorofórmio e meça a absorbância em 510 nanômetros. Teste a atividade do anticorpo e a codiligação por ELISA, utilizando cinco microlitros de nanofármaco por poço e 0,5 microgramas por poço de HER2 como antígeno revestido na placa. Por fim, calcule a porcentagem alcançada para o oligonucleotídeo antisense, EG e anticorpo em relação ao ácido maleico.

Compare com a porcentagem prevista pelo design do fármaco. Essa abordagem estratégica bimodal para o fármaco nano emprega Herceptin para inibir a via de sinalização HER2 e um oligonucleotídeo antisense específico para HER2 para bloquear a transcrição do receptor HER2. Os anticorpos facilitam a transcitose por meio do TFR endotelial dos vasos tumorais. A plataforma nanoconjugada de ácido polimaléico foi produzida por microplasma cultivado e purificada, e a ativação dos grupos carboxílicos do PMLA facilitou a síntese do esqueleto pré-conjugado.

E, finalmente, o conjugado nano com chumbo. Ensaios Eli SA demonstraram a retenção de anticorpos monoclonais ativos durante toda a síntese do nano fármaco. Com ambos os anticorpos montados na mesma plataforma polimérica, a microscopia confocal de fluorescência acompanhou a captação celular do nano fármaco.

As imagens sobrepostas no tempo zero e após três horas foram analisadas em conjunto com os endossomos marcados. Os coeficientes de correlação de Pearson para colocalização indicam a liberação do nano fármaco a partir dos endossomos para o citoplasma e a dissociação de um ON do nano fármaco por clivagem de dissulfeto dependente de glutationa no citoplasma. In vitro, o nano fármaco líder inibiu significativamente o crescimento de forma mais eficaz na linhagem celular que superexpressa HER2.

Experimentos in vivo em camundongos portadores de câncer de mama humano BT 4 74, com superexpressão de HER dois, mostraram inibição de crescimento superior a 95% pelo nanofármaco líder contendo Herceptin. E HER dois específico A ON, análises ex vivo por Western blot indicaram inibição tanto da síntese de HER dois quanto da fosforilação de a KT e clivagem de PARP, marcando apoptose. A regressão tumoral em resposta ao tratamento com o fármaco é demonstrada pela redução do tumor e esgotamento das células tumorais por exame histológico.

Agora você deve ter um bom entendimento de como utilizar uma plataforma nano biocompatível para obter um tratamento personalizado eficaz sem efeitos colaterais e alcançar uma nano droga com composição controlada e atividades funcionais verificadas. Uma vez dominados, esses sensores podem ser realizados com alta reprodutibilidade após seu desenvolvimento. Esta técnica, que utiliza uma plataforma nano de ácido poliácido para entrega direcionada de oligonucleotídeos antissenso, abre caminho para pesquisadores na área de medicina nano personalizada explorarem o tratamento de tumores direcionado a marcadores moleculares tumorais específicos identificados por análise genética personalizada. Farmacologicamente, agentes ativos e células podem ser extremamente perigosos.

Precauções como o uso de máscara e luva devem sempre ser tomadas ao realizar este procedimento.