Name: Quantitativo In vitro Ensaio medir a adesão de neutrófilos ativados primárias células humanas endoteliais microvasculares em condições estáticas (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-08-23T12:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 22 s
Description: Aprenda a quantificar a adesão de neutrófilos humanos primários a células endoteliais microvasculares ativadas em condições estáticas usando espectrofluorimetria. Este ensaio auxilia pesquisadores a compreender mecanismos inflamatórios.

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Este trabalho foi apoiado pelo Departamento de Anestesia e Cuidados perioperatórios UCSF.

1. Chapeamento e manutenção das células endoteliais microvasculares <ol><li> Descongelar e crescer suas células endoteliais microvasculares acordo com os fabricantes fornecido instruções. Neste protocolo, as células foram cultivadas em EGM-2 media MV (Lonza), e recomenda-se que todas as experiências são realizadas no prazo de duas semanas de descongelamento para minimizar qualquer variação devido ao número de passagens. As experiências são realizadas com HMVEC-pulmonar entre as passagens 4-9. </li><li> Dia 1: Quando as células atingem 80-90% de confluência, trypsinize e ressuspender em 120 mil células por ml. Placa de 36.000 células (0,3 ml) por poço em 48 poços, placas de cultura de tecidos de poliestireno (es). Incluir poços de HMVEC que não serão incubadas com os neutrófilos a fim de obter uma leitura de fluorescência de fundo. A menos que usando placas de 48 poços projetados especificamente para ensaios de fluorescência, linhas alternadas ou colunas irá minimizar qualquer contaminação luz de poços vizinhos. NOTA: Wells pode ser pré-revestida com poli-Lysine, colagénio ou fibronectina. </li><li> Dia 2: Adicionar novas mídias. </li><li> Dia 3: A microscopia de contraste de fase, confirmar que as células são saudável (isto é, a aparência &quot;Cobblestone&quot; e pouco detritos de células), e eles são 100% confluentes (Figura 1). Se as células não são 100% confluentes, mudar os meios de comunicação a cada dia até que estejam prontos. </li><li> Uma vez que as monocamadas HMVEC está pronto para o tratamento, lave as células uma vez com solução salina equilibrada de Hank (HBSS) e adicionar 0,3 ml de meio EGM-2 MV frescas ou meios contendo agonista inflamatória aos poços apropriados. Neste protocolo HMVEC-pulmão foram tratadas com TNFa [100 ng / ml] (PeproTech, Nova Jersey), durante 3 horas uma vez que este é um activador bem descrito de ECs 21. NOTA: Recomenda-se que o tempo a sua experiência para que suas células HMVEC ativadas (Passo 4.1) e Calcein AM neutrófilos marcados (Passo 3.5) está pronto para usar ao mesmo tempo. Ela nos leva aproximadamente 2,5 horas para isolar e rotular neutrophils. </li></ol> 2. Isolamento de neutrófilos utilizando Polymorphprep <ol><li> Isolar neutrófilos, como descrito anteriormente 22, ou com uma solução de gradiente de densidade pronta para isolar granulócitos polimorfonucleares de sangue total. Empregando Polymorphprep seguindo o protocolo de Nuzzi, et ai. 2,007 resulta em rendimentos de cerca de 2-3 x 10 neutrófilos por seis ml de sangue total 23. NOTA: Para evitar a lise dos eritrócitos e excessivo, uma sedimentação de dextrano para remover os glóbulos vermelhos podem ser efectuadas antes da centrifugação em gradiente de densidade 24. </li><li> Levar a solução do gradiente de densidade Polymorphprep à TA. </li><li> Recolha de 30 ml de sangue total de um voluntário humano saudável, na presença de um anti-coagulante, como a heparina, citrato ou EDTA. O sangue deve ser usado dentro de 2 horas, e mantida entre 18-22 ° C. </li><li> Camada 5 ml de sangue total ao longo de 5 ml da solução de gradiente de densidade num tubo cónico de 15 ml ( <strong&gt; Figura 2A). Evite alterar volumes de sangue ea solução gradiente de densidade, pois isso pode alterar as condições de centrifugação subseqüentes. </li><li> Centrifugar a 450 g durante 30 min a 18-22 ° C. Certifique-se de acelerar lentamente para cima e para baixo da centrífuga (ou seja, desligar o freio centrífuga), e equilibrar os tubos bem para evitar vibrações para ajudar a reduzir a ativação dos neutrófilos e evitar a mistura de camadas. Tempos de centrifugação mais longos ou força centrífuga maior irá resultar na camada inferior de leucócitos, que contém os neutrófilos, que migram mais para baixo em direcção às células vermelhas do sangue peletizadas. </li><li> Aspirar o plasma e leucócitos banda superior contendo PBMC para evitar a contaminação da camada contendo neutrófilos (Figura 2B). </li><li> Usar uma pipeta serológica 1-2 ml para eliminar a camada inferior contendo leucócitos neutrófilos. Combinar as camadas de neutrófilos em 30 ml de PBS (sem Ca 2 + e Mg 2 +), de 50 mltubo cónico. </li><li> Levar o volume até 50 ml com PBS (sem Ca 2 + e Mg 2 +), e centrifugar a 450 xg durante 10 min a 18-22 ° C. </li></ol> Nota: Os passos 2.9 e 2.10 são opcionais, mas altamente recomendado. <ol start="9"><li> Aspirar o sobrenadante. Ressuspender as neutrófilos em 8 ml de água estéril durante 30 segundos para lisar os glóbulos vermelhos, imediatamente adicionar a suspensão de células de 2 ml de 5x em PBS (sem Ca 2 + e Mg 2 +), e misturar suavemente à mão. NÃO incubar células água por mais de 30 segundos desde a morte de neutrófilos significativa pode ocorrer. </li><li> Centrifugar a 250 xg durante 5 min a 18-22 ° C. </li><li> Lave as células uma vez com 10 ml de PBS (sem Ca 2 + e Mg 2 +) e centrifugar novamente a 250 xg durante 5 min a 18-22 ° C. </li><li> Ressuspender as neutrófilos em 10 ml de meio RPMI-1640 (sem vermelho de fenol), e contar as células vivas utilizando o azul de tripanométodo de exclusão de corante e. Evitar períodos prolongados de densidades celulares superiores a 5 x 10 6 por ml uma vez que este pode resultar na activação dos neutrófilos. </li></ol> 3. Neutrófilos Labeling com Calcein AM <ol><li> 6 x 10 5 neutrófilos são utilizados por poço de uma placa de 48 poços. </li><li> Após a contagem, a transferência das células ressuspensas para um tubo de 50 ml e dilui-cónica os neutrófilos a 2-4 x 10 6 culas por ml com vermelho fenol livre de RPMI-1640. </li><li> Adicionar solução de calceína AM de 3 uM (ou seja, 2,98 ul de calceína AM Estoque (1 mg / ml) por ml de meio) e misture bem sacudindo suavemente o tubo. Superior a 5 microns de calceína AM resultará no vazamento dos neutrófilos Nota:. Não-fluorescente calceína AM é clivada no interior das células por esterases endógenas para produzir a molécula altamente fluorescente calceína (isto é, as células mortas não ficam fluorescentes). </li><li> Tapar o tubo com folha de alumínio e incubar fou 30 min a 37 ° C no escuro Nota:. tempos de incubação mais longo pode resultar em mais calceína ser libertado a partir dos neutrófilos ao longo do ensaio de adesão. </li><li> Centrifugar a 450 xg durante 5 min a 18-22 ° C, e lavar os neutrófilos 2x com 10 ml de RPMI-1640 (sem vermelho de fenol; pré-aquecido a 37 ° C). Após a ressuspensão das células para a segunda lavagem, passar primeiro os neutrófilos com um filtro estéril de 40 uM para remover aglomerados, e depois centrifugar mais uma vez a 450 xg durante 5 min a 18-22 ° C. </li><li> Ressuspender as neutrófilos em meio RPMI 1640 (sem vermelho de fenol; pré-aquecido a 37 ° C) a 2 x 10 6 por ml neutrófilos. </li></ol> 4. Ensaio de ligação de neutrófilos <ol><li> Lavar as monocamadas HMVEC 3x com 0,5 ml de filtro esterilizado (0,22 um) meio RPMI 1640 (sem vermelho de fenol), contendo 3% de BSA por poço. </li><li> Aspirar a mídia e adicione 6 x 10 5 neutrófilos calceína-rotulados (0,3 ml de células suspension), ou 0,3 ml de meio RPMI 1640 (sem vermelho de fenol) sem neutrófilos, aos poços apropriados da placa de 48 poços Nota:. Isto é o equivalente de 8 x 10 5 por cm 2 de neutrófilos. </li><li> Incubar durante 20 min no banho a 37 ° C, 5% CO 2 incubadora. </li><li> Fluorescência de neutrófilos totais (pré-lavagem) a medição da intensidade de fluorescência de cada poço com um comprimento de onda de excitação de 485 nm e um comprimento de onda de emissão de 520 nm (conjunto de filtros de fluoresceína) num Fluostar, ou equivalente, com um espectrofotómetro. Executar esta etapa pouco antes do ponto final de incubação Nota: Neste protocolo, calceína excitação e a detecção da luz emitida foram realizadas a partir do topo dos poços a descoberto, no entanto, ambos também pode ser realizada a partir do fundo dos poços.. </li><li> Lavar os poços contendo monocamadas HMVEC e neutrófilos 5x com 0,5 ml por poço de PBS (w / Ca 2 + e Mg 2 +). Remova a mídia e lavagensinvertendo a placa e batendo suavemente sobre toalhas de papel para retirar o líquido restante. </li><li> Adicionar 0,3 ml de volta de RPMI 1640 (sem vermelho de fenol) por poço. </li><li> Aderente a fluorescência de Neutrófilos (lavagem POST): medir a intensidade de fluorescência de cada poço como na etapa 4.4. </li><li> Determinar a aderência e a adesão relativa cento por poço: </li></ol> Nota: Nesta fase, as imagens dos neutrófilos marcados com calceína podem ser obtidas usando um microscópio de fluorescência equipado com capazes filtros de fluoresceína padrão. As imagens na Figura 4 foram obtidas em um microscópio invertido Olympus IX51 equipado com uma câmera 2000R Retiga (Q Imaging) utilizando Q-Captura software Pro7 (Q Imaging).

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<li>Ait-Oufella, H., Maury, E., Lehoux, S., Guidet, B., Offenstadt, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+endothelium%3A+physiological+functions+and+role+in+microcirculatory+failure+during+severe+sepsis%5BTitle%5D)+AND+%22Intensive+Care+Medicine%22%5BJournal%5D)">The endothelium: physiological functions and role in microcirculatory failure during severe sepsis.</a> Intensive Care Medicine. 36, 1286-1298 (2010).</li>
<li>Andonegui, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Endothelium-derived+Toll-like+receptor-4+is+the+key+molecule+in+LPS-induced+neutrophil+sequestration+into+lungs%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Clinical+Investigation%22%5BJournal%5D)">Endothelium-derived Toll-like receptor-4 is the key molecule in LPS-induced neutrophil sequestration into lungs.</a> The Journal of Clinical Investigation. 111, 1011-1020 (2003).</li>
<li>Sharma, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lung+endothelial+cell+platelet-activating+factor+production+and+inflammatory+cell+adherence+are+increased+in+response+to+cigarette+smoke+component+exposure%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Physiology.+Lung+Cellular+and+Molecular+Physiology%22%5BJournal%5D)">Lung endothelial cell platelet-activating factor production and inflammatory cell adherence are increased in response to cigarette smoke component exposure.</a> American Journal of Physiology. Lung Cellular and Molecular Physiology. 302, L47-L55 (2012).</li>
<li>Deban, L., Correale, C., Vetrano, S., Malesci, A., Danese, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multiple+pathogenic+roles+of+microvasculature+in+inflammatory+bowel+disease%3A+a+Jack+of+all+trades%5BTitle%5D)+AND+%22The+American+Journal+of+Pathology%22%5BJournal%5D)">Multiple pathogenic roles of microvasculature in inflammatory bowel disease: a Jack of all trades.</a> The American Journal of Pathology. 172, 1457-1466 (2008).</li>
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</ol>

Os autores não têm nada a revelar.

Os passos mais críticos para uma bem-sucedida de neutrófilos / ensaio de adesão da célula endotelial microvascular são: 1) O uso do baixo número passagem (&lt;9), células endoteliais saudáveis; 2) Manter os neutrófilos isolados com uma densidade baixa (ou seja, &lt;5 x 10 6 células / ml) e usá-los dentro de duas horas de isolamento, e 3) lavagem Fastidious dos neutrófilos calceína AM-rotulados e uso dos neutrófilos calceína AM-rotulados em tempo hábil para minimizar a contaminação CE e perda de calce...

Desde o endotélio vascular está em contato direto com o sangue circulante, que tem uma localização única para iniciar uma resposta inflamatória rápida durante a infecção ou lesão. As células endoteliais (ECs) de receptores de reconhecimento de padrões express que reconhecem uma variedade de componentes bacterianos conservadas e as moléculas de perigo, e receptores de mediadores inflamatórios hospedeiras, tais como o TNFa. A activação destes receptores induz a ECs para secretar citocinas (por exemplo, IL-6, IL-8, CXCL1 e CCL2), e para sobrerregular moléculas de adesão (por exemplo, E / P-selectina, VCAM-1 e ICAM-1) na sua superfície celular uma , 2. Estas moléculas de todos facilitar a localização de leucócitos aos locais de infecção e lesão a fim de limpar o exército dos agentes infecciosos e iniciar a reparação tecidual 3,4. A resposta de neutrófilos para a infecção envolve uma interação bem coordenada entre o endotélio vascular ea resposta neutrófilos. Após a ativação CE, IL-8 é segregada e que forma um gradiente intravascular sobre o endotélio, que permite que a casa de neutrófilos para o local da infecção ou lesão 5,6. E / P-selectinas mediata captura de neutrófilos e de rolamento através de associações relativamente fracos com glycomolecules na superfície celular de neutrófilos. Estas interacções, juntamente com a ligação de IL-8 aos seus receptores cognatos, facilitar a robusta ligação integrina-mediada e eventual detenção dos neutrófilos sobre a superfície de células endoteliais 7-10. Depois da prisão, os neutrófilos podem migrar para fora da vasculatura para os locais específicos de infecção para eliminar os patógenos directamente, gerar armadilhas extracelulares de neutrófilos para prevenir a disseminação de agentes patogénicos, e promover a cicatrização de feridas libertam factores adicionais que recrutam leucócitos, tais como monócitos, macrófagos e dendríticas células 11-17. Descritos neste relatório é um método in vitro para quantificar a adesão de neutrófilos para microVascular CEs após a ativação por parte do anfitrião mediador inflamatório TNF. Este ensaio foi concebido para avaliar a ativação de células endoteliais, e não neutrófilos. Neutrófilos humanos primários são primeiro isolados utilizando separação em gradiente de densidade, e depois são marcados com calceína acetoximetilo (AM). Esterases de células vivas no interior da hidrólise calceína AM de calceína a molécula altamente fluorescente com uma excitação de 492-495 nm e emissão de 513-516 nm, 18. Os neutrófilos marcados com fluorescência são então incubadas com monocamadas de EC, e os neutrófilos não aderentes são subsequentemente removidos. A fluorescência das restantes, neutrófilos ligados é então medido usando um espectrofotómetro de fluorescência, e calculada como uma percentagem de neutrófilos de entrada fluorescência total por poço. Este método tem a vantagem adicional de que os neutrófilos ligados marcados com calceína utilizados em espectrofotometria pode ser directamente visualizada utilizando microscopia de fluorescência para dar uma leitura mais qualitativa de ac CEvação. Uma vez que este ensaio é realizado em condições estáticas, apenas os eventos muito iniciais que ocorrem na cascata de adesão dos neutrófilos serão avaliados. Isto é confirmado no presente relatório usando anticorpos bloqueadores de E-selectina para mostrar que a adesão de neutrófilos a TNFa humano tratado com pulmão microvascular CE (HMVEC-pulmão) monocamadas é drasticamente reduzida quando a interacção com a E-selectina é interrompido. Além de TNFa, temos utilizado com sucesso este ensaio para determinar a extensão da activação CE veia umbilical humana (HUVEC) pelo receptor Toll-like 1/2 agonistas lipoproteína associada a peptidoglicano (PAL), mureína lipoproteína (MLP) e e Pam3Cys ativação HMVEC-Lung por Pam3Cys 19,20. Além disso, foram utilizados com êxito este ensaio com os inibidores da quinase e depois knockdown RNAi mediada de superfície e proteínas citoplasmáticas em HMVEC-pulmonar, sugerindo que esta metodologia é compatível com uma variedade de bioquímica e screening ensaios 20. Em resumo, este ensaio proporciona um fácil de usar, forma reprodutível, mais funcional para aceder ao grau de activação CE por mediadores inflamatórios in vitro.

<table><tbody><tr><td>HMVEC-Lung</td><td>Lonza</td><td>CC-2527</td><td></td></tr><tr><td>EGM-2 MV</td><td>Lonza</td><td>CC-3202</td><td></td></tr><tr><td>HBSS</td><td>Life Technologies</td><td>14175-095</td><td>Pode ser substituído por qualquer fornecedor</td></tr><tr><td>Placas de cultura de tecidos de 48 poços</td><td>BD Falcon</td><td>353078</td><td></td></tr><tr><td>PBS (sem vermelho de fenol)</td> <td>Instalação de cultura de células UCSF</td><td>CCFAL001</td><td>Pode ser substituído por qualquer fornecedor</td></tr><tr><td>D-PBS (sem Ca2+ e Mg2+ e vermelho de fenol)</td><td>Instalação de Cultura de Células UCSF</td><td>CCFAL003</td><td>Pode ser substituído por qualquer fornecedor</td></tr><tr><td>RPMI-1640 (sem vermelho de fenol)</td><td>Life Technologies</td><td>11835-030</td><td></td></tr><tr><td>Polymorphprep</td><td>Axis-Shield</td><td>1114683</td><td></td></tr><tr><td>calceína AM</td><td>Life Technologies</td><td>C3099</td><td>(0,995 mM) estoque soln</td></tr><tr><td>Trypan Blue Solution</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T8154</td><td></td></tr><tr><td>40 &mu; Filtros M</td><td>VWR</td><td>21008-949</td><td>Pode ser substituído por qualquer fornecedor</td></tr><tr><td>Espectrofotómetro FLUOstar OPTIMA BMG</td><td>LABTECH-</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

quantitativo<em&gt; in vitro</em&gt; ensaio medir a adesão de neutrófilos ativados primárias células humanas endoteliais microvasculares em condições estáticas

Quantitative In vitro Assay to Measure Neutrophil Adhesion to Activated Primary Human Microvascular Endothelial Cells under Static Conditions

O endotélio vascular desempenha um papel fundamental na resposta inflamatória. Durante a fase aguda da inflamação, as células endoteliais (ECs) são activados por mediadores hospedeiras ou directamente por componentes microbianos conservados ou moléculas derivadas do hospedeiro de perigo. Activo CEs citocinas, quimiocinas e express de moléculas de adesão que mobilizam, activar e manter leucócitos no local da lesão ou infecção. Os neutrófilos são os primeiros a chegar leucócitos, e aderem ao endotélio através de uma variedade de moléculas de adesão presentes na superfície de ambas as células. As principais funções dos neutrófilos são para eliminar directamente as ameaças microbianas, promover o recrutamento de outros leucócitos através da liberação de fatores adicionais, e iniciar o reparo de feridas. Portanto, o recrutamento e fixação ao endotélio vascular é um passo crítico na iniciação da resposta inflamatória. Neste relatório, nós descrevemos um ensaio de adesão in vitro de neutrófilos utilizandocalceína AM marcada com neutrófilos humanos primários para quantificar a extensão da activação da célula endotelial microvascular sob condições estáticas. Este método tem a vantagem adicional de que as mesmas amostras quantificada por espectrometria de fluorescência também pode ser visualizada directamente através de microscopia de fluorescência para uma avaliação mais qualitativa da ligação de neutrófilos.

A fim de obter resultados fiáveis ​​e reprodutíveis usando um ensaio de ligação de neutrófilos, é essencial que a saúde e a confluência das células endoteliais microvasculares são óptimas no dia do ensaio, como se ilustra com HMVEC-pulmão na Figura 1. Além disso, é imperativo que o número baixo passagem microvascular ECs são utilizados (ou seja, menos de 9 passagens) e, consequentemente, recomendamos realizar todos os experimentos dentro de duas semanas de descongelamento. A saúde dos neutrófil...

A aderência de neutrófilos ao endotélio activado em locais de infecção é um componente integral da resposta inflamatória do hospedeiro. Descritos neste relatório é um ensaio de ligação de neutrófilos, que permite a<em&gt; In vitro</em&gt; Quantificação de neutrófilo humano primário de ligação às células endoteliais activadas por mediadores inflamatórios, sob condições estáticas.

Quantitativo<em&gt; In vitro</em&gt; Ensaio medir a adesão de neutrófilos ativados primárias células humanas endoteliais microvasculares em condições estáticas

The vascular  endothelium plays an integral part in the inflammatory response. During the  acute phase of inflammation, endothelial cells (ECs) are ...

O objetivo geral deste procedimento é determinar o grau de ativação inflamatória de células endoteliais microvasculares por meio da quantificação do número relativo de neutrófilos que aderem às células endoteliais in vitro sob condições estáticas. Isso é realizado primeiramente tratando monocamadas saudáveis e confluentes de células endoteliais microvasculares com o estímulo experimental desejado durante o segundo passo. Neutrófilos de voluntários humanos saudáveis são isolados e então marcados com cálcio am.Em seguida, os neutrófilos marcados são adicionados às células endoteliais e deixados aderirem por 20 minutos, período durante o qual é obtida uma medição pré-lavagem por espectrofluorometria. Na etapa final, os neutrófilos não aderidos são removidos por lavagem, após a qual é obtida uma medição pós-lavagem. Por fim, pode-se determinar a porcentagem e a aderência relativa dos neutrófilos marcados com cálcio aos monocamadas de células endoteliais sob cada condição de tratamento.Este método pode ajudar a responder perguntas fundamentais na área da biologia inflamatória humana, pois permite determinar o grau relativo de ativação inflamatória endotelial microvascular sob diferentes condições. Além disso, este ensaio tem potencial para ser utilizado como uma ferramenta no estudo de processos de doenças humanas baseados em endotélio que envolvem a ligação de leucócitos ao endotélio microvascular. No dia do ensaio, utilize microscopia de contraste de fase para confirmar que as células apresentam uma aparência saudável em "ladrilho", com poucos detritos celulares e que estão 100% confluentes.Uma vez que as monocamadas de HM VEC estejam prontas para o tratamento, lave as células uma vez com HBSS e, em seguida, adicione 0,3 mililitros de meio fresco de crescimento de células endoteliais microvasculares, com ou sem um agonista inflamatório, aos poços apropriados. Aqui, as HM VEC pulmonares estão sendo tratadas com TNF alfa por três horas para isolamento de neutrófilos. Usando primeiro o Polymorph prep, aqueça a solução de gradiente de densidade até a temperatura ambiente. Em seguida, após coletar 30 mililitros de sangue total de um voluntário humano saudável na presença de um anticoagulante, sobreponha cinco mililitros do sangue sobre cinco mililitros do Polymorph prep em um tubo cônico de 15 mililitros.Se pare o sangue integral por 30 minutos a 450 vezes G e 18 a 22 graus Celsius com a frenagem ativada, garantindo que os tubos estejam bem balanceados. Em seguida, aspire as camadas amarela, contendo plasma e PBMC, para evitar contaminação pela camada opaca e rosa de neutrófilos. Para remover os neutrófilos, aspire a camada de neutrófilos com uma pipeta serológica de um a dois mililitros, girando lentamente a pipeta e o tubo.Retire os neutrófilos de vários tubos para um tubo cônico de 50 mililitros contendo 30 mililitros de PBS sem cálcio e sem magnésio. Complete o volume até 50 mililitros com mais PBS sem cálcio e sem magnésio. Após centrifugar as células, aspire o sobrenadante e, em seguida, ressuspenda.Suspenda os neutrófilos em oito mililitros de água estéril para lisar as hemácias após 30 segundos. Adicione rapidamente os oito mililitros de suspensão celular a dois mililitros de PBS sem cálcio e magnésio 5x, seguido de mistura suave. Após centrifugar as células, lave-as novamente uma vez em PBS sem cálcio e magnésio, depois reuspenda o pellet em 10 mililitros de RPMI 1640 sem vermelho de fenol e conte as células viáveis pelo método de exclusão com azul de tripano.Após a contagem, transfira as células re-suspensas para um tubo cônico de 50 mililitros e dilua os neutrófilos com dois a quatro milhões de células por mililitro em RPMI 1640 sem vermelho de fenol. Em seguida, adicione a solução trabalho de cálcio recém-preparada até uma concentração de três micromolar às células. Misture a suspensão celular invertendo suavemente o tubo várias vezes e, então, incube o tubo coberto com papel alumínio a 37 graus Celsius.Após 30 minutos, centrifugue os neutrófilos marcados e lave o pellet duas vezes em 10 mililitros de RPMI 1640 sem vermelho de fenol a 37 graus Celsius, passando a suspensão celular por um filtro estéril de 40 mícrons para remover quaisquer agregados antes da segunda centrifugação. Reuspenda os neutrófilos em 10 mililitros de RPMI 1640 sem vermelho de fenol a 37 graus Celsius.RP MI 1640 sem vermelho de fenol. Em seguida, após contar as células mais uma vez, dilua-as para 2 milhões de células por mililitro. Agora lave as monocamadas de HM vec três vezes com 0,5 mililitros de RP MI 1640 sem vermelho de fenol, filtrado em filtro de 0,22 mícrons e esterilizado, contendo 3% de BSA por poço; após a terceira lavagem, aspire o meio e adicione 600.000 neutrófilos marcados com cálcio em 0,3 mililitros de suspensão celular, ou 0,3 mililitros de RP MI 1640 sem vermelho de fenol sem neutrófilos, aos poços apropriados da placa de 48 poços. Incube então os cultivos em co-cultura por 20 minutos a 37 graus Celsius com 5% de dióxido de carbono e, logo antes do fim do período de incubação, meça a intensidade de fluorescência de cada poço em um espectrofotômetro com comprimento de onda de excitação de 485 nanômetros e comprimento de onda de emissão de 520 nanômetros.Em seguida, inverta a placa para remover o meio e tampone suavemente em papel toalha para eliminar qualquer líquido remanescente. Lave os poços contendo as monocamadas de hm ve e neutrófilos cinco vezes com 0,5 mililitros por poço de PBS com cálcio e magnésio. Remova o PBS da mesma maneira a cada vez.Renove os poços com 0,3 mililitros de RPMI 1640 sem vermelho de fenol por poço e, em seguida, meça a intensidade de fluorescência de cada poço conforme acabou de ser demonstrado. Por fim, utilizando estas fórmulas, determine a porcentagem de aderência e a aderência relativa por poço para obter resultados confiáveis e reprodutíveis. Ao utilizar um ensaio de ligação de neutrófilos, é essencial que a saúde e a confluência das células endoteliais microvasculares sejam ideais no dia do ensaio. Observe a aparência de pavimento e a confluência total das monocamadas em um espectrofotômetro Fluor star Optima.Por exemplo, observe que a densidade óptica de fluorescência a 520 nanômetros está dentro da faixa linear quando são analisados de 10.000 a 1 milhão de neutrófilos marcados. Curiosamente, à medida que mais neutrófilos são adicionados a monocamadas de células endoteliais pulmonares tratadas com um agonista inflamatório, o percentual de aderência aumenta. A quinase p38 MAP foi previamente demonstrada como necessária para a expressão de E-selectina.Em células endoteliais humanas tratadas com TNF alfa e sua inibição reduz o número de neutrófilos aderentes para demonstrar que a quantidade de neutrófilos adicionada aos poços é arbitrária, desde que o número de células utilizadas esteja dentro da faixa linear do espectrofotômetro. Aqui é apresentado um ensaio de adesão de neutrófilos com células pulmonares HMVECs tratadas com TNF alfa na ausência ou presença do inibidor da quinase p38 MAPK BIRB 796. Esses resultados mostram que a diminuição relativa na ligação de neutrófilos após inibição da p38 MAPK é semelhante.Independentemente do número de neutrófilos por poço, a lectina é expressa na superfície das células endoteliais após o tratamento com TNF alfa e captura neutrófilos da vasculatura por meio de interações eletrostáticas com glicomoléculas presentes na superfície dos neutrófilos. Como mostrado neste gráfico, a pré-incubação das células endoteliais ativadas com TNF alfa com um anticorpo contra E-selectina resulta em uma redução de cerca de 75% na sua capacidade de ligar neutrófilos. Demonstrando que este ensaio avalia principalmente os eventos iniciais da cascata de adesão de neutrófilos, nestas imagens, neutrófilos marcados com cálcio ligam-se a monocamadas de HMVEC pulmonares não tratadas e tratadas com TNF alfa, pré-incubadas com IgG controle ou com E-selectina.Anticorpos policlonais são mostrados em imagens de microscopia de luz translúcida nesta coluna, enquanto imagens de fluorescência do mesmo campo de referência, utilizando um conjunto de filtros para fluoresceína, estão nestas poças. Imagens representativas da fluorescência total de neutrófilos antes da lavagem com PBS, conforme acabou de ser demonstrado, são mostradas nestas poças. Imagens representativas da fluorescência de neutrófilos aderidos após a lavagem com PBS, conforme acabou de ser demonstrado, são apresentadas.Observe o aumento da aderência após o tratamento com FFA de TN que é reduzido na presença de anticorpo policlonal contra s-selectina. Ao realizar este procedimento, é importante utilizar células endoteliais saudáveis com baixo número de passagens e usar o sangue total e neutrófilos isolados dentro de duas horas após a coleta.

quantitative-vitro-assay-to-measure-neutrophil-adhesion-to-activated

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Imunologia e Infecção

Um ensaio de freqüência de adesão para medir cinética de interação receptor-ligante, quando ambas as moléculas estão ancoradas nas superfícies das células que interagem é descrito. Este ensaio mecanicamente baseado é exemplificado usando uma micropipeta pressurizado glóbulo vermelho humano como sensor de adesão e integrinas αLβ2 e molécula-1 de adesão intercelular como interagindo receptores e ligantes.

Ensaio de aderência de freqüência para In Situ Análise Cinética de Cross-juncional interações moleculares na interface célula-célula

Este artigo primeiro descreve um procedimento para isolar células endoteliais humanas a partir de veias umbilicais e, em seguida, mostra como usar estas células para examinar transmigração de neutrófilos em condições de escoamento. Ao utilizar uma câmara de fluxo de baixo volume feita a partir de um polímero com as características ópticas do vidro, ao vivo de células imagem fluorescente de populações de células raras é também possível.

Isolamento de Células endoteliais da veia umbilical humana e sua utilização no estudo de transmigração de Neutrófilos sob condições de fluxo

Source: Claes, J., et al, In Vitro and In Vivo Model to Study Bacterial Adhesion to the Vessel Wall Under Flow Conditions. J. Vis. Exp. (2015).This video demonstrates a method for studying host-pathogen interactions using a micro-parallel plate flow chamber seeded with human primary endothelial cells. Following endothelial cell activation by an ionophore and perfusion with fluorescently labeled bacteria, the cells release von Willebrand factor (VWF), which binds bacterial adhesins under shear...

Micro-Parallel Plate Flow Chamber Model for Studying Bacterial Adhesion to Human Endothelial Cells

Neste vídeo, demonstramos um ensaio utilizando microscopia de fluorescência para detectar a adesão de células cancerígenas a armadilhas extracelulares de neutrófilos (NETs). Nos poços de teste, há um aumento notável no número de células cancerígenas marcadas com fluorescência que aderem aos TNEs, enquanto os poços tratados com DNase exibem adesão reduzida de células cancerígenas aos TNEs.

Ensaio de adesão in vitro para detectar a adesão de células cancerígenas a armadilhas extracelulares de neutrófilos

A migração trans-epitelial de neutrófilos em resposta à infecção bacteriana mucosa contribui para lesão epitelial e doença clínica. Foi desenvolvido um modelo in vitro que combina patógenos, neutrófilos humanos e camadas de células epiteliais humanas polarizadas cultivadas em filtros transwell para facilitar investigações para desvendar os mecanismos moleculares que orquestram esse fenômeno.

In vitro Ensaio de cocultura para avaliar migração trans epitelial de neutrófilo induzida por patógenos

Um método de quantificação da aderência de neutrófilos é relatado. Este método cria um ambiente dinâmico de fluxo semelhante ao encontrado em um vaso sanguíneo. Ele permite a investigação de adesão de neutrófilos, quer moléculas de adesão purificadas (ligando) ou substrato de células endoteliais (HUVEC) num contexto semelhante ao ambiente in vivo com tensão de cisalhamento.

Fluxo de Neutrófilos Humanos Secção Ensaio de Adesão

Os leucócitos atravessam a monocamada endotelial utilizando o paracelular ou o percurso intracelular. Foi desenvolvido um ensaio simples para seguir a distribuição de juncional endógeno VE-caderina e PECAM-1 durante a migração transendotelial de leucócitos sob fluxo fisiológico para discriminar entre as duas vias de transmigração.

Imagens em tempo real de endoteliais junções célula-célula durante Neutrophil Transmigração Sob Fisiológica Fluxo

Relatamos um método in vitro que permite a quantificação do número real de células adesivas dentro de uma monocamada de células endoteliais.

A quantificação da Adesividade celular endotelial<em&gt; In Vitro</em

Endotélio vascular controla firmemente o recrutamento de leucócitos. Extravasamento de leucócitos inadequado contribui para doenças inflamatórias humanas. Portanto, à procura de novos elementos reguladores de ativação endotelial é necessária projetar terapias melhoradas para desordens inflamatórias. Aqui, descrevemos uma metodologia abrangente para caracterizar o romance reguladores endoteliais que podem modificar leucócitos tráfico durante a inflamação.

Ensaios de caracterização de romance endoteliais reguladores envolvidos na resposta inflamatória de triagem

Leucócitos, avidamente, interagir com células vasculares e plaquetas após lesão de parede do vaso ou durante a inflamação. Aqui, descrevemos um simples ensaio baseado em fluxo laminar para caracterizar os mecanismos moleculares que fundamentam as interações entre os leucócitos e os seus parceiros de celulares.

Ensaios baseados em fluxo laminar para investigar o recrutamento de leucócitos em culturas de células vasculares e plaquetas aderentes

Adesão dinâmica de células imunes a parede do vaso é um pré-requisito para hospedagens de intestino. Aqui, apresentamos um protocolo para um ensaio funcional em vitro para a análise de impacto de anticorpos anti-integrina, quimiocinas ou outros fatores sobre a adesão da dinâmica celular de células humanas usando capilares morada-revestido.

Ensaio de adesão dinâmico para a análise funcional das terapias antiaderência na doença inflamatória intestinal

Aprenda a quantificar a adesão de neutrófilos humanos primários a células endoteliais microvasculares ativadas em condições estáticas usando espectrofluorimetria. Este ensaio auxilia pesquisadores a compreender mecanismos inflamatórios.

Quantitativo In vitro Ensaio medir a adesão de neutrófilos ativados primárias células humanas endoteliais microvasculares em condições estáticas (Vídeo) | JoVE Journal

Quantitativo

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