Name: Um Ensaio de microplacas para avaliar os efeitos químicos de RBL-2H3 degranulação dos mastócitos: Efeitos do Triclosan, sem utilização de solventes orgânicos (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-11-01T19:45:00.000+00:00
Duration: 17 min 35 s
Description: Aprenda a avaliar os efeitos do triclosan na degranulação de mastócitos RBL-2H3 usando um ensaio de microplacas fluorescente sem solventes orgânicos. Este método permite quantificar a liberação de beta-hexosaminidase.

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LMW e RHK são suportados pela Escola de Pós-Graduação da UMaine de Ciências Biomédicas e Engenharia (GSBSE); RHK também foi apoiado pelo Fundo Maine &amp; Estação Experimental Forest. Financiamento adicional foi fornecido pelo Instituto Nacional de Ciências Médicas Gerais (NIH P20-GM103423), o Agricultural Maine &amp; Estação Experimental Florestal (Grant Número ME08004-10, JAG), a Universidade de Maine ADVANCE Rising Tide Center (NSF Grant # 1008498) e um Research Grant Iniciado em Farmacologia / Toxicologia da PhRMA fundação (JAG). Agradecemos drs. David Holowka e Barbara Baird para o antigénio e células. Somos gratos a Hina Hashmi, Alejandro Velez e Andrew Abovian ajuda com equipamentos e ordens. Este é Maine Agricultural &amp; Estação Experimental Floresta número de publicação 3311.

Em 2004, Naal et ai. Uma desenvolveu um biossensor de mastócitos para o ensaio de elevado rendimento de degranulação. É um ensaio robusto que nós adaptamos para os nossos estudos TCS e detalhado neste vídeo. Antes da Naal et ai. Ensaio 1, a desgranulação dos mastócitos foi avaliada rotineiramente através β-hexosaminidase 59-61, mas estes métodos iniciais utilizados fluorímetros no qual uma amostra foi lido ao mesmo tempo. Importante, Naal et al. concordância directa estabelecido en...

Os mastócitos são altamente granulado células imunes efetoras que servem como mediadores importantes na asma, alergias, parasitas defesa e carcinogênese 13-16. Eles residem em quase todos os tecidos vascularizados 15, onde armazenar com segurança os mediadores inflamatórios e alérgicos em grânulos citoplasmáticos até ser ativado para desgranulam. Degranulação é a exocitose de grânulos à membrana, o que resulta na liberação de mediadores farmacologicamente ativos, tais como a histamina, triptase, leucotrienos e 15. Este processo resulta na iniciação de reacções de hipersensibilidade do tipo I, que são críticas para a montagem de defesa contra parasitas bem como o início de reacções alérgicas, asma, e 15 cancerígenas. Os mastócitos e basófilos, FceRI expressam receptores, os receptores de alta afinidade para a imunoglobulina E (IgE) 17. A exposição a um alergénio ou antigénio provoca a agregação de múltiplos receptores de IgE FceRI ligados 17, e é este so-chamada &quot;reticulação&quot; de receptores Fc de IgE ligadas, que inicia o processo de desgranulação: uma cascata de acontecimentos de fosforilação de tirosina, a activação de fosfolipase C, o efluxo de cálcio das reservas internas, e influxo de cálcio para dentro da célula 18. Este influxo de cálcio é necessária para a desgranulação e, ainda, sinaliza a fusão com a membrana dos grânulos antes de causar a exocitose de grânulos 15. Experimentalmente, um ionóforo de cálcio pode ser utilizada para transporte de cálcio directamente através da membrana da célula 19, o que evita essencialmente todas as etapas de transdução de sinal, antes da etapa 20 do influxo de cálcio, permitindo a identificação de um alvo por via de um tóxico como estando a montante ou a jusante de cálcio de sinalização 20. Degranulação pode ser medido de forma rápida e eficaz, o controlo da libertação de β-hexosaminidase no sobrenadante de células, que é libertada a partir dos grânulos de forma linear juntamente com a histamina 6, mas ié muito mais fácil de detectar utilizando uma reacção enzima-substrato simples e um leitor de microplacas para análise do produto fluorescente. Este ensaio de microplacas, como descrito na secção do protocolo, baseia-se num método robusto originalmente desenvolvida por Naal et ai. 1, que quantifica a clivagem do substrato fluorogénico 4-metilumbeliferil-N-acetil--D-β glucosaminide por β- hexosaminidase. Nós modificamos o ensaio para efeitos de teste de drogas e substâncias tóxicas, com triclosan destaque aqui. Este método quantifica fiável desgranulação, é uma alternativa de baixo custo para, por exemplo, o fluxo de métodos de detecção baseados em citometria de 21, e tem o potencial de se prestar bem para rastreio de alto rendimento de uma grande variedade de fármacos anti-alérgicos, assim como imunotóxicas ou substâncias químicas alergênicas. Este último ponto é particularmente importante, tendo em conta o relatório do Conselho Nacional de Pesquisa 2007 &quot;Ensaios de Toxicidade no Século 21: Uma visão e uma StratEGY &quot;( <a href="http://www.nap.edu/openbook.php?record_id=11970">http://www.nap.edu/openbook.php?record_id=11970</a> ), que preconiza para o desenvolvimento de testes de toxicologia de alto rendimento que utilizam a cultura de células para reduzir a utilização dispendiosa de animais tradicionais, tais como ratinhos de laboratório. O protocolo desenvolvido pela desgranulação Naal et ai. 1, e modificada por nós 2, utiliza a linha de células RBL-2H3, que é um modelo bem aceite homóloga aos mastócitos das mucosas humanas ou basófilos 3-5. (Métodos para a cultura de células RBL-2H3 estão detalhados em Hutchinson et al. 22). Este ensaio poderia provavelmente ser adaptado a qualquer tipo de célula mastro em anexo. Triclosan (TCS) é um antimicrobiano de amplo espectro que tem sido utilizado por mais de 30 anos em hospitais, produtos de cuidados pessoais e de bens de consumo 23,24. O modo de ação para a característica antimicrobiana da TCS é a inibição da biossíntese de ácidos graxos, provavelmente inibindo enoil-acilproteína transportadora reductase 25,26. É encontrado em todo o mundo em uma ampla gama de produtos de consumo, tais como gel de banho, loção para as mãos, creme dental, enxaguatório bucal, e na mão sabonetes em concentrações de até 0,3% ou 10 mM 24. O uso generalizado de TCS resultou em níveis detectáveis ​​em humanos 27-29 e em rios e córregos 30. Um estudo feito pela Allmyr et al. 27 demonstraram que a TCS e seus metabólitos estão presentes tanto no plasma e no leite de mães que amamentam. Importante, a TCS é facilmente absorvido pela pele 31-37. Queckenberg et ai. Encontrado 37 ~ 10% a absorção de um ~ 70 mM TCS creme na pele humana, dentro de 12 horas, resultando em uma concentração significativa na pele, onde residem os mastócitos. SCT foi demonstrado clinicamente para controlar a doença alérgica da pele humana 7-11, mas o mecanismo pelo qual a TCS alivia as doenças alérgicas de pele tem sido desconhecido 38. Usando o ensaio de fluorescência de microplacas detailed neste vídeo, demonstramos recentemente que a TCS, a concentrações tão baixas quanto 2 uM, atenua significativamente a função de mastócitos e desgranulação, proporcionando uma potencial explicação para estes dados clínicos 2. Além de proporcionar uma explicação para estes dados clínicos, os nossos resultados em Palmer et al. 2 sugerem que a TCS de sinalização tem como alvo a jusante das moléculas do influxo de cálcio. Devido à importância da sinalização de cálcio em muitos outros processos imunológicos e biológicos, a TCS poderia ter efeitos adversos sobre uma ampla variedade de processos biológicos necessários. Na verdade, Udoji et al. 39 mostrou que TCS suprime a atividade das células natural killer humano lítico, outra função imune inato importante. Para além do seu potencial como uma ajuda terapêutica na doença alérgica da pele (ou, inversamente, como um immunotoxicant), TCS também pode ser um disruptor endócrino 40-49. Assim, um procedimento claro de como preparar este produto químico em solução is de interesse para os toxicologistas. Porque SCT é uma pequena molécula hidrófoba, os veículos orgânicos são muitas vezes utilizados para torná-lo mais solúvel em água. Na maioria dos estudos de toxicidade em que a TCS foi testado, a preparação envolveu a dissolução em água com o auxílio de um solvente orgânico tal como etanol, acetona, ou óleo 2,50,51. No entanto, muitas vezes esses solventes são biologicamente ativa-se, complicando assim a interpretação da substância em estudo de dados 51. Na verdade, de acordo com Rufli et al. 52 e outros 53, recomenda-se que as soluções de ensaio para ensaios de toxicidade aquática são preparadas utilizando métodos físicos sobre os métodos químicos, devido ao potencial de solventes químicos para criar artefactos de toxicidade. Nós mostramos anteriormente que a TCS dissolvido em 0,24% de etanol / água (v / v) e sonicado por 30 min amortece RBL degranulação dos mastócitos 2. O etanol em concentrações mais elevadas do que 0,24% foi mostrado para amortecer degradação mastócitoscanulação 54,55, exemplos dos efeitos potencialmente de confusão de solventes orgânicos em estudos de toxicidade. Não só é importante ter em conta o efeito de solventes no organismo ou células utilizadas para o estudo, mas também é importante para monitorizar o efeito de um solvente sobre o próprio produto químico de teste. Por exemplo, Skaare et ai. Dissolvendo 51 descobriram que a TCS em polietileno-glicol (normalmente encontrados nos dentífricos e bochechos) atenuou os efeitos anti-bacterianos e anti-placa em mulheres saudáveis ​​do sexo feminino durante a dissolução em óleos provocou uma perda completa de função. Portanto, a capacidade de diferentes solventes para modular tóxico e de drogas, incluindo TCS, efeitos devem ser considerados no desenho do ensaio. A utilização de óleos ou aditivos de sabor pode interferir com os efeitos de TCS em vários produtos 50,51. Num esforço para eliminar a necessidade de utilizar solventes orgânicos, que melhorado para o nosso método de dissolução TCS 2, eliminando o uso de um sol orgânicadesabafar. No presente protocolo, dissolver TCS grânulos diretamente em tampão aquoso com o calor (≤ 50 ° C) e, em seguida, verificar a concentração desse estoque TCS por espectrofotometria de UV-Vis. Estas melhorias são possíveis porque SCT é solúvel em água até 40 uM ( <a href="http://www.epa.gov/oppsrrd1/REDs/2340red.pdf">http://www.epa.gov/oppsrrd1/REDs/2340red.pdf</a> ) e tem sido demonstrado que resistem à degradação quando aquecido a 50 ° C ( <a href="http://oehha.ca.gov/prop65/public_meetings/052909coms/triclosan/ciba3.pdf">http:// / oehha.ca.gov/prop65/public_meetings/052909coms/triclosan/ciba3.pdf</a> ) 56,57. Também tem a vantagem de espectrofotometria de UV-Vis, como TCS também é conhecido por absorvem fortemente a 280 nm, com um 58 coeficiente de extinção molar de 4,200 L / mol / cm 12. Este protocolo oferece uma maneira simples, mas eficaz para dissolver TCS grânulos para um tampão, sem o auxílio de um solvente orgânico, incluindo o baixo custo e rápida verificaçãode concentração e descreve um ensaio de microplaca fluorescente poderoso para monitorar os efeitos químicos sobre a degranulação dos mastócitos.

<table><tbody><tr><td> Células RBL-2H3 </td><td>ATCC</td><<td>p align="center">CRL-2256</td><td> As células que usamos foram um presente, mas também estão disponíveis no ATCC </td></tr><tr><td> Triclosan/Irgasan </td><td>Sigma</td><td>72779 CAS# 3380-34-5</td><td> Deve ser armazenado em ambiente de baixa umidade </td></tr><tr><td> Trypsin </td><td>Gibco</td><td>25300-054 CAS# 3380-34-5</td><td> </td></tr><tr><td> EMEM </td><td>Lonza</td><td>12-611F</td><td> </td></tr><tr><td> Soro Bovino Fetal </td><td>Atlanta Biologicals</td><td>S11150</td><td> </td></tr><tr><td> Sulfato de Gentamicina </td><td>Lonza Biological Sciences</td><td>17-518</td><td> </td></tr><tr><td> Albumina, soro bovino </td><td>Calbiochem</td><td>12659 CAS# 9048-46-8 </td><td> </td></tr><tr><td> Surfact-Amps X-100 (Triton X-100; solução a 10%) </td><td>Pierce</td><td>28314 CAS# 9002-93-1</td><td> </td></tr><tr><td> HEPES </td><td>J.T Baker</td><td>4153-01 CAS# 75277-39-3</td><td> </td></tr><tr><td> Cloreto de magnésio </td><td>VWR</td><<td>p align="center">BDH0244-500G CAS# 7791-18-6</td><td> </td></tr><tr><td> D-(+)-Glucose </td><td>Biomedicals</td><td>152527 CAS# 50-99-7</td><td> </td></tr><tr><td> Cristal de cloreto de potássio </td><td>J.T Baker</td><td>3046-01 CAS# 7447-40-7</td><td> </td></tr><tr><td> Cloreto de cálcio diidato </td><td>Acros Organics</td><td>207780010 CAS# 10035-04-8</td><td> </td></tr><tr><td> Glicina </td><td>Sigma</td><td>G8898 CAS# 56-40-6</td><td> </td></tr><tr><td> 4-Metilumbeliferil-N-acetil-&beta;-D-glucosaminada (4-MU) </td><td>EMD Biosciences</td><td>474502-250MG CAS # 37067-30-4</td><td> Embrulhe em papel alumínio &ndash; é sensível à luz </td></tr><tr><td> Anti-DNP Mouse IgE </td><td>Sigma</td><td>D8406</td><td> O reagente tem concentração de 1 mg/ml. Alíquota 25 &micro; l&nbsp; de reagente em tubos de microcentrífuga separados e parafilme. Armazene alíquotas em -20 &deg; C que não estão sendo usados e armazene a alíquota que está sendo usada em 2-8 > C por no máximo 1 mês. </td></tr><tr><td> DNP-BSA </td><td>Presente do Dr. David Holowka e da Dra. Barbara Baird, Cornell University<</td><td>p align="center"></td><td> Sugira: catálogo DNP-BSA da life technologies# <a href="http://www.invitrogen.com/search/global/miniPDPAction.action?query=A23018">A23018</a> </td></tr><tr><td> Calcium Ionophore A23187 </td><td>Sigma</td><td>C75-22-1mg</td><td> O ionóforo foi feito de um pó adicionando 400 &micro; l&nbsp; de DMSO 100% fresco no frasco de ionóforo e é mantido a -20 &graus; C Nota: usamos o ionóforo após sua data de validade de 3 meses com sucesso </td></tr><tr><td> DMSO </td><td>Sigma</td><td>D2650 CAS# 67-68-5</td><td> </td></tr><tr><td> Ácido acético </td><td>VWR</td><<td>p align="center">BDH3094-2 CAS# 64-19-7</td><td> </td></tr><tr><td> Carbonato de sódio anidro </td><td>Sigma</td><td>222321 CAS# 497-19-8</td><td> </td></tr><tr><td> Cloreto de sódio </td><td>Sigma</td><td>71376 CAS# 7647-14-5</td><td> </td></tr><tr><td> Ácido clorídrico </td><td>VWR</td><td>BDH3026 CAS# 7647-01-0</td><td> </td></tr><tr><td> Buffer de referência, pH 7 </td><td>VWR</td><<td>p align="center">BDH5046</td><td> </td></tr><tr><td> Tampão de referência, pH 10 </td><td>VWR</td><<td>p align="center">BDH5072</td><td> </td></tr><tr><td> Reference Buffer, pH 4 </td><td>VWR</td><<td>p align="center">BDH5018</td><td> </td></tr><tr><td> pH eletrodo solução de armazenamento </td><td>VWR</td><td>14002-828</td><td> </td></tr><tr><td colspan="4">Equipamento:</td></tr><tr><td> Espectrofotómetro DU 7500 </td><td>Beckmann</td><td>Já não vendido</td><td> </td></tr><tr><td> Leitor de placas Synergy 2 Usa o software de coleta e análise de dados de microplacas Gen5 </td><td>BioTek</td><td>Módulo S</td><td> </td></tr><tr><td> Hematocitômetro </td><td>Hausser Scientific</td><td> 3110</td><td> </td></tr><tr><td> 7 x&nbsp; 7 CER HOT/STIR 120 V Combinação de placa quente/placa de agitação magnética </td><td>VWR</td><<td>p align="center">97042-634</td><td> </td></tr><tr><td> Centrifuge </td><td>Eppendorf</td><td>5430</td><td> </td></tr><tr><td> Banho-maria para cultura de tecidos </td><td>VWR</td><<td>p align="center">Model# 89032-206</td><td> </td></tr><tr><td> Armário de segurança biológica para cultura de tecidos SafeGARD (capuz TC) </td><td>The Baker Company</td><td>Model# SG403A-HE</td><td> </td></tr><tr><td> Incubadora de cultura de tecidos </td><td>ThermoScientific</td><td>Model# 3598</td><td> </td></tr><tr><td> Pipetman </td><td>VWR</td><<td>p align="center"></td><td> Range: P2-P1000 </td></tr><tr><td> Balance </td><td>Mettler Toledo</td><td>Model# AG204</td><td> </td></tr><tr><td> medidor de pH </td><td>Symphony/VWR</td><<td>p align="center">Model# SB70P</td><td> </td></tr><tr><td> Pipet-Aid </td><td>Drummond Scientific</td><td>4-000-100</td><td> </td></tr><tr><td> Dispensador Combitip </td><td>Eppendorf</td><td>4981 000.019</td><td> </td></tr><tr><td colspan="4">Recipes:</td></tr><tr><td> Tampão de acetato, pH 4,4 </td><td>Faça ácido acético 0,12 M e titule para pH 4,4 com NaOH 10 N. Isto é 5,3 ml de ácido acético glacial em 1 L de água MilliQ: (1 L)*(0,12 mol/L)*(60 g/mol)*(ml/1,37 g) = 5,3 ml porque a densidade do glacial é de 1,37 g/ml</td><td>Filtro estéril em frasco de vidro autoclavado</td><td></td></tr><tr><td> Substrato (4-MU) </td><td>Sigma M-2133, 250 mg, C18H21NO8, FW 379.4 CAS (37067-30-4) Armazenar em -20&deg; C Estoque: 0,12 M em DMSO (46 mg em 1 ml de DMSO), quente a 37 &deg; C, vórtice, sonicar 10 min. em sonicador em banho-maria com água morna, vórtice novamente</td><td>Para cada experimento, fazer uma nova solução de substrato em tampão acetato (diluição 100x), para concentração final de 1,2 mM em tampão acetato</td><td></td></tr><tr><td> Tampão carbonato de glicina, pH 10 </td><td>26,7 g glicina 47,1 g carbonato de sódio anidro Adicionar água deionizada por 1 L, e ajuste o pH para 10</td><td>Filtro estéril em frasco de vidro autoclavado</td><td></td></tr><tr><td> Tyrodes (2 L), pH 7,4 </td><td>135 mM NaCl: 15,78 g (ou 270 ml de 1 M) 5 mM KCl: 10 ml de estoque 1 M 1,8 mM CaCl2: 7,20 ml de estoque 0,5 M 1 mM MgCl2: 4,00 ml de estoque 0,5 M 5,6 mM de glicose: 2,02 g (11,2 ml de 1 M) 20 mM HEPES: 40 ml de estoque 1 M Usando pH HCl concentrado de ~9,7-7,4</td><td>Filtro estéril em frasco de vidro autoclavado</td><td></td></tr><tr><td> RBL Cell Media </td><td>Descongelar o soro fetal bovino (FBS, armazenado a -20 &deg; C) por cerca de 4 horas em 37 &graus; C banho-maria Siga a técnica estéril padrão Retire 1 L mínimo de meio essencial (MEM) com L-glutamina (com Earle' s sais) Despeje um pouco de MEM para obter 800 ml de MEM, adicione 200 mL de FBS quente Adicione 1 ml de antibiótico sulfato de gentamicina a 1 L de meio com pipeta estéril Use apenas frascos de meio que tenham sido autoclavados e marcados apenas para uso em cultura de células.</td><td>Filtro estéril (0,2 mm) em frasco de vidro autoclavado</td><td></td></tr><tr><td colspan="4">Material plástico usado:</td></tr><tr><td> 200 &micro; l&nbsp; Pontas de pipeta estéreis descartáveis com graduações em 96 rack </td><td>VWR</td><<td>p align="center">53509-009</td><td> polypropylene </td></tr><tr><td> 1.000 &micro; l&nbsp; Pontas de pipeta de aerossol estéreis com HighRecovery </td><td>VWR</td><<td>p align="center">89003-420</td><td> polietileno </td></tr><tr><td> 10 &micro; l&nbsp; micro ponta de baixa ligação estéril </td><td>VWR</td><<td>p align="center">14217-704</td><td> polypropylene </td></tr><tr><td> Tubos de microcentrífuga descartáveis/cónicos para alta força G </td><td>VWR</td><<td>p align="center">20170-038</td><td> polypropylene </td></tr><tr><td> Descartável/graduado/cônico/estéril 50 ml&nbsp; tubos de centrífuga com tampas de rosca </td><td>VWR</td><<td>p align="center">21008-178</td><td> polypropylene </td></tr><tr><td> Descartável/graduado/cónico/estéril 15 ml&nbsp; tubos de centrífuga com tampas de rosca </td><td>VWR</td><<td>p align="center">21008-103</td><td> polypropylene </td></tr><tr><td> CELLSTAR Balão T-25 tratado com cultura de tecidos com tampa de filtro </td><td>Greiner Bio One</td><td>690175</td><td> poliestireno </td></tr><tr><td> CELLSTAR Balão T-75 Tratado com Cultura de Tecidos com Tampa de Filtro </td><td>Greiner Bio One</td><td>658175</td><td> poliestireno </td></tr><tr><td> CELLSTAR 10 ml&nbsp; Pipeta Sorológica Embalada em Papel/Plástico </td><td>Greiner Bio One</td><td>607180</td><td> poliestireno </td></tr><tr><td> CELLSTAR 2 ml&nbsp; Pipeta Sorológica Embalada em Papel/Plástico </td><td>Greiner Bio One</td><td>710180</td><td> poliestireno </td></tr><tr><td> CELLSTAR 5 ml&nbsp; Pipeta Sorológica Envolvida em Papel/Plástico </td><td>Greiner Bio One</td><td>606180</td><td> poliestireno </td></tr><tr><td> CELLSTAR 25 ml&nbsp; Pipeta sorológica embrulhada em papel/plástico </td><td>Greiner Bio One</td><td>760180</td><td> poliestireno </td></tr><tr><td> 1 cm cubetas </td><td>N/A</td><td>N/A</td><td> poliestireno </td></tr><tr><td> CELLSTAR, Microplaca de 96W, Tratamento para Cultura de Tecidos, Preto, com Tampa Placa de 96 poços </td><td>Greiner Bio One</td><td>655086</td><td> poliestireno </td></tr><tr><td> Combitips </td><td>Eppendorf</td><td> 022266501</td><td> Polipropileno/ polietileno </td></tr></tbody></table>

um ensaio de microplacas para avaliar os efeitos químicos de rbl-2h3 degranulação dos mastócitos: efeitos do triclosan, sem utilização de solventes orgânicos

A Microplate Assay to Assess Chemical Effects on RBL-2H3 Mast Cell Degranulation: Effects of Triclosan without Use of an Organic Solvent

Os mastócitos desempenham um papel importante na doença alérgica e de defesa imunológica contra parasitas. Uma vez activado (por exemplo, por um alérgeno), eles desgranulam, um processo que resulta na exocitose de mediadores alérgicos. Modulação da desgranulação dos mastócitos por drogas e substâncias tóxicas podem ter efeitos positivos ou negativos sobre a saúde humana. Função de mastócitos foi dissecada em pormenor com a utilização de mastócitos de leucemia basófilas de rato (RBL-2H3), um modelo amplamente aceito de mastócitos das mucosas humanas 3-5. Componente de mastro de células granulares e o mediador alérgica β-hexosaminidase, que é libertado de forma linear em conjunto com a histamina dos mastócitos 6, pode ser facilmente e confiantemente ser medido por meio de reacção com um substrato f luorogénico, obtendo-se a intensidade de fluorescência mensurável num ensaio de microplacas que é passível de estudos de alto rendimento 1. Originalmente publicado por Naal et al. 1, que se adaptaram este ensaio degranulação para a triagem of drogas e substâncias tóxicas e demonstrar seu uso aqui. Triclosan é um agente antibacteriano de largo espectro, que está presente em muitos produtos de consumo e foi encontrado ser uma ajuda terapêutica na doença alérgica da pele humana 7-11, embora o mecanismo deste efeito é desconhecido. Aqui demonstramos um ensaio para o efeito do triclosan sobre a desgranulação de mastócitos. Mostramos recentemente que triclosan afeta fortemente a função dos mastócitos 2. Em um esforço para evitar a utilização de um solvente orgânico, o triclosan é dissolvida directamente em tampão aquoso com calor e agitação, e a concentração resultante é confirmado por espectrofotometria de UV-Vis (usando ε 280 = 4,200 L / M / cm) 12. Este protocolo tem o potencial para ser usado com uma variedade de produtos químicos para determinar os seus efeitos sobre a desgranulação de mastócitos e, mais genericamente, o seu potencial alérgico.

Quando aquecida a 50 ° C durante 90 min, o espectro de absorção de UV-Vis de SCT produz uma curva forte, suave entre ~ 260 e 300 nm, com pico a 280 nm, como mostrado na Figura 1. Espectrofotometria de UV-Vis, portanto, é uma importante ferramenta que pode ser utilizada para calcular a concentração, uma vez que o coeficiente de absorção molar publicada a 280 nm é de 4.200 L / mol / cm 12. Nós descobrimos que a TCS não cai para fora da solução durante o período de tempo de todo o experimento desgranulação, após aqu...

Degranulação dos mastócitos, a liberação de mediadores alérgicos, é importante para alergia, asma e defesa do parasita. Aqui demonstramos uma técnicas para a avaliação dos efeitos de drogas e de substâncias tóxicas em desgranulação, a metodologia utilizada recentemente para expor o efeito inibidor potente do agente antibacteriano triclosano 2.

Um Ensaio de microplacas para avaliar os efeitos químicos de RBL-2H3 degranulação dos mastócitos: Efeitos do Triclosan, sem utilização de solventes orgânicos

Mast cells play important roles in allergic disease and immune defense against parasites. Once activated (e.g. by an allergen), they degranulate, a ...

O objetivo geral do experimento a seguir é usar um ensaio de microplaca de fluorescência para avaliar os efeitos químicos na degranulação de mastócitos. Neste protocolo, os efeitos inibitórios do agente antimicrobiano triclosan são demonstrados sem o uso de um solvente orgânico. Isso é conseguido primeiro colocando os mastócitos em uma placa de 96 poços para permitir que eles se fixem durante a noite e preparando o triclosan em uma solução aquosa sem o uso de solventes orgânicos por aquecimento.A concentração da solução de Trian é então rapidamente determinada usando espectroscopia ultravioleta visível. Como segunda etapa, as células são estimuladas com antígeno de corte de IgE ou um ionóforo de cálcio na presença ou ausência de trian, o que causará a liberação do marcador de degranulação de mastócitos beta hexosaminidase no sobrenadante. A liberação de beta hexosaminidase no sobrenadante celular é quantificada usando um substrato de beta hexosaminidase cujo produto fluorescente é quantificado em um leitor de microplacas.A fim de medir o efeito do triclosan ou de outros produtos químicos em estudo na degranulação dos mastócitos, obtém-se os resultados. Isso mostra que o triclosan i

a-microplate-assay-to-assess-chemical-effects-on-rbl-2h3-mast-cell

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Imunologia e Infecção

Neste vídeo, descrevemos um método in vitro para avaliar o potencial alérgico de um antígeno para induzir a degranulação de basófilos. A β-hexosaminidase é usada como um índice de liberação de mediadores químicos, e a atividade enzimática da β-hexosaminidase é medida usando um substrato fluorogênico.

Ensaio de Liberação de Enzima Mediadora Humanizada: Um Método Imunoquímico para Rastrear o Potencial Alérgico do Antígeno de Teste Monitorando a Resposta de Degranulação de Basófilos In Vitro

Este vídeo demonstra um ensaio colorimétrico para determinar a atividade de degranulação dos mastócitos. A enzima liberada pelos mastócitos hidrolisa o substrato e produz um produto colorido. A atividade de degranulação dos mastócitos foi medida como a porcentagem de liberação de enzimas fora da célula normalizada com o conteúdo total de enzimas na célula.

Ensaio de degranulação de mastócitos para estudar o efeito de um produto químico alvo

Este vídeo ilustra um ensaio celular envolvendo células de glioblastoma que expressam receptores de quimiocinas CXCR4. O ensaio emprega um corante sensível ao cálcio para medir as mudanças de fluorescência na interação do agente, oferecendo informações sobre a dinâmica da sinalização celular.

Um ensaio celular para a identificação de agentes que interagem com CXCR4

Este vídeo demonstra um ensaio para monitorar a ativação de neutrófilos e a exocitose de grânulos por meio de um ensaio de degranulação. Após a ativação por compostos pró-inflamatórios, os grânulos citoplasmáticos dentro de neutrófilos contendo gelatinase se fundem com a membrana celular, descarregando sua carga. A presença de gelatinase no sobrenadante é avaliada através da hidrólise de um substrato de gelatina conjugado com fluoróforo, confirmando a ativação e degranulação dos neutrófilos.

Um ensaio de degranulação para monitorar a ativação de neutrófilos e a liberação de gelatinase

A investigação da migração precoce de células endoteliais (EEC) é importante para entender a fisiopatologia de certas doenças e potencialmente identificar novas estratégias para intervenção terapêutica. O protocolo a seguir descreve técnicas para avaliar a migração celular que foram adaptadas para a investigação da EEC.

Avaliação da migração de células endoteliais após a exposição a produtos químicos tóxicos

Aqui, apresentamos protocolos para rastrear e caracterizar rapidamente enzimas quanto à atividade antimicrobiana. O ensaio de difusão em microlâminas e o ensaio de liberação de corante utilizam substratos bacterianos alvo para avaliação qualitativa e quantitativa da atividade enzimática.

Qualitativos e quantitativos Os ensaios para a detecção e caracterização de antimicrobianos Proteína

Aqui, apresentamos um protocolo para isolar e cultivar os mastócitos peritoneais murino. Também descrevemos dois protocolos para a sua caracterização funcional: uma imagem fluorescente de enciclopédia Ca2 + concentração intracelular e um ensaio de degranulação baseado na quantificação colorimétrica de β-hexosaminidase a liberado.

Isolamento do peritônio-derivado de mastócitos e sua caracterização funcional com Ca2 +-imagens e ensaios de degranulação

Nós desenvolvemos um ensaio de poliacrilamida-baseado multi bem formato para sondar o efeito da rigidez da matriz extracelular em infecção bacteriana das células aderentes. Este ensaio é compatível com citometria de fluxo, imunocoloração e microscopia de força de tração, permitindo medições quantitativas das interações biomecânicas entre células, matriz extracelular e bactérias patogênicas.

Um ensaio de poliacrilamida-baseado formato multi bem para estudar o efeito da rigidez da matriz extracelular sobre a infecção bacteriana das células aderentes

Aqui apresentamos o ensaio de liberação do mediador, usando uma linha celular de leucemia basofílica de rato transfeminada com o receptor IgE humano, para simular a desgranulação de células efeitos tipicamente observadas em reações alérgicas tipo 1. Este método investiga a atividade biológica dos alérgenos de forma altamente sensível, reprodutível e adaptável.

Ensaio de liberação de mediador humanizado como um read-out para potência alergênico

Aqui, apresentamos um protocolo de ensaio de quimiotaxis melhorado. O objetivo deste protocolo é reduzir as etapas e custos dos métodos tradicionais de quimioterapia bacteriana e servir como um recurso valioso para a compreensão das interações entre plantas e micróbios.

Um ensaio de quimiotaxis melhorado para a identificação rápida de quimioattractants rizobacterianos em Exudates radiculares

Aprenda a avaliar os efeitos do triclosan na degranulação de mastócitos RBL-2H3 usando um ensaio de microplacas fluorescente sem solventes orgânicos. Este método permite quantificar a liberação de beta-hexosaminidase.

Um Ensaio de microplacas para avaliar os efeitos químicos de RBL-2H3 degranulação dos mastócitos: Efeitos do Triclosan, sem utilização de solventes orgânicos (Vídeo) | JoVE Journal

Um Ensaio de microplacas para avaliar os efeitos químicos de RBL-2H3 degranulação dos mastócitos: Efeitos do Triclosan, sem utilização de solventes orgânicos

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