Name: Microfabricação de Padrões de Ouro Nanoporosos para celular-primas estudos de interacção (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-07-15T12:00:00.000+00:00
Duration: 13 min 2 s
Description: Aprenda a microfabricar padrões de ouro nanoporosos usando estampagem com stencil e fotolitografia para estudos de interação celular. Este método permite cultivar células e quantificar suas interações com o material por microscopia.

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O. Kurtulus e D. Dimlioglu são suportados por um laboratório taxas Research Award Programa Universidade da Califórnia 12-LR-237197. P. Daggumati é apoiado por uma Universidade da Califórnia Davis investimentos em pesquisa no (RISE) Prêmio de Ciência e Engenharia. CA Chapman é apoiado por um departamento de pós-graduação Áreas de Assistência de Fellowship Nacional Need. Este trabalho foi apoiado pelo Programa Lab UC taxas Research, UC Davis RISE, e UC Davis Faculdade de Engenharia fundos start-up.

1. Nanoporous Fabrication Ouro <ol><li> Substratos limpos em solução Piranha <ol><li> Adicionar 25 ml de peróxido de hidrogénio (30%) a 100 ml de ácido sulfúrico (96%) em um prato de cristalização e aquecer a mistura a 65 ° C numa placa de aquecimento. AVISO: Os líquidos são extremamente corrosivo e deve ser manuseado com cuidado. A solução passou não deve ser armazenado num recipiente fechado, como pode explodir. </li><li> Coloque 1 polegada por lâminas de microscópio de 3 polegadas na mistura usando uma pinça anti-ácido e limpá-los por 10 min. Use um barco immunostaining porcelana para lote limpeza pequenas lamelas. Tratar com pequenas lamelas de plasma de ar de 10 W durante 30 segundos antes da imersão na solução. </li><li> Lavar as amostras limpas em pratos de cristalização sob água corrente deionizada (DI) por 3 min. Amostras secar com uma arma de nitrogênio mais sem fiapos toalhas. </li></ol></li><li> Prepare máscara stencil (Método 1: Use este para a criação de padrões milímetros escala) <ol><li> Perfurador 250 folhas de elastômero de silicone m de espessura com biópsia socos e / ou fora inciso regiões com um bisturi sobre uma superfície de plástico semi-rígido. Limpe as folhas de elastômero processados ​​em 70% isopropanol e seco com arma de nitrogênio. </li><li> Coloque a folha de soco em uma toalha que não solte fiapos sala limpa e alinhar as lamelas piranha-limpos sobre o estêncil com a superfície da amostra de frente para o stencil. </li></ol></li><li> Padrão lift-off photoresist (Método 2: Usar isso para a criação de padrões sub-milímetro escala) <ol><li> Coloque uma piranha-limpa lâmina de microscópio girando chuck e explodir a qualquer partículas com arma de nitrogênio. Pipetar 1,5 ml de promotor de aderência (hexametildisilazano) sobre a lâmina de vidro usando uma pipeta de plástico. Espalhar o promotor girando a corrediça, sucessivamente, a 500 rpm durante 5 segundos e 1500 rpm durante 30 segundos. Asse o slide numa placa de aquecimento a 115 ° C por 7 min e deixe esfriar por 5 min. </li><li> Dispensar 4 ml de material fotosensitivo sobre a lâmina de vidro (de 3 polegadas by 1 polegada). Espalhar o material fotosensitivo, girando o diapositivo com o mesmo protocolo como para o promotor de adesão. Asse o fotorresiste numa placa de aquecimento a 115 ° C por 1,5 min e deixe esfriar por 10 min. </li><li> Expor o slide photoresist revestido com luz UV (intensidade: 22 mW / cm 2) por meio de uma máscara de transparência por 15 s. Coza a fotorresistência sobre uma placa quente a 115 ° C durante 1,5 min e esperar durante 45 min. Dissolve-se o foto-resistente exposta no revelador durante pelo menos 3,5 minutos. Enxaguar abundantemente com água DI. Inspecione os padrões desenvolvidos sob um microscópio óptico. </li></ol></li><li> Metais precursores de depósito para produzir np-Au filmes finos <ol><li> Coloque as amostras em uma máquina de pulverização catódica, que pode depositar independentemente de ouro, prata e cromo. Sputter-limpar as amostras por 90 segundos a 50 W com menos de 25 mTorr atmosfera processamento argônio antes de iniciar a deposição de metal. </li><li> Sputter chrome por 10 min a 300 W em 10 mTorr argônio. Sputter ouro por 90 segundos a 400 W under 10 mTorr árgon. Co-pulverização catódica ouro e prata por 10 minutos com a prata em 200 W e potência de 100 W. Au Desligue ouro pulverização catódica fonte de cerca de 10 segundos antes de desligar a fonte de prata por pulverização catódica. </li></ol></li><li> Obter precursoras micropadrões de metal <ol><li> Sonicar amostras fotosensitivo revestidos em ~ 180 ml de extractor fotorresistência durante 10 ciclos de 20 segundos de sonicação e 2 minutos de pausa entre os ciclos. Lavar as amostras com água DI e seque com um arma de nitrogênio. Inspecionar os padrões de metal sob um microscópio. </li><li> Descasque o stencil elastômero a partir de amostras não-fotossensíveis revestidos utilizando duas pinças para revelar o metal depositado. </li></ol></li><li> Dealloy precursor de metal e nanoestrutura modify via tratamento térmico <ol><li> Encher um copo de vidro de 200 ml com 170 ml de ácido nítrico (70%) e manter a temperatura da solução a 55 ° C numa placa de aquecimento. CUIDADO: O ácido nítrico é extremamente corrosivo e deve ser manuseado com equipamentos de proteção adequados. </li&gt; <li> Tratar com pequenas lamelas de plasma de ar de 10 W durante 30 segundos antes da imersão em ácido nítrico. Local 1 polegada por lâminas de microscópio de 3 polegadas no copo usando fórceps ácido-resistentes e dealloy los durante 15 min. Use um barco immunostaining porcelana para batch-dealloying pequenas lamelas. </li><li> Lavar as amostras dealloyed por imersão sucessivamente em duas provetas cheias com água DI fresco três vezes. Armazenar as amostras em água DI e substituir a água com água DI fresco todos os dias por pelo menos uma semana. Amostras secar com uma arma de nitrogênio sobre toalhas que não soltem fiapos antes do uso. </li><li> Coloque as amostras em uma pastilha de silício limpa em um equipamento de processamento térmico rápido. Ajustar a temperatura para valores entre 200 ° C e 450 ° C e a taxa de rampa de 10 ° C / seg. Expor as amostras à temperatura prescrita durante 10 min sob azoto ambiente. Deixe a câmara fria (&lt;100 ° C) e retirar as amostras. Alternativamente, lentamente colocar as amostras sobre a placa para tratam térmicaent. </li></ol></li></ol> 2. Cultura de Células <ol><li> Prepare amostras np-Au para cultura de células <ol><li> Coloque np-Au amostras em pratos de poliestireno e tratar com plasma de ar de 10 W durante 30 segundos e transferir as amostras para placas de cultura de tecidos de 24 poços. </li><li> Adicionar 500 ul de meio de cultura completo (Meio Eagle Modificado por Dulbecco com 10% de soro fetal bovino e 1% de penicilina / estreptomicina) a cada poço. Armazenar num incubador humidificado a 37 ° C e 5% de CO 2 até semeando as células (&lt;1 hr). </li></ol></li><li> Células manter, de passagem, e semente <ol><li> Manter as células de interesse (neste caso, os fibroblastos 3T3-NIH ou astrócitos murinos) em frascos T75 com meios de cultura e de passagem, quando as células são de 70% confluentes. </li><li> Para passaging das células, remove material da garrafa, lavar duas vezes com 10 ml de solução salina tamponada com fosfato (PBS), adicionar 2 ml de 1x tripsina / EDTA e as células a incubar até separar (~ 5 minutos). Adicionar 3 ml novas mídias ecentrifugar a 1200 rpm durante 3 min. Aspirar o sobrenadante e suspender o sedimento em media de 2 ml. </li><li> Remova o material gasto a partir dos poços e as células das sementes para as lamelas de vidro com uma densidade de 25.000 células / cm 2 com um volume final de 1 ml. Agite a placa de cultura voltada para trás e direita-esquerda para garantir um revestimento uniforme de células sobre as amostras. Incubar as células até a análise ao inspecionar diariamente. </li></ol></li></ol> 3. Celular e Análise de Material <ol><li> Stain células para visualizar citoesqueleto e núcleos <ol><li> Remova a mídia passou dos poços e lavar as células duas vezes com PBS. Fixar as células em 4% de paraformaldeído em PBS, durante 15 min. </li><li> Preparar a solução de coloração a 300 nm com Alexa Fluor 488 faloidina em PBS com 1% de albumina de soro bovino. </li><li> Lave as células duas vezes com PBS, e elas permeabilizar em 500 ul 0.1% Triton X-100 em PBS durante 5 min. </li><li> Lave as células duas vezes com PBS e transferi-los para limpar poços. Blot 50 - 200 mL de solução de coloração para as amostras e armazenar em escuro por 20 min. </li><li> Lavar as células com PBS e de contra-coloração com 3 nM de DAPI em PBS durante 5 min. </li><li> Lavar as células com PBS, e mergulhe em água deionizada antes da montagem em lâminas de vidro com tampa meios de montagem e vedação com claro unha polonês. </li></ol></li><li> Aquisição de imagens de amostras np-Au e culturas de células em superfícies np-Au <ol><li> Superfícies imagem np-Au com microscópio eletrônico de varredura (MEV) com ampliação de 50.000 X em 10 kV de energia do elétron usando detector de elétrons secundários. </li><li> Capturar imagens de células compostas em diferentes pontos nas amostras utilizando um microscópio de fluorescência invertido em aumento de 10x com os cubos de filtros adequados. </li></ol></li><li> Processamento de imagens para determinar a morfologia dos poros e celular <ol><li> Abertura de imagens no ImageJ e dividida em canais individuais se aplicável. Converta as imagens em 8 bits, subtrair o fundo, e alisá-los por filteri medianang. Ajuste o limiar de forma manual ou por built-in limiarizar algoritmos para destacar os poros (vazios) e corpos celulares / núcleos. </li><li> Use o comando divisor de águas para separar poros incorporadas ou células. Definir parâmetros de análise de partículas e executar o comando para extrair o número de partículas, área média e cobertura por cento de partículas. Use imagens de células DAPI manchadas para contagem celular e imagens de células phalloidin manchadas para quantificar a cobertura de celular por cento. </li><li> Modifique os arquivos de macro incluídos para realizar a análise de múltiplas imagens em lote. </li></ol></li></ol>

<ol><li>Arico, A. S., Bruce, P., Scrosati, B., Tarascon, J. M., Van Schalkwijk, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nanostructured+materials+for+advanced+energy+conversion+and+storage+devices%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Materials%22%5BJournal%5D)">Nanostructured materials for advanced energy conversion and storage devices.</a> Nature Materials. 4, 366-377 (2005).</li>
<li>Roy, S., Gao, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nanostructure-based+electrical+biosensors%5BTitle%5D)+AND+%22Nano+Today%22%5BJournal%5D)">Nanostructure-based electrical biosensors.</a> Nano Today. 4, 318-334 (2009).</li>
<li>Chen, C. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DNA-decorated+carbon-nanotube-based+chemical+sensors+on+complementary+metal+oxide+semiconductor+circuitry%5BTitle%5D)+AND+%22Nanotechnology%22%5BJournal%5D)">DNA-decorated carbon-nanotube-based chemical sensors on complementary metal oxide semiconductor circuitry.</a> Nanotechnology. 21, 095504(2010).</li>
<li>Lu, J., Rao, M. P., MacDonald, N. C., Khang, D., Webster, T. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Improved+endothelial+cell+adhesion+and+proliferation+on+patterned+titanium+surfaces+with+rationally+designed%2C+micrometer+to+nanometer+features%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Biomaterialia%22%5BJournal%5D)">Improved endothelial cell adhesion and proliferation on patterned titanium surfaces with rationally designed, micrometer to nanometer features.</a> Acta Biomaterialia. 4, 192-201 (2008).</li>
<li>Wagner, V., Dullaart, A., Bock, A. K., Zweck, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+emerging+nanomedicine+landscape%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">The emerging nanomedicine landscape.</a> Nat. Biotechnol. 24, 1211-1218 (2006).</li>
<li>Weissmüller, J., Newman, R., Jin, H., Hodge, A., Kysar, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Theme+Article+-+Nanoporous+Metals+by+Alloy+Corrosion%3A+Formation+and+Mechanical+Properties%5BTitle%5D)+AND+%22Materials+Research+Society+Bulletin%22%5BJournal%5D)">Theme Article - Nanoporous Metals by Alloy Corrosion: Formation and Mechanical Properties.</a> Materials Research Society Bulletin. 34, 577-586 (2009).</li>
<li>Erlebacher, J., Aziz, M., Karma, A., Dimitrov, N., Sieradzki, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evolution+of+nanoporosity+in+dealloying%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Evolution of nanoporosity in dealloying.</a> Nature. 410, 450-453 (2001).</li>
<li>Okman, O., Lee, D., Kysar, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fabrication+of+crack-free+nanoporous+gold+blanket+thin+films+by+potentiostatic+dealloying%5BTitle%5D)+AND+%22Scripta+Mater%22%5BJournal%5D)">Fabrication of crack-free nanoporous gold blanket thin films by potentiostatic dealloying.</a> Scripta Mater. 63, 1005-1008 (2010).</li>
<li>Seker, E., Reed, M., Begley, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nanoporous+Gold%3A+Fabrication%2C+Characterization%2C+and+Applications%5BTitle%5D)+AND+%22Materials%22%5BJournal%5D)">Nanoporous Gold: Fabrication, Characterization, and Applications.</a> Materials. 2, 2188-2215 (2009).</li>
<li>Biener, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Size+effects+on+the+mechanical+behavior+of+nanoporous+Au%5BTitle%5D)+AND+%22Nano+Lett%22%5BJournal%5D)">Size effects on the mechanical behavior of nanoporous Au.</a> Nano Lett. 6, 2379-2382 (2006).</li>
<li>Senior, N., Newman, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synthesis+of+tough+nanoporous+metals+by+controlled+electrolytic+dealloying%5BTitle%5D)+AND+%22Nanotechnology%22%5BJournal%5D)">Synthesis of tough nanoporous metals by controlled electrolytic dealloying.</a> Nanotechnology. 17, 2311-2316 (2006).</li>
<li>Zielasek, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gold+catalysts%3A+Nanoporous+gold+foams%5BTitle%5D)+AND+%22Angew.+Chem.+Int.+Ed%22%5BJournal%5D)">Gold catalysts: Nanoporous gold foams.</a> Angew. Chem. Int. Ed. 45, 8241-8244 (2006).</li>
<li>Wittstock, A., Biener, J., Bäumer, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nanoporous+gold%3A+a+new+material+for+catalytic+and+sensor+applications%5BTitle%5D)+AND+%22PCCP%22%5BJournal%5D)">Nanoporous gold: a new material for catalytic and sensor applications.</a> PCCP. 12, 12919-12930 (2010).</li>
<li>Shulga, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Preparation+and+characterization+of+porous+gold+and+its+application+as+a+platform+for+immobilization+of+acetylcholine+esterase%5BTitle%5D)+AND+%22Chem.+Mater%22%5BJournal%5D)">Preparation and characterization of porous gold and its application as a platform for immobilization of acetylcholine esterase.</a> Chem. Mater. 19, 3902(2007).</li>
<li>Shulga, O., Zhou, D., Demchenko, A., Stine, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Detection+of+free+prostate+specific+antigen+%28fPSA%29+on+a+nanoporous+gold+platform%5BTitle%5D)+AND+%22The+Analyst%22%5BJournal%5D)">Detection of free prostate specific antigen (fPSA) on a nanoporous gold platform.</a> The Analyst. 133, 319-322 (2008).</li>
<li>Seker, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+fabrication+of+low-impedance+nanoporous+gold+multiple-electrode+arrays+for+neural+electrophysiology+studies%5BTitle%5D)+AND+%22Nanotechnology%22%5BJournal%5D)">The fabrication of low-impedance nanoporous gold multiple-electrode arrays for neural electrophysiology studies.</a> Nanotechnology. 21, 125504(2010).</li>
<li>Seker, E., Berdichevsky, Y., Staley, K. J., Yarmush, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microfabrication-Compatible+Nanoporous+Gold+Foams+as+Biomaterials+for+Drug+Delivery%5BTitle%5D)+AND+%22Advanced+Healthcare+Materials%22%5BJournal%5D)">Microfabrication-Compatible Nanoporous Gold Foams as Biomaterials for Drug Delivery.</a> Advanced Healthcare Materials. 1, 172-176 (2012).</li>
<li>Okman, O., Kysar, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microfabrication+of+Nanoporous+Gold%5BTitle%5D)+AND+%22Nanoporous+Gold%3A+From+an+Ancient+Technology+to+a+High-Tech+Material%22%5BJournal%5D)">Microfabrication of Nanoporous Gold.</a> Nanoporous Gold: From an Ancient Technology to a High-Tech Material. 22, 69(2012).</li>
<li>Lee, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microfabrication+and+mechanical+properties+of+nanoporous+gold+at+the+nanoscale%5BTitle%5D)+AND+%22Scripta+Mater%22%5BJournal%5D)">Microfabrication and mechanical properties of nanoporous gold at the nanoscale.</a> Scripta Mater. 56, 437-440 (2007).</li>
<li>Seker, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+effects+of+post-fabrication+annealing+on+the+mechanical+properties+of+freestanding+nanoporous+gold+structures%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Mater%22%5BJournal%5D)">The effects of post-fabrication annealing on the mechanical properties of freestanding nanoporous gold structures.</a> Acta Mater. 55, 4593-4602 (2007).</li>
<li>Parida, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Volume+change+during+the+formation+of+nanoporous+gold+by+dealloying%5BTitle%5D)+AND+%22Phys.+Rev.+Lett%22%5BJournal%5D)">Volume change during the formation of nanoporous gold by dealloying.</a> Phys. Rev. Lett. 97, 35504-35506 (2006).</li>
</ol>

Os autores não têm interesse financeiro conflitantes.

Nós demonstramos duas técnicas diferentes para micropattern np-Au filmes para a expansão do uso destes filmes em microssistemas e estudos biológicos. Sputter ouro e prata-revestimento é um método versátil para criar padrões de np-Au, como pulverização catódica é compatível com os processos convencionais de microfabricação e da composição da liga e a espessura pode ser facilmente controlada através da variação das potências individuais pistola de pulverização (para objectivos de ouro e prata) e o tempo de deposição, resp...

<p class="jove_content"&gt; Materiais com características nano-escala têm se mostrado promissora no reforço várias aplicações, incluindo as células de combustível<sup&gt; 1</sup&gt;, Sensores<sup&gt; 2,3</sup&gt; E dispositivos biomédicos<sup&gt; 4,5</sup&gt;. Um material relativamente novo é ouro nanoporoso (np-Au), a qual é produzida por um processo de auto-montagem de nano-escala. O precursor de NP-Au é uma liga de ouro que mais comumente consiste em prata de 60% a 80% em percentagem atómica. Resumidamente, a característica de nanoestrutura de poros abertos, é o resultado do rearranjo de átomos de ouro em aglomerados como a prata é dissolvido por um ácido forte (<em&gt; Por exemplo</em&gt; Ácido nítrico 70%) ou sob um potencial eletroquímico<sup&gt; 6-8</sup&gt;. Np-Au benefícios de vários atributos desejáveis, incluindo a grande área de superfície eficaz, de alta condutividade elétrica, técnicas de funcionalização de superfície bem estabelecidas, e biocompatibilidade<sup&gt; 9</sup&gt;. Embora tenha havido uma rápida expansão dos estudos sobre NP-Au, a maioria deles concentrar em propriedades mecânicas do np-Au<sup&gt; 10,11</sup&gt;, A atividade catalítica<sup&gt; 12</sup&gt; E desempenho de detecção biomolecular<sup&gt; 13-15</sup&gt;. Embora os atributos desejáveis ​​são altamente úteis para várias ferramentas biomédicas<sup&gt; 16,17</sup&gt;, As aplicações nesta área têm sido limitados. Uma possível razão para isto é que a maioria dos estudos têm predominantemente utilizadas amostras de macro-escala (<em&gt; Por exemplo</em&gt; Chapas, folhas, e lingotes) e as técnicas para a incorporação np-Au em sistemas miniaturizados permaneceram inadequada. Na verdade, há apenas um punhado de exemplos do uso de técnicas de microfabricação convencionais que utilizam filmes np-Au<sup&gt; 16-20</sup&gt;. Com o advento da tecnologia de miniaturização e a necessidade de novas ferramentas biomédicas, tornou-se essencial para ser capaz de se integrar novos materiais para dispositivos. Isso normalmente requer que os materiais podem ser depositados e modelado com técnicas convencionais de microfabricação. Além disso, a rápida quantificação das interacções célula-prima é geralmente necessária para avaliar a biocompatibilidade de um material novo. O objetivo deste artigo é demonstrar as técnicas básicas para micropattern np-Au filmes e quantificar tanto a nanoestrutura e as interações célula-material através de processamento de imagem digital.</p

<table><tbody><tr><td>Alvo de ouro</td><td>Lesker</td><td>EJTAUXX403A2</td><td>Precursor da liga para a produção de np-Au</td></tr><tr><td>Alvo de cromo</td><td>Lesker</td><td>EJTCRXX353A2</td><td>Camada adesiva</td></tr><tr><td>Alvo de prata</td><td>Lesker</td><td>EJTAGXX403A2</td><td>Precursor da liga para a produção de np-Au</td></tr><tr><td>Barco de porcelana</td><td>Thomas Scientific</td><td>8542E40</td><td>Usado para processar pequenas amostras</td></tr><tr><td>Ácido nítrico</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>43873</td><td>Usado a 70% para desliga</td></tr><tr><td>Ácido sulfúrico</td><td>J.T Baker</td><td>7664-93-9</td><td>Usado a 96% para limpeza de piranhas</td></tr><tr><td>Peróxido de hidrogênio</td><td>J.T Baker</td><td>7722-84-1</td><td>Usado a 30% para limpeza de piranhas</td></tr><tr><td>Punções de biópsia</td><td>Ted Pella</td><td>150xx</td><td>Disponível em vários tamanhos</td></tr><tr><td>Folhas de elastômero de silicone</td><td>Rogers Corporation</td><td>HT 6240</td><td>Disponível em várias espessuras</td></tr><tr><td>Hexametildisilazane</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>440191-100ML</td><td>Usado como promotor de adesão para resistência positiva</td></tr><tr><td>Microposit MF CD26</td><td>Shipley</td><td>38490</td><td>Revelador de fotorresistência positiva</td></tr><tr><td>PRS 3000</td><td>J.T Baker</td><td>JT6403-5</td><td>Removedor de fotorresistência positiva</td></tr><tr><td>Lamínulas de vidro circulares (12 mm)</td><td>Ted Pella</td><td>26023</td><td>Usado como substrato para padrões de metal e cultura de células</td></tr><tr><td>Lâminas de vidro (1 x 3 polegadas)</td><td>Ted Pella</td><td>26007</td><td>Usado como substrato para padrões de metal</td></tr><tr><td>Fita de poliimida Kapton</td><td>VWR</td><td>82030-950</td><td>Usado para fixar elastômero</td></tr><tr><td>Máscaras de transparência</td><td>Cidade de saída</td><td></td><td>Usado em fotolitografia <a href="http://www.outputcity.com/" target="_blank">http://www.outputcity.com/ < / a ></td></tr> <tr><td>limpador de plasma</td><td>Harrick Plasma</td><td>PDC-32G</td><td>Usado para ativar superfícies de vidro</td></tr><tr>Máquina<td>de pulverização catódica</td><td>Kurt J. Lesker</td><td>LAB18</td><td>Usado para depositar metais</td></tr></tbody></table>

microfabricação de padrões de ouro nanoporosos para celular-primas estudos de interacção

Microfabrication of Nanoporous Gold Patterns for Cell-material Interaction Studies

Materiais nanoestruturados com tamanhos recurso em dezenas de nanômetros têm melhorado o desempenho de várias tecnologias, incluindo as células de combustível, biossensores, revestimentos de dispositivos biomédicos, e ferramentas de administração de medicamentos. Ouro nanoporos (np-Au), produzido por um processo de auto-montagem nano-escala, é um material relativamente novo que apresenta grande área de superfície eficaz, de alta condutividade elétrica, e atividade catalítica. Estas propriedades tornaram-np Au um material atraente para a comunidade científica. A maioria dos estudos sobre a np-Au utilizar espécimes macro-escala e foco em ciência fundamental da suas aplicações catalíticas e sensor de materiais. Os espécimes macro-escala limitar o potencial de np-Au em sistemas miniaturizados, incluindo dispositivos biomédicos. A fim de abordar estas questões, inicialmente descrever dois métodos diferentes para micropattern np-Au filmes finos sobre substratos rígidos. O primeiro método utiliza máscaras de estêncil manualmente produzidos para a criação de milímetro escala padrões np-Au, while o segundo método usa lift-off fotolitografia para padrões sub-milímetro escala padrão. À medida que os filmes finos de NP-Au são obtidos por um processo de deposição por borrifamento, eles são compatíveis com as técnicas convencionais de microfabricação, assim passíveis de integração fácil em microssistemas. Estes sistemas incluem plataformas biossensor eletricamente endereçáveis ​​que beneficiam de área de alto eficaz superfície, condutividade elétrica, e bioconjugation superfície tiol à base de ouro. Descrevemos de cultura de células, a imunocoloração, e as técnicas de processamento de imagem para quantificar a interacção do np-Au com células de mamíferos, o que é um parâmetro de desempenho importante para algumas biossensores. Esperamos que as técnicas ilustradas aqui vai facilitar a integração das np-Au em plataformas em várias escalas de comprimento e em inúmeras aplicações, incluindo biossensores, sistemas de armazenamento de energia, e catalisadores.

A Figura 1 apresenta os principais passos processuais, incluindo a criação de padrões de np-Au, cultura de células, quantificando a nanoestrutura, e caracterizar a morfologia celular. A matriz de elastómero mostrado na Figura 2a (superior) é usada para criar os padrões de np-Au mostrados nas imagens subjacentes. Figura 2b é uma fotografia do barco de porcelana para amostras de processamento em lote. Figura 2c mostra a mudança de cor dos padrões de metal...

Nós relatamos em técnicas para micropattern nanoporous filmes finos de ouro através de impressão stencil e fotolitografia, bem como métodos para cultura de células sobre os padrões microfabricados. Além disso, descrevemos métodos de análise de imagem para caracterizar a morfologia do material e as células cultivadas utilizando electrónica de varrimento e técnicas de microscopia de fluorescência.

Microfabricação de Padrões de Ouro Nanoporosos para celular-primas estudos de interacção

Nanostructured materials with feature sizes in tens of nanometers have enhanced the performance of several technologies, including fuel cells, biosensors, ...

O objetivo geral deste procedimento é fabricar microestruturas de ouro nanoporoso e demonstrar sua compatibilidade com o cultivo celular. Isso é realizado primeiramente criando máscaras de estêncil ou por litografia fotográfica. O segundo passo consiste em realizar a pulverização catódica conjunta de ouro e prata através das máscaras, para definir a liga precursora do ouro nanoporoso.Em seguida, os padrões de liga ouro-prata são dealigados em ácido nítrico para produzir revestimentos de ouro nanoporoso. O passo final consiste em cultivar células sobre os micropadrões de ouro nanoporoso e imunomarcar as células; posteriormente, a microscopia de fluorescência e a microscopia eletrônica de varredura, acopladas à análise de imagens, são utilizadas para quantificar as interações célula-material. A principal vantagem desta técnica em relação a outros métodos de criação de revestimentos nanoestruturados, como nanotubos de carbono, é que o ouro nanoporoso se beneficia da compatibilidade com microfabricação, alta área superficial efetiva, facilidade de funcionalização com química baseada em caminhos, condutividade elétrica e biocompatibilidade.Este método pode responder perguntas fundamentais nas áreas de ciência dos materiais e bioengenharia, como o efeito da nanoestrutura do material sobre propriedades elétricas, mecânicas, biológicas e químicas. Embora este método forneça informações sobre o efeito da nanoestrutura na morfologia celular, ele também pode ser aplicado a outros sistemas, como o desenvolvimento de biossensores, sistemas de liberação de fármacos e plataformas de armazenamento de energia.Inicie este procedimento limpando lâminas de microscópio de uma polegada por três polegadas e lamínulas pequenas com uma solução de piranha; coloque as lamínulas pequenas em um barquinho de porcelana para imuno-histoquímica e mergulhe o barquinho junto com a lâmina de microscópio na solução de piranha. Consulte o protocolo escrito para obter detalhes sobre o procedimento de limpeza. Após a limpeza, transfira as amostras para placas de cristalização e enxágue-as com água desionizada por três minutos.Coloque as amostras sobre toalhas livres de fiapos e seque-as com uma pistola de nitrogênio para criar padrões em escala milimétrica. Perfure lâminas de elastômero de silicone com espessura de 250 mícrons utilizando um punch de biópsia. Limpe as lâminas de elastômero processadas imergindo-as em isopropanol 70% e, em seguida, seque-as com uma pistola de nitrogênio.Em seguida, coloque a folha perfurada sobre uma toalha livre de fiapos e alinhe as lamínulas limpas sobre o estêncil com a superfície da amostra voltada para o estêncil. Transfira o estêncil com as lamínulas para uma pastilha transportadora para criar padrões em escala submilimétrica. Coloque uma lâmina de microscópio limpa sobre um porta-lâmina giratório e remova quaisquer partículas com uma pistola de nitrogênio.Dispense 1,5 mililitros de hexa metil dilano sobre a lâmina de vidro. Usando uma pipeta de plástico, espalhe o hexa metil dilano girando a lâmina sucessivamente a 500 RPM durante cinco segundos e a 1500 RPM durante 30 segundos. Ao finalizar, aqueça a lâmina em uma placa aquecedora a 115 graus Celsius por sete minutos e, em seguida, deixe esfriar por cinco minutos.Em seguida, distribua quatro mililitros de uma resina fotossensível positiva sobre a lâmina de vidro. Espalhe a resina fotossensível girando a lâmina usando as condições descritas anteriormente.Coloque a lâmina em uma placa aquecida a 115 graus Celsius por 1,5 minuto e remova-a após a exposição à UV e o aquecimento. Dissolva a resistência fotográfica exposta mergulhando a lâmina em uma foto positiva.Revele o resistente por pelo menos 3,5 minutos. Quando terminar, enxágue a lâmina completamente com água desionizada e inspecione os padrões revelados sob um microscópio óptico. Em seguida, carregue as amostras em uma máquina de pulverização catódica capaz de depositar ouro, prata e cromo separadamente.Limpe as amostras por 90 segundos a 50 watts sob uma atmosfera de processamento de 25 millitorr de argônio antes de iniciar a deposição de metal sob 10 millitorr de argônio, com pulverização catódica de cromo por 10 minutos a 300 watts. Em seguida, pulverize ouro por 90 segundos a 400 watts, seguido da pulverização simultânea de ouro e prata por 10 minutos, com a prata a 200 watts e o ouro a 100 watts. Desligue a fonte de pulverização de ouro aproximadamente 10 segundos antes de desligar a fonte de pulverização de prata.Remova as amostras da máquina de pulverização catódica após retirá-las do equipamento de pulverização catódica. Submeta-as à ultrassonicação em cerca de 180 mililitros de removedor de resistência fotográfica positiva por 10 ciclos de ultrassonicação de 22 segundos com pausas de dois minutos entre os ciclos.Quando terminar, enxágue as amostras com água desionizada e seque-as com um jato de nitrogênio. Inspecione os padrões metálicos ao microscópio. Em seguida, remova o estêncil de elastômero das amostras não revestidas com resistência fotográfica usando duas pinças para revelar o metal depositado.Trate as lamínulas pequenas com plasma de ar a 10 watts por 30 segundos antes de mergulhá-las em ácido nítrico. Desligue as lâminas de microscópio submergindo-as em um béquer com ácido nítrico a 70% a 55 graus Celsius por 15 minutos. Após a conclusão da desliga, enxágue as amostras mergulhando-as sucessivamente em béqueres com água desionizada, três vezes cada.Coloque as amostras sobre toalhas livres de fiapos e seque-as com uma pistola de nitrogênio. Ajuste a temperatura de uma placa aquecedora entre 150 e 300 graus Celsius. Em seguida, abaixe lentamente as amostras sobre a superfície quente para minimizar mudanças bruscas de temperatura.Após cinco minutos, retire as amostras da placa aquecedora para esfriar. Coloque as amostras de ouro nanoporoso em recipientes de poliestireno e trate-as com plasma de ar a 10 watts por 30 segundos. Em seguida, transfira as amostras para placas de cultura de tecidos de 24 poços.Adicione 500 microlitros de meio de cultura completo a cada um. Armazene as placas em um incubador umidificado a 37 graus Celsius e 5% de CO2 até o momento de semear as células. Mantenha as células de astrócitos murinos em frascos T75 com meio de cultura.Quando as células atingirem 70% de confluência, realize a passagem removendo primeiro o meio antigo e lavando as células com PBS. Consulte o protocolo descrito para obter detalhes sobre as condições de passagem. Após remover as placas de cultura do incubador, aspire o meio gasto dos poços e semeie as células sobre o vidro.Cubra lâminas com uma densidade de 25.000 células por centímetro quadrado com um volume final de um mililitro. Agite a placa de cultura para garantir um revestimento uniforme de células sobre as amostras e coloque a placa de cultura no incubador quando as células estiverem prontas para serem analisadas. Remova o meio usado dos poços e lave-os duas vezes com PBS.Uma vez que as células tenham sido fixadas em paraformaldeído 4% em PBS e lavadas duas vezes, permeabilize-as em 500 microlitros de Triton X-100 0,1% em PBS por cinco minutos. Repita a lavagem com PBS duas vezes e transfira as células para poços limpos. Aplique 80 microlitros da solução de coloração sobre as amostras e armazene-as cobertas com folha de alumínio por 20 minutos.Após outra lavagem com PBS, contraclare os células com três nanomolares de DPI em PBS por cinco minutos. Lave as células com PBS mais uma vez e mergulhe-as em di, em seguida, monte as células sobre lâmina de vidro. Cubra as lâminas com meio de montagem e feche-as com esmalte incolor para imagem.As superfícies de ouro nanoporosas foram analisadas em um microscópio eletrônico de varredura com aumento de 50.000 x e energia de elétrons de 10 quilovolts, utilizando um detector de elétrons secundários. Em seguida, capture imagens compostas de células em diferentes pontos das amostras usando um microscópio de fluorescência invertido com aumento de 10 x e cubos de filtros apropriados. Abra as imagens no ImageJ. Separe as imagens em canais individuais.Converta-as para oito bits. Subtraia o fundo e suavize-as por meio de filtragem mediana. Em seguida, ajuste manualmente o limiar para destacar os poros, corpos celulares e núcleos.Utilize o comando watershed para separar poros ou células fundidos. Defina os parâmetros de análise de partículas e execute o comando para extrair o número de partículas, a área média e a porcentagem de cobertura pelas partículas. Por fim, modifique os arquivos de macro incluídos para realizar análise em lote de múltiplas imagens.A mudança de cor dos padrões metálicos depositados antes e depois da desaleação é mostrada aqui. O acabamento prateado é devido ao teor rico em prata da liga após a aleação. O filme adquire uma tonalidade marrom alaranjada visível.Mostram-se aqui as características finas produzidas pela litografia fotográfica. O padronamento do metal. Diferentes morfologias porosas podem ser obtidas mediante tratamento térmico dos filmes de ouro nanoporoso.A imagem em corte transversal revela se os filmes são dealigados de forma uniforme ao longo da espessura do filme. As imagens de microscopia eletrônica de varredura podem ser segmentadas em imagens binárias para determinar o tamanho e a porcentagem de cobertura por vazios. O código para gerar essa saída pode ser baixado da página da JoVE.Uma imagem de fluorescência representativa de células de astrócitos murinos aderentes cultivadas em uma superfície de ouro nanoporoso é mostrada aqui. Os canais individuais da imagem podem ser separados e segmentados para gerar imagens binárias destinadas à análise da interação entre o material celular e a superfície. Imagens do citoesqueleto segmentadas podem ser utilizadas para quantificar a área celular e a cobertura da superfície.Embora as imagens segmentadas do núcleo celular sejam úteis para a contagem de células, os códigos para gerar essas saídas podem ser baixados da página da JoVE. É mostrado aqui um resumo visual de falhas na fabricação de estruturas de ouro nanoporoso, incluindo adesão inadequada do filme PO, ausência de porosidade e tratamento térmico excessivo.Após este procedimento, outros métodos sugerem a caracterização eletroquímica em microscopia de varredura, lise celular e PCR, que podem ser realizadas para responder a questões adicionais, como o efeito da nanoestrutura na adesão celular e na expressão gênica. Após assistir a este vídeo, você deverá ter uma boa compreensão de como produzir padrões de ouro nanoporosos e quantificar suas interações com células por meio de análise digital de imagens de microscopia. Resultados. Não se esqueça de que o trabalho com ácido nítrico, ácido sulfúrico e peróxido de hidrogênio pode ser extremamente perigoso, e precauções, incluindo o uso de equipamento de proteção individual, devem sempre ser tomadas ao realizar este procedimento.

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Research

JoVE Journal

Bioengineering

Bioengenharia

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Microfabricação de Padrões de Ouro Nanoporosos para celular-primas estudos de interacção

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