Microfabricação de Padrões de Ouro Nanoporosos para celular-primas estudos de interacção

O objetivo geral deste procedimento é fabricar micro padrões de ouro nanoporoso e demonstrar sua compatibilidade com a cultura de células. Isso é feito criando primeiro estêncil ou máscaras fotolitográficas. O segundo passo é cuspir ouro e prata através das máscaras para padronizar a liga precursora para ouro nanoporoso.

Em seguida, os padrões de liga de ouro e prata são ligados em ácido nítrico para produzir revestimentos de ouro nanoporosos. A etapa final é cultivar células sobre os micropadrões de ouro nanoporoso e imunocorá-los, em última análise, a fluorescência e a microscopia eletrônica de varredura, juntamente com a análise de imagem, são usadas para quantificar as interações do material celular. A principal vantagem dessa técnica sobre outros métodos para criar revestimentos nanoestruturados, como nanotubos de carbono, é que o ouro nanoporoso se beneficia da compatibilidade de microfabricação, alta área de superfície efetiva, facilidade de funcionalização com química baseada em ladrilhos, condutividade elétrica e biocompatibilidade.

Este método pode responder a questões-chave nos campos da ciência dos materiais e da bioengenharia, como o efeito da nanoestrutura do material nas propriedades elétricas, mecânicas, biológicas e químicas. Embora este método forneça informações sobre o efeito da nanoestrutura na morfologia celular. Também pode ser aplicado a outros sistemas, como o desenvolvimento de biossensores, sistemas de liberação de medicamentos e plataformas de armazenamento de energia.

Comece este procedimento limpando lâminas de microscópio de uma polegada por três polegadas e pequenas lamínulas com uma solução de piranha, carregue as pequenas lamínulas em um barco de coloração imunológica de porcelana e mergulhe o barco e a lâmina do microscópio na solução de piranha. Consulte o protocolo de texto para obter detalhes sobre o procedimento de limpeza. Após a limpeza, transfira as amostras para placas de cristalização e lave-as com di água por três minutos.

Coloque as amostras em toalhas sem fiapos e seque-as com uma pistola de nitrogênio Para criar padrões em escala milimétrica. Perfure folhas de elastômero de silicone de 250 mícrons de espessura com um punção de biópsia. Limpe as folhas de elastômero processadas imergindo-as em isopropanol a 70% e depois seque-as com uma pistola de nitrogênio.

Em seguida, coloque a folha de punção em uma toalha sem fiapos e alinhe as lamínulas limpas sobre o estêncil com a superfície da amostra voltada para o estêncil. Transfira o estêncil com as lamínulas para um wafer transportador para criar padrões de escala submilimétrica. Coloque um microscópio limpo, deslize em um mandril giratório e sopre todas as partículas com uma pistola de nitrogênio.

Dispense 1,5 mililitros de hexametil dilano na lâmina de vidro. Com uma pipeta de plástico, espalhar o hexametil dilano girando a lâmina sucessivamente a 500 RPM por cinco segundos e a 1500 RPM por 30 segundos. Quando terminar, asse a lâmina em uma chapa quente a 115 graus Celsius por sete minutos e deixe esfriar por cinco minutos.

Em seguida, dispense quatro mililitros de uma foto positiva. Resista na lâmina de vidro. Espalhe a fotorresistência girando o slide usando as condições descritas anteriormente.

Asse a lâmina em uma chapa quente a 115 graus Celsius por 1,5 minutos e remova-a após a exposição aos raios UV e o cozimento. Dissolva a foto exposta. Resista submergindo o slide em uma foto positiva.

Resista ao revelador por pelo menos 3,5 minutos. Quando terminar, enxágue bem a lâmina com água DI e inspecione os padrões desenvolvidos sob um microscópio óptico. Em seguida, carregue as amostras em uma máquina de pulverização catódica que possa depositar ouro, prata e cromo de forma independente.

Limpe as amostras por 90 segundos a 50 watts sob uma atmosfera de processamento de Argonne de 25 militorr antes de iniciar a deposição de metal sob cromo de pulverização catódica de Argonne de 10 militorr por 10 minutos a 300 watts. Em seguida, pulverize ouro por 90 segundos a 400 watts, seguido por co sputtering ouro e prata por 10 minutos com prata a 200 watts e ouro a 100 watts. Desligue a fonte de pulverização catódica de ouro aproximadamente 10 segundos antes de desligar a fonte de pulverização catódica de prata.

Remova as amostras da máquina de pulverização catódica após remover as amostras da máquina de pulverização catódica. Sonicá-los em cerca de 180 mililitros de uma foto positiva. Resista ao removedor por 10 ciclos de 22ª sonicação com pausas de dois minutos entre os ciclos.

Quando terminar, lave as amostras com di água e seque-as com uma pistola de nitrogênio. Inspecione os padrões de metal sob um microscópio. Em seguida, retire o estêncil de elastômero das amostras revestidas sem fotorresistência usando duas pinças para revelar o metal depositado.

Trate as pequenas lamínulas com plasma de ar a 10 watts por 30 segundos antes de mergulhá-las em ácido nítrico. De liga as lâminas do microscópio submergindo-as em um béquer de ácido nítrico a 70% a 55 graus Celsius por 15 minutos. Uma vez que a liga esteja completa, enxágue as amostras mergulhando-as sucessivamente em béqueres de di água três vezes cada.

Coloque as amostras em toalhas sem fiapos e seque-as com uma pistola de nitrogênio. Ajuste a temperatura de uma placa quente entre 150 e 300 graus Celsius. Em seguida, abaixe as amostras lentamente na superfície quente para minimizar a mudança repentina de temperatura.

Após cinco minutos, retire as amostras da placa de aquecimento para arrefecer. Coloque as amostras de ouro nanoporoso em placas de poliestireno e trate-as com plasma de ar a 10 watts por 30 segundos. Em seguida, transfira as amostras para placas de cultura de tecidos de 24 poços.

Adicione 500 microlitros de meios de cultura completos a cada um. Armazene bem as placas em uma incubadora umidificada a 37 graus Celsius e 5%CO2 até semear as células. Manter as células dos astrócitos murinos em frascos T 75 com meios de cultura.

Quando as células estiverem 70% confluentes, passe-as removendo primeiro a mídia antiga e lavando as células com PBS. Consulte o protocolo de texto para obter detalhes sobre as condições de passagem. Depois de remover as placas de cultura da incubadora, aspire o meio gasto dos poços e semeie as células no vidro.

Lamínulas com densidade de 25.000 células por centímetro quadrado com volume final de um mililitro. Agite a placa de cultura para garantir um revestimento uniforme de células sobre as amostras e coloque a placa de cultura na incubadora quando as células estiverem prontas para serem analisadas. Remova o meio gasto dos poços e lave-os duas vezes com PBS.

Uma vez que as células tenham sido fixadas em 4% de formaldeído em PBS e lavadas duas vezes, perme-as em 500 microlitros de 0,1% Triton X 100 em PBS por cinco minutos. Repita a lavagem com PBS duas vezes e transfira as células para poços limpos. Seque 80 microlitros da solução de coloração nas amostras e guarde-as cobertas com papel alumínio por 20 minutos.

Após outra lavagem de PBS, contra-core as células com três nanomolares de DPI em PBS por cinco minutos. Lave as células com PBS mais uma vez e mergulhe-as em di e monte as células no vidro. Cubra as lâminas com mídia de montagem e sele-as com uma imagem clara de esmalte.

O ouro nanoporoso surge com um microscópio eletrônico de varredura com ampliação de 50.000 x a 10 quilovolts de energia de elétrons usando um detector de elétrons secundário. Em seguida, capture imagens de células compostas em diferentes pontos das amostras usando um microscópio de fluorescência invertida com ampliação de 10 x com os cubos de filtro apropriados. Abra as imagens na imagem J.Divida as imagens em canais individuais.

Converta-os em oito lances. Subtraia o plano de fundo e suavize-o por meio da filtragem mediana. Em seguida, ajuste o limite manualmente para destacar os poros, corpos celulares e núcleos.

Use o comando watershed para separar poros ou células mesclados. Defina os parâmetros de análise de partículas e execute o comando para extrair o número de partículas, a área média e a porcentagem de cobertura por partículas. Por fim, modifique os arquivos de macro incluídos para realizar a análise em lote de várias imagens.

A mudança de cor dos padrões de metal depositados antes e depois da liga d é exibida aqui. O acabamento prateado é devido ao teor de liga rica em prata na liga. O filme adquire uma tonalidade marrom visivelmente alaranjada.

Aqui são mostradas as características mais sutis produzidas pela fotolitografia. Padronização do metal. Diferentes morfologias pobres podem ser obtidas pelo tratamento térmico dos filmes de ouro nanoporosos.

A imagem da seção transversal revela se os filmes são de liga uniformemente através da espessura do filme. As imagens do microscópio eletrônico de varredura podem ser segmentadas em imagens binárias para determinar o tamanho e a porcentagem de cobertura por vazios. O código para gerar essa saída pode ser baixado da página da JoVE.

Uma imagem de fluorescência representativa de células de astrócitos murinos aderentes cultivadas em uma superfície de ouro nanoporoso é retratada aqui. Os canais individuais da imagem podem ser divididos e segmentados para produzir imagens binárias para analisar a interação do material celular. Imagens segmentadas do citoesqueleto podem ser usadas para quantificar a área celular e a cobertura da superfície.

Enquanto as imagens segmentadas do núcleo celular são úteis para a contagem de células. Os códigos para gerar essas saídas podem ser baixados da página da JoVE. Aqui é mostrado um resumo visual das falhas na fabricação de estruturas de ouro nanoporoso, incluindo adesão de filme PO, ausência de porosidade e tratamento térmico excessivo.

Seguindo este procedimento, outros métodos sugerem que a caracterização eletroquímica em microscopia florestal, lise celular e PCR podem ser realizadas para responder a perguntas adicionais, como o efeito da adesão celular da nanoestrutura e da expressão gênica. Depois de assistir a este vídeo, você deve ter uma boa compreensão de como produzir padrões de ouro de nanoporos e quantificar suas interações com as células por meio da análise de imagem digital de microscopia. Resultados. Não se esqueça de que trabalhar com ácido nítrico, ácido sulfúrico e peróxido de hidrogênio pode ser extremamente perigoso e precauções como o cultivo de equipamentos de proteção individual devem sempre ser tomadas durante a execução deste procedimento.