Name: A indução farmacológica de melanina epidérmica e proteção contra queimaduras solares em um modelo humanizado Rato (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-09-07T16:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 37 s
Description: Aprenda a induzir melanina epidérmica com forskolina em modelo murino para proteção contra radiação UV. Este método demonstra como aumentar a pigmentação cutânea e reduzir danos solares.

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Os autores agradecem a Malinda Spry para assistência técnica. Agradecemos, ainda, fontes de financiamento atuais e do passado: o Instituto Nacional do Câncer (R01 CA131075, R01 CA131075-02S1), o Will Caso Cancer Research Fund Wendy, a Fundação Markey Câncer, da Criança Miracle Network ea Jennifer e David Dickens Foundation Melanoma Research.

1. Preparação de Forskolin para administração tópica de um extrato de raiz bruto da Usina Plectranthus barbatus (Cohleus forskohlii) <ol><li> Protocolos para experimentos murino seguiu as diretrizes para a conduta ética no cuidado e uso de animais e foram aprovados pelo Comitê Institucional Animal Care e Use na Universidade de Kentucky (Protocolo n 00768M2004). O extracto de raiz é composta de 40% peso / volume, em uma base dermatológica padrão de 70% de etanol, 30% de propileno glicol. </li><li> Pesar 200 g de extrato de raiz de forskolin bruto e transferi-lo para um copo. Para fazer 500 ml de uma solução a 40% (w / v), ressuspender 200 g de extracto de raiz de forscolina em bruto por adição de mais, mas não todo o volume do veículo (etanol a 70%, 30% de propileno glicol) e levar a solução a cerca de 450 ml. </li><li> Agita-se durante uma hora à temperatura ambiente. A solução será um pouco viscosa e pode necessitar de agitação manual para &quot;levantar&quot; o extracto em solução antesa barra de agitação é capaz de assumir. </li><li> Após uma hora de agitação, verter a mistura em um cilindro graduado e levar o volume a 500 ml usando veículo que tem sido usada para &quot;enxaguar&quot; a proveta que foi usada para agitar a suspensão (para maximizar a recuperação de forscolina a partir da proveta) . </li><li> Transferência da suspensão de 50 ml de tubos de centrífuga de polipropileno. Centrífuga (1.500 x g, a temperatura ambiente, 15 min), usando uma centrífuga de mesa. Neste ponto, o material insolúvel vai ser bastante compacta, permitindo-se o sobrenadante para ser facilmente vertido. </li><li> Filtrar a solução através de uma membrana de acetato de celulose de 0,22 um para remover qualquer material insolúvel residual a partir do extracto. Usamos um sistema para frascos concebido para a cultura de células, juntamente com a utilização de pré-filtros, que vêm com o aparelho, para evitar coagulação prematura da membrana a partir de componentes insolúveis do extracto de raiz. Ao fazer grandes volumes de extracto, filtrar a cerca de 100 ml de cada vez, a alteração da aposta pré-filtroween cada volume adicionado. </li><li> Quando armazenada à temperatura ambiente, o extracto mantém actividade biológica durante até um ano. </li></ol> 2. Preparação de C57Bl / 6 K14-Scf Ratos para tratamentos tópicos <ol><li> Retire a pele dorsal dos animais por corte elétrico. Resumidamente anestesiar os animais com isoflurano inalatório para facilitar corte de pele dorsal com tesouras elétricas equipadas com uma 0,25 milímetros cabeça de preparação cirúrgica (Fisher Scientific). De preferência, usar apenas um tipo de anestesia (por exemplo, cetamina / xilazina) para minimizar o risco de overdose de anestésico. A câmara de inalação saturado traz risco ocupacional quando usado fora de uma coifa e fornece quantidades desconhecidas de anestésico para animais. Idealmente, um vaporizador de precisão deve ser usado. </li><li> Para remover a palha residual cabelo, tratar os animais com um depilatório químico. Administrar anestesia para o animal com uma injecção ip de cetamina 40 mg / kg de xilazina e 4 mg / kg </li&gt; <li> Uma vez que os animais são devidamente anestesiados (a julgar pelo toe pitada), aplique uma quantidade dedo-sized de creme depilatório para a pele dorsal cortado usando um dedo de luva. Esfregue o creme na pele por 30-60 seg ou até que os cabelos podem ser claramente visto no creme como está sendo movimentados. Deixar o creme apenas para a quantidade de tempo mínima necessária para a remoção do cabelo como a exposição prolongada conduz a queima química da pele, desagregação epidérmica e morte causados ​​pela perda de integridade da epiderme. </li><li> Limpe a pele dorsal com compressas de gaze embebida em água repetidamente até que todos creme foi removido. Animais seque com toalhas de papel macio, e permitir-lhes recuperar em um local quente isolada (por exemplo, limpar gaiolas colocadas em uma almofada de aquecimento). Depilar os animais um a um e acompanhar de perto todo o procedimento. </li></ol> 3. A administração tópica de Forskolin ou controle do veículo <ol><li> Os animais devem ser tratados um de cada vez. Resumidamente anestesiar com inspiraçãod isoflurano, colocando o mouse em cima de um filtro permeável ao ar nylon equipados de forma sob a qual foi colocada uma toalha de papel saturado de isoflurano em uma jarra de vidro com tampa clara saturado de isoflurano em uma coifa. Exponha o mouse para isoflurano durante o tempo suficiente como para suprimir movimentos musculares voluntários, mas para preservar a respiração espontânea (tipicamente 10-20 seg.) Deixar o animal em isoflurano muito tempo irá resultar em supressão respiratória e morte. É melhor errar do lado da &quot;luz vai&quot; e ter de voltar a expor o mouse rapidamente para mais isoflurano, em vez de sobre-expor o animal à morte de drogas e risco. </li><li> Retire o animal da câmara de isoflurano e coloque em uma almofada banco absorvente limpo. </li><li> Usando uma micropipeta de 1000 ul equipado com uma ponta descartável de polipropileno, chamar-se 400 ul de 40% de extracto de forscolina em bruto (animais de controlo de veículo irá receber 70% de etanol, 30% de propileno glicol por si só). </li><li> Transferir o extracto sobre odorso do animal por gotejamento que sobre a pele e, em seguida, utilizando-se o lado da ponta da pipeta, manchar o extracto sobre a pele dorsal até que toda a pele tenha sido coberta. Não há necessidade de apagar a pele após a aplicação. </li><li> Retorne o mouse para sua jaula, e observar cuidadosamente até que ele se recupera da anestesia. </li><li> A fim de que os efeitos não-cAMP pigmento não deve confundir experimentos de sensibilidade de UV, interromper todos os tratamentos tópicos 2 dias anteriores à exposição à radiação UV (pigmento de efeito dura vários dias além último tratamento tópico). </li></ol> 4. Pele de medição de cor por Reflective Colorimetria <ol><li> Resumidamente anestesiar o mouse com isoflurano inalado (veja acima). </li><li> Calibrar um colorímetro Minolta, colocando a cabeça móvel sobre a superfície branca normalizadas fornecidas com o colorímetro. </li><li> Coloque a cabeça de medição portátil do colorímetro nivelada com a pele dorsal do animal garantindo que a rodada Apertur um centímetro 2e está completamente pressionado sobre a pele. Tome pelo menos três medidas distintas em diferentes áreas da pele dorsal. </li><li> Calcular média L pontuação * ± SD por animal e por grupo de tratamento. Colorimetria reflexiva pode ser feito em qualquer ponto do experimento. </li></ol> 5. Determinação da Sensibilidade UV por Cálculo de &quot;Minimal eritematosa Dose&quot; (MED) <ol><li> Use animais que tenham sido pré-tratados com veículo ou forscolina como descrito acima. Anestesiar os animais com injecção intraperitoneal de uma mistura padrão de cetamina e xilazina (ver acima). </li><li> Prepare um pedaço de fita UV-oclusiva para o teste MED. Para gerar furos na fita, use um furador pesados ​​com um 1 cm 2 recorte circular (Figuras 2A e B). Ter furos de um tamanho definido e disposição simétrica na fita facilita o reconhecimento de alterações na pele após a irradiação. Sobre cada buraco na fita, aplique um pedaço pequeno, mas facilmente destacável<html> da fita que podem ser removidos em períodos definidos durante a exposição aos raios ultravioleta para permitir a administração de doses de UV diferentes. </li><li> Uma vez que os animais são adequadamente sedado, coloque a fita na superfície dorsal. Lubrificante ocular devem ser sempre utilizados sob anestesia. </li><li> Ligue a fonte de UV consistindo de dois Westinghouse F15T8UV-B lâmpadas com uma potência máxima de 313 nm e uma gama de 280-370 nm. Permita que a lâmpada atingir a uma saída de UV constante medida por um fotômetro UV com um sensor de UVB (geralmente leva alguns minutos para que as lâmpadas para aquecer). </li><li> Com base na taxa de transmissão de UV tal como medido pelo fotómetro UV, calcular o tempo de exposição à radiação UV, para cada dose desejada. Por exemplo, medidas de UVB saída do nosso lâmpada de 2,4 mW / cm 2. Portanto, para administrar 5 kJ / m 2, a pele que necessita de ser exposta a 208 segundos (o que é de 3 min e 28 seg) da radiação UVB, como calculado abaixo: upload/50670/50670eq1.jpg &quot;/&gt; </li><li> Coloque os animais sedados (cada um com fita oclusivo no local) ventral superfície para baixo para garantir a exposição ainda UV. Para administrar as doses escolhidas de radiação UV, remover sequencialmente as pequenas fitas oclusivas que cobrem os orifícios para expor áreas de 1 cm2 de pele para as doses correctas de radiação. Assim, utilizando o exemplo acima, se 40 kJ / m 2 é a maior dose na experiência, então o animal estaria sob a lâmpada de 27 min e 47 seg total e a pele no estado de 40 kJ / m 2 não teria sobrepondo-se a fita o tempo todo. Entretanto, a fita se sobrepõe à condição 5 kJ / m 2 seria removido quando não é de 208 seg restante da exposição. O tempo de remoção de fita deve ser feito para que cada condição termina simultaneamente. </li><li> Após a exposição UV, descolar a fita da pele dorsal com cuidado, tomando cuidado para não rasgar a pele com movimentos bruscos ou excessivamente fortes. Coloque os animais em um lugar calmo quente para permitirrecuperação da anestesia. </li><li> Monitorar ratinhos durante 24-48 horas a olhar para zonas discretas de eritema (vermelhidão) ou edema (inchaço) correspondente para os locais anatómicos expostos a uma dose específica de irradiação UV. Documente achados cutâneos fotograficamente. </li><li> MED valor corresponde à dose mínima de UV, que provoca a inflamação, tal como definido por eritema e / ou edema de todo o círculo de pele exposta. Note-se que a pigmentação da pele pode desafiar a determinação do MED, no entanto, eritema e edema ainda pode geralmente ser avaliada com precisão, graças em parte à forma definida das aberturas na fita durante a exposição UV. </li></ol> 6. Análise Estatística Analisar dados entre grupos de ratos por um way ANOVA com pós-teste de Bonferroni (Graph Pad PRISM). Valores de p &lt;0,05 são considerados estatisticamente significativos.

Os autores declaram que não têm interesses financeiros concorrentes.

Usando um modelo animal do ser humano de pele clara, nós achamos que a aplicação tópica de um extrato bruto da raiz rica em forskolin robustamente escurece a epiderme, estimulando a produção de melanina na pele. Epidermal melanização é dependente da expressão do factor de células estaminais na epiderme basal, como ocorre na pele humana, mas não na pele de rato não modificado geneticamente. A pele dorsal de ratinhos geneticamente não modificada não tem um número suficiente de melanócitos interfoliculares para conferir pi...

A incidência de melanoma, a forma mais letal de câncer de pele, aumentou dramaticamente ao longo das últimas décadas nos Estados Unidos, principalmente entre os indivíduos de pele clara. Evidência molecular e epidemiológica forte implica radiação UV como um grande causador fator ambiental 2-5. O aumento da exposição aos raios UV na forma de exposição ao sol e uso de bronzeamento artificial é provável que seja responsável por grande parte do aumento na incidência de melanoma 6-7. O risco de melanoma parece particularmente ligada com queimaduras 8, especialmente aqueles no início da vida 9-10. Risco de queimadura solar está ligado não só com a dose e a intensidade de exposição à radiação UV, mas também por factores que influenciam a resposta herdadas cutânea à radiação UV. A pigmentação da pele é um dos mais importantes determinantes da sensibilidade UV, risco de queimaduras e risco de câncer. Melanoma ocorre cerca de vinte vezes mais freqüentemente em pessoas de pele clara em relação a individua pele escurals 11-13. A melanina, um pigmento produzido por melanócitos na epiderme, é o principal determinante da tez da pele. Melanina vem em duas variedades principais: (1) eumelanina, um marrom / preta pigmento escuro eficaz em absorver a energia da radiação UV, e (2) feomelanina, um avermelhado / louro pigmento menos eficaz na prevenção da penetração de fótons ultravioleta na pele. A cor da pele, sensibilidade à UV e risco de melanoma são em grande parte determinado pelo conteúdo epidérmico eumelanin 14-15. O mais eumelanina na epiderme, os menos fotões UV pode penetrar na pele. Por causa de baixos níveis inatas de eumelanina, indivíduos de pele clara são muito mais propensos a efeitos agudos e crônicos da radiação UV 16-18. A pigmentação da pele, risco de melanoma e a capacidade de &quot;bronzear&quot; após exposição UV todos correlaciona com a capacidade de sinalização do receptor de melanocortina 1 (Mc1r), um G s acoplados a sete transmembranar sreceptor urface em melanócitos 19-22. Quando se liga Mc1r seu cognato ligando de alta afinidade, a hormona estimulante de melanócitos α-(α-MSH), que é a activação da adenilil-ciclase e a produção do segundo mensageiro AMPc 23. A resposta fisiológica normal da pele após a exposição aos raios UV inclui a produção epidérmica de α-MSH por queratinócitos 24-29. Nós e outros supor que derivado de queratinócito α-MSH liga-se a Mc1r em melanócitos epidérmicos, iniciando a produção a jusante do segundo mensageiro AMPc através de activação de adenililciclase 30. os níveis de cAMP controlar vários aspectos da diferenciação dos melanócitos, incluindo as vias de sobrevivência, reparo do DNA e síntese de pigmentos. Sinalização Mc1r e Camp induzir claramente os níveis de enzimas de pigmentos e produção eumelanin. Quando sinalização Mc1r está intacto e os níveis de cAMP melanocíticos são robustos, eumelanin é produzida ea pele escurece. No entanto, se a sinalização Mc1r está com defeito eos níveis de cAMP citoplasmáticos permanecem baixas, pheomelanin é produzido em vez de 1. Síntese Eumelanin pode ser estimulada farmacologicamente por agentes que aumentam os níveis de AMPc 1,14,31-35. Uma vez que a proteína Mc1r é um grande regulador do risco de melanoma em humanos 36-46, estamos interessados ​​em mecanismos pelos quais Mc1r protege melanócitos contra carcinogênese induzida por UV. Como base para os nossos estudos, geramos um modelo murino Mc1r variante transgênica em um C57BL / 6 genética fundo puro 1. Neste modelo, o factor de células estaminais (SCF) é constitutivamente expressa na epiderme basal e melanócitos epidérmicos interfoliculares são retidos na pele ao longo da vida 47, em contraste com os ratinhos não transgénicos, em que os melanócitos localizar a derme nos folículos do cabelo. Com o transgene K14-SCF incorporada, a epiderme fica pigmentado com a característica particular de pigmentos de melanina do pigmentoestirpe do animal 1. camundongos K14-SCF no fundo C57BL / 6 genética com tipo selvagem sinalização Mc1r ter pele de azeviche caracterizada por níveis muito altos de eumelanina pigmento. Não surpreendentemente, esses animais são altamente resistentes UV-. Em contraste, geneticamente compatíveis K14-SCF animais C57BL / 6 que abrigam um mutante inactivo Mc1r não têm quase nenhuma eumelanina na epiderme. Em vez disso, esses animais &quot;extensão&quot; (Mc1r E / E) têm uma tez da pele justo causada pela deposição de pigmento feomelanina (Figura 1A) e são muito mais sensíveis ao UV 48-49. Compostos farmacológicos com propriedades químicas que permitem a penetração na pele têm sido mostrados para induzir potencialmente eumelanina na extensão (Mc1r E / E) modelo animal K14-SCF por manipulação directa dos níveis de cAMP nos melanócitos epidérmicos da pele. Upregulation melanina neste modelo foi reported através da activação da adenililciclase 1, bem como a inibição da fosfodiesterase 4 35. Neste artigo, vamos demonstrar a preparação e aplicação tópica de forskolin em extensão (Mc1r e / e) animais K14-SCF qual o modelo que o ser humano sensível ao UV de pele clara. Mostra-se que a aplicação duas vezes por dia do medicamento promove melanização acelerado, que o escurecimento da pele é devido à deposição de melanina epidérmica e pigmento melanina epidérmica induzida que protege contra as queimaduras solares induzidas por UV por meio de medição de &quot;dose eritematosa mínima&quot; (MED) de 48.

<table><tbody><tr><td colspan="4">Reagents</td></tr><tr><td>Coleus Forskoli extrato 20%</td><td>Buckton Scott USA Inc.</td><td>n / a</td><td>Princeton, NJ</td></tr><tr><td>Isothesia, Isoflurano, USP</td><td>Butler Schein</td><td>NCD 11695-6776-1</td><td>Dublin, OH, EUA</td></tr><tr><td>Injeção analisada</td><td>por</td><td>xilazina</td> LA04612 <td>Shenandoah, Iowa, EUA</td></tr><tr><td>Cetamina HCl, USP</td><td>Putney</td><td>NDC 26637-411-01</td><td>St. Joseph, MO, EUA</td></tr><tr><td>Ethanol</td><td>Decon Labs.</td><td>2705</td><td></td></tr><tr><td>Propilenoglicol</td><td>Adesco</td><td>05751L</td><td>Solon, OH, EUA</td></tr><tr><td>Creme depilatório, Nair</td><td>Church Dwight</td><td>JF-11 4381322</td><td>Priceton, NJ</td></tr><tr><td colspan="4">EQUIPMENT</td></tr><tr><td>Germical Hg Lamp UV-B</td><td>Westinghouse</td><td>F15T8UV-B</td><td></td></tr><tr><td>Radiômetro Fotômetro</td><td>Luz Internacional</td><td>1LT400A</td><td>Peabody, MA,USA</td></tr><tr><td>Cromatômetro</td><td>Konica Minolta</td><td>CR-400</td><td>Ramsey, NJ, EUA</td></tr><tr><td>Processador de dados para cromômetro CR-400</td><td>Konica Monilta</td><td>DR-400</td><td>Ramsey, NJ, EUA</td></tr></tbody></table>

a indução farmacológica de melanina epidérmica e proteção contra queimaduras solares em um modelo humanizado rato

Pharmacologic Induction of Epidermal Melanin and Protection Against Sunburn in a Humanized Mouse Model

Equidade de pele, a sensibilidade de UV e o risco de cancro da pele em correlação com a função fisiológica do receptor de melanocortina 1, uma proteína de sinalização G s acoplados a encontrada na superfície de melanócitos. Mc1r estimula a adenilil-ciclase e a produção de cAMP, que, por sua vez, se regula a produção melanocítico da melanina na pele. Para estudar os mecanismos pelos quais a sinalização Mc1r protege a pele contra os danos UV, este estudo se baseia em um modelo de rato com &quot;pele humanizado&quot;, baseado na expressão epidérmico do fator de células-tronco (SCF). Camundongos transgênicos K14-SCF reter melanócitos na epiderme e, por conseguinte, ter a capacidade de depósito de melanina na epiderme. Neste modelo animal, de tipo selvagem resulta num estado Mc1r de deposição robusta de pigmento eumelanina preta e um fenótipo UV-protegido. Em contraste, os animais K14-SCF com defeito sinalização Mc1r capacidade apresentam uma pigmentação vermelha / louro, muito pouco eumelanin na pele eum fenótipo sensível aos raios UV. Raciocínio que a deposição de eumelanina pode ser reforçada por agentes tópicos que imitam sinalização Mc1r, descobrimos que a aplicação direta do extrato forskolin na pele de camundongos de pele clara Mc1r-defeituoso resultou na indução eumelanin robusto e proteção UV 1. Aqui nós descrevemos a metodologia de elaboração e aplicação de um extrato de raiz natural, contendo forskolin para K14-SCF camundongos de pele clara e relatar um método para medir a sensibilidade UV determinando a dose eritematosa mínima (DEM). Usando este modelo animal, é possível estudar como indução epidérmica cAMP e melanização da pele afetam respostas fisiológicas à exposição UV.

C57BL / 6 machos foram gerados em fundos eumelanotic, pheomelanotic ou amelanóticos incorporando o transgene K14-SCF como descrito (Figura 1A). Coortes de extensão de pele clara (Mc1r E / E, Tyr + / +) os ratos foram tratados topicamente com duas doses diárias de veículo (etanol a 70%, 30% de propileno glicol) ou 40% de extracto de raiz de Coleus forskohlii bruto (80 uM por a dose), durante 5 dias (Figura 2B). Efeitos dos tratamentos tópicos sobre...

Melanina epidérmica é induzida pela aplicação tópica de forscolina em um modelo murino da humano sensível aos raios UV de pele clara. Manipulação farmacológica de níveis de cAMP na pele e escurecimento da epiderme proteger fortemente contra a inflamação mediada por UV (queimadura solar), como medido pela dose eritematosa mínima (DEM) de ensaio.

A indução farmacológica de melanina epidérmica e proteção contra queimaduras solares em um modelo humanizado Rato

Fairness of skin, UV sensitivity and skin cancer  risk all correlate with the physiologic function of the melanocortin 1  receptor, a Gs-coupled signaling ...

O objetivo geral do experimento a seguir é medir a sensibilidade à radiação UV determinando a dose eritematosa mínima em camundongos de pele clara previamente tratados com quatro peles. Isso é alcançado primeiramente preparando a pele dorsal de camundongos para irradiação por meio de corte e ablação. Em seguida, aplicações tópicas de forskolina são realizadas na pele dorsal.Em seguida, os camundongos são expostos a diferentes doses de irradiação UV para determinar os efeitos do melão mediado por quatro na inflamação induzida por UV. São obtidos resultados que demonstram que a aplicação tópica de forlina aumenta robustamente a pigmentação da pele e que animais com melanina farmacologicamente potencializada são resistentes ao UV, conforme determinado pela DME (dose mínima eritematosa). Esses são estudos de prova de conceito que mostram ser possível induzir farmacologicamente um bronzeamento em um indivíduo incapaz de se bronzear devido a uma mutação em um gene muito importante dos melanócitos, chamado receptor de melanocortina um ou MC1R. Em populações humanas, a perda de função do MC1R correlaciona-se com sensibilidade ao UV, tendência a queimaduras solares e incapacidade de bronzear, além de um risco posterior na vida até quatro vezes maior de melanoma.Escolhemos a esculina como fármaco para esses estudos porque ela é capaz de contornar uma via de sinalização defeituosa do receptor melanocortina e enganar os melanócitos, fazendo-os acreditar que possuem uma via de sinalização mc1R funcional, levando-os, portanto, a produzir grande quantidade de melanina, a qual é depositada na pele e protege os animais contra a radiação UV. Embora saibamos que este método forneça informações sobre a pele que pode e sombria. Pode ser também importante para a prevenção do câncer.Como sabemos que a radiação UV é o principal carcinógeno para a grande maioria dos cânceres de pele e que a melhoria da implementação da proteção da pele previne lesões por UV, um quarto realizando injeções intraperitoneais. Certifique-se de aspirar após a colocação da agulha e antes da injeção do conteúdo para garantir que a agulha não tenha penetrado um vaso sanguíneo, intestinos ou a bexiga urinária. As injeções IP devem ser administradas no lado direito para evitar a estação. Após preparar o extrato de forlinha e anestesiar brevemente o camundongo com isoflurano.Inalação, de acordo com o protocolo descrito, administre anestesia adicional ao animal por injeção IP de cetamina e xilazina. Realize um aperto no dedo da pata para verificar a sedação. Utilize tesouras elétricas equipadas com uma cabeça cirúrgica preparatória de 0,25 milímetros para tosar os pelos da região dorsal.Use um creme depilatório para remover os pelos curtos. Em seguida, para evitar queimaduras ou outros danos à pele, use imediatamente compressas de gaze embebidas em água para limpar suavemente a pele dorsal até que todo o creme tenha sido removido. Use toalhas de papel macias para secar o animal antes de colocá-lo em uma gaiola limpa sobre uma almofada térmica para se recuperar.De modo geral, os camundongos devem ser brevemente anestesiados para facilitar a administração tópica de forskolina ou soluções controle usando isofluorano por inalação sob capela. Comece com uma toalha de papel saturada com isofluorano em um frasco de vidro transparente forrado e saturado com isofluorano. Após fixar um filtro de nylon permeável ao ar adaptado, anestesie o camundongo colocando-o sobre o filtro pelo tempo suficiente para suprimir os movimentos musculares voluntários, mantendo o animal sedado sobre uma almofada de bancada absorvente e limpa.Após realizar uma preensão do dedo, transfira 400 microlitros de extrato bruto de forolina para o dorso do animal, gotejando-o sobre a pele. Em seguida, utilize a lateral da ponta para espalhar o extrato por toda a superfície da pele dorsal exposta. Devolva o camundongo à sua gaiola e observe-o cuidadosamente até que se recupere da anestesia, para prevenir não pigmentação.Os efeitos do AMP cíclico em experimentos confundidos pela sensibilidade ao UV. Descontinue todos os tratamentos tópicos dois dias antes da exposição ao UV para realizar a colorimetria refletiva. Após anestesiar brevemente o camundongo com inalação de isoflurano.Calibre um colorímetro colocando a cabeça portátil sobre a superfície branca padronizada fornecida com o dispositivo. Posicione a cabeça de medição portátil alinhada com a pele dorsal do animal, garantindo que a abertura redonda de um centímetro quadrado esteja completamente pressionada contra a pele. Realize pelo menos três medições separadas em diferentes áreas da pele dorsal.Calcule a média do escore L, mais ou menos o desvio padrão por animal e por grupo de tratamento. Para determinar a dose eritematosa mínima ou DEM, cada animal será exposto a uma variedade de doses de UV. Comece preparando um pedaço de fita oclusiva de UV utilizando um furador resistente com um corte circular de um centímetro quadrado para fazer furos na fita sobre cada orifício.No adesivo, aplique um pequeno pedaço facilmente removível que possa ser destacado. Para exposição à radiação UV, posicione o adesivo na superfície dorsal do camundongo anestesiado.Se os olhos do animal estiverem abertos, aplique lágrimas artificiais para prevenir lesões causadas pela dessecação e exposição à radiação UV. Ligue a fonte de UV, composta por duas lâmpadas UVB com pico de emissão em 313 nanômetros e faixa de 280 a 370 nanômetros. Permite que o cordeiro se equilibre com uma saída constante de UV antes de usar um fotômetro UV com sensor UVB para verificar a saída com base na taxa de transmissão UV medida pelo fotômetro UV; calcule o tempo de exposição à radiação UV para cada dose desejada.Por exemplo, a saída UVB de suas lâmpadas mede 2,4 miliwatts por centímetro quadrado. Portanto, para administrar cinco quilojoules por metro quadrado, a pele precisaria ser exposta a 208 segundos de radiação UVB, conforme calculado aqui. Em seguida, posicione a superfície ventral de um animal sedado voltada para baixo para garantir uma exposição uniforme ao UV e administrar a dose escolhida de radiação sequencialmente.Remova os pequenos pedaços de fita que cobrem os orifícios no momento apropriado. Por exemplo, se 40 quilojoules por metro quadrado for a dose mais alta, o camundongo permanecerá sob a lâmpada por 27 minutos e 47 segundos, e o orifício para essa dose será exposto desde o início. No entanto, para a condição de cinco quilojoules por metro quadrado, a fita será removida com 208 segundos de exposição.Após o tempo restante de exposição à radiação UV, remova cuidadosamente a fita e coloque os animais em um local quente e tranquilo para se recuperarem da anestesia antes de devolvê-los às suas gaiolas. A dose eritematosa mínima, ou valor DEM, corresponde à dose mínima de radiação UV que provoca inflamação definida por eritema e/ou edema em todo o círculo exposto de pele. Observe o camundongo por 24 a 48 horas para identificar áreas discretas de eritema ou edema nas regiões expostas à radiação UV.Às vezes, o resíduo da primeira penugem confunde a interpretação do teste de DME ao mascarar a eritema ou edema cutâneo subjacente; umedecer a pele com etanol 70% torna a pele muito mais interpretável. Documente quaisquer achados cutâneos por meio de fotografias e, em seguida, devolva os camundongos à instalação animal. Nestes experimentos, camundongos C57BL/6 foram gerados em fundos genéticos anódicos ou não anódicos, incorporando o transgene do fator de célula-tronco K14, o que permite que os camundongos retenham melanócitos na epiderme e, como resultado, depositem melanina.No epiderme mostrada aqui, grupos de camundongos com pele clara foram tratados por cinco dias topicamente com doses diárias duas vezes ao dia, seja com veículo ou com 40% do extrato bruto da raiz de colus fors coly. Os efeitos dos tratamentos tópicos na pigmentação epidérmica foram determinados tanto por inspeção visual quanto por imagens de cor refletiva. A aplicação do extrato da raiz foi associada a um acentuado escurecimento epidérmico no contexto transgênico K 14 SCF, mas não em animais geneticamente compatíveis não transgênicos, sugerindo que melanócitos epidérmicos interfoliculares devem estar presentes para que a melanina induzida farmacologicamente seja depositada.No epiderme, embora o extrato da raiz seja profundamente colorido devido à presença de fitoquímicos vegetais além da galina quatro, o escurecimento da pele não pode ser atribuído exclusivamente a um efeito corante da droga. Como animais não transgênicos não apresentam escurecimento da pele com o extrato da raiz, conforme demonstrado aqui quando aplicado topicamente duas vezes ao dia, os efeitos melanogênicos da forskolina foram observados em apenas dois dias. Embora o escurecimento máximo tenha se tornado evidente após alguns dias adicionais, conforme mostrado nesta figura pela coloração de Fontana-Masson e pela coloração de melanina em cortes da pele dorsal.O grau de escurecimento da pele é dependente da dose: animais tratados com quatro aplicações de skin uma vez ao dia durante 15 dias ou duas vezes ao dia durante cinco dias apresentaram quantidades semelhantes de escurecimento cutâneo. Além disso, não houve efeitos tóxicos evidentes decorrentes da exposição a quatro aplicações de skin em nenhum dos grupos tratados. Assim, concluímos que o tratamento acelerado de cinco dias promoveu um escurecimento seguro da pele dorsal tão eficaz quanto o tratamento padrão realizado uma vez ao dia.Esta figura demonstra que, conforme medido pelo teste de DME, a indução de melanina epidérmica por forline resultou em proteção UV significativa, enquanto a DME média em camundongos com extensão K14 SCF tratados duas vezes ao dia durante cinco dias com veículo foi de 5,0 ± 0,0 quilojoules por metro quadrado. A DME média para os grupos tratados com quatro galina tópica foi superior a 30,0 ± 0,0 quilojoules por metro quadrado. Na verdade, uma dose de 30,0 quilojoules por metro quadrado foi insuficiente para gerar eritema. Neste experimento, utilizando a dosagem padrão de Glen, a DME média para camundongos com extensão K14 SCF tratados foi de 50,0 ± 7,1 quilojoules por metro quadrado.Importante, as aplicações tópicas de Kline não afetaram a DME de animais incapazes de produzir melanina, seja por falta de melanócitos epidérmicos mediados por SCF K14, seja por deficiência de tirosinase. Como as aplicações tópicas de Kline foram descontinuadas dois dias antes da exposição à radiação UV e não foram retomadas após essa exposição, concluímos que efeitos não pigmentares de CAMP não desempenharam papel nos resultados da DME. Ao contrário, os dados sugerem que a melanina epidérmica foi o mecanismo pelo qual o forline induziu proteção contra UV neste modelo.Uma vez dominada, esta técnica permite uma avaliação fácil e reprodutível da resposta da pigmentação da pele e da sensibilidade à radiação ultravioleta. Na aplicação em modelos animais, o uso do forland leva apenas alguns minutos por dia, e a maior parte do tempo experimental realmente envolve a radiação UV e os testes de DME. Ao realizar este procedimento, é importante lembrar que a pele retorna gradualmente à sua coloração clara basal por meio farmacológico.A indução da melanina é muito semelhante à resposta de bronzeamento, pois a pele permanecerá escura enquanto estiver sendo estimulada, mas esse bronzeamento desaparecerá da pele nas próximas semanas após a remoção do estímulo.

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Medicine

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Neste vídeo, células de melanoma derivadas de humanos são implantadas por via subcutânea na região do flanco de um camundongo imunocomprometido. O modelo PDX permite a investigação pré-clínica de células de melanoma que melhor recapitulam a heterogeneidade tumoral e a agressividade do melanoma observadas em condições in vivo.

Modelagem de Xenoenxerto Derivado de Paciente: Uma Técnica para Gerar Modelos de Camundongos de Melanoma

Este vídeo descreve o procedimento para induzir a carcinogênese da pele em dois estágios para estudar a iniciação do tumor por aplicação tópica de produtos químicos. Na primeira etapa, um mutagênico, DMBA, é aplicado na pele de um modelo de camundongo que inicia a formação de tumores causando mutações nas células-tronco, seguido pela aplicação de um estimulador de crescimento, TPA, que acelera a formação de papilomas cutâneos.

Modelo de carcinogênese da pele em dois estágios induzido por produtos químicos: um modelo experimental de câncer de pele em camundongos in vivo

Este vídeo descreve um método para medir a sensibilidade aos raios UV em um modelo de camundongo humanizado - um modelo de camundongo que imita a pele humana. Determinamos a dose eritematosa mínima (MED) de radiação UV que pode causar eritema ou edema na pele. O método pode ajudar a descobrir a eficácia dos medicamentos usados para reduzir a sensibilidade aos raios UV.

Ensaio de dose eritematosa mínima: um método para medir a sensibilidade UV em modelos de camundongos

Nós descrevemos três métodos experimentais para avaliar a atividade de hipopigmentação de produtos químicos em vitro: quantificação do conteúdo de atividade e 2) melanina tirosinase 1) celular e 3) medição de melanina por celular melanina mancha e análise de imagem.

Quantificação de hipopigmentação atividade In Vitro

O procedimento a seguir descreve um método para o controle espacial e temporal da iniciação do tumor melanocítico na pele dorsal murina, utilizando um modelo de camundongo geneticamente projetado. Este protocolo descreve macroscópica assim como a iniciação Cutaneous microscópica da melanoma.

Controle espacial e temporal da iniciação de melanoma murino de células-tronco de melanócitos mutantes

A carcinogênese de pele em dois estágios é induzida por dois produtos químicos aplicados topicamente. Um mutagen 7,12-dimetilbenz [a] antracaneno) provoca mutações nas células epidérmicas e uma aplicação contínua do estimulador de crescimento geral 12-O-tetradecanoyl phorbol-13-acetato acelera a formação de papiloma da pele.

Modelo de carcinogênese cutânea induzida por produtos químicos usando dimetilbenz[a]Anthracene e 12-O-Tetradecanoyl Phorbol-13-Acetato (DMBA-TPA)

O objetivo deste protocolo é induzir a produção transitória in vivo de níveis não letais de espécies reativas de oxigênio (EROs) na pele de camundongos, promovendo ainda mais respostas fisiológicas no tecido.

Estimulação de nichos de células-tronco e regeneração tecidual em pele de camundongo por fotogeração dependente de protoporfirina IX comutável de espécies reativas de oxigênio in situ

Aqui, descrevemos um sistema de reprogramação direta otimizado para melanócitos e um sistema de embalagem de vírus concentrado de alta eficiência que garante uma reprogramação direta suave.

Reprogramação Direta de Fibroblastos de Rato em Melanócitos

O protocolo descreve um estudo dos efeitos sistêmicos e locais da exposição ao ultravioleta B na pele em camundongos.

Estudando a exposição crônica de camundongos à radiação ultravioleta B 

O estudo demonstra o papel da pele na modulação das respostas imunes em camundongos por meio da imunização epicutânea (EC). A imunização contra CE com um antígeno proteico pode suprimir as respostas imunes na hipersensibilidade de contato ou reverter a supressão induzida pela pele quando combinada com padrões moleculares associados a patógenos. A imunização contra a CE mostra-se promissora como uma abordagem eficaz e sem agulha para a imunoterapia.

Modelo Murino de Imunomodulação Induzida por Epicutâneo

Um protocolo padronizado para induzir senescência prematura em HNM usando tBHP, protocolos padronizados para análise de marcadores-chave de senescência, incluindo paragem do crescimento, atividade SA-β-galactosidase e fatores SASP.

Um protocolo padronizado para induzir senescência prematura induzida por estresse em melanócitos humanos primários usando hidroperóxido de tert-butila

Aprenda a induzir melanina epidérmica com forskolina em modelo murino para proteção contra radiação UV. Este método demonstra como aumentar a pigmentação cutânea e reduzir danos solares.

A indução farmacológica de melanina epidérmica e proteção contra queimaduras solares em um modelo humanizado Rato

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