Uma Introdução à Transfecção
Transfecção é o processo de inserção de material genético, como DNA e RNA duplo encalhado, em células de mamíferos. A inserção do DNA em uma célula pe…
Transfecção é o processo de inserção de material genético, como DNA e RNA duplo encalhado, em células de mamíferos. A inserção do DNA permite a expressão, ou produção, de proteínas usando as próprias máquinas das células. Considerando que a inserção de RNA de duplar encalha é usada para interromper a produção de uma proteína específica, interrompendo a tradução. Esta poderosa ferramenta permitiu aos pesquisadores estudar melhor a função genética e a expressão, a função proteica e as mutações genéticas.
Nenhum reagente ou método de transfecção única funciona para todos os tipos de células. Felizmente, muitos métodos e reagentes foram desenvolvidos nas últimas décadas para facilitar a transfecção de uma grande variedade de células. Esses métodos podem ser separados em dois grupos principais: transfecções químicas e físicas.
Neste vídeo, vamos focar nos diferentes sistemas de entrega química, pois eles se tornaram cada vez mais comuns nos últimos anos. Esses métodos incluem abordagens baseadas em lipídios, transfecção mediada por fosfato de cálcio e o uso de polímeros cônicos para citar alguns.
O princípio subjacente de todos os métodos de transfecção química são semelhantes. Todos eles fazem uso de moléculas portadoras carregadas positivamente que se complexam com ácidos nucleicos para empacotá-los para entrega celular. Essas moléculas portadoras superam a carga negativa da barreira celular-membrana que lhes permite passar pela membrana para entregar seu conteúdo.
Na transfecção lipídica, lipídios cáticos formam um lipossomo que se combina com ácidos nucleicos para formar um "complexo de transfecção". Enquanto fosfato de cálcio simplesmente condensa o DNA e dá-lhe uma carga positiva líquida. Além disso, polímeros cônicos como a polielegina condensam o DNA em partículas positivamente carregadas.
O próximo passo na transfecção mediada química é a fixação dos complexos carregados positivamente à membrana celular carregada negativamente através de simples atração eletrostática.
Em seguida, o complexo entra na célula através da endocitose - um processo pelo qual as moléculas entram na célula através de vesículas ligadas à membrana chamadas endosários.
Uma vez dentro da célula, os ácidos nucleicos devem escapar do endossomo por um processo que ainda é desconhecido. Uma vez fora do endosomismo, os ácidos nucleicos se encontrarão no citoplasma da célula e, finalmente, no núcleo, onde o maquinário da célula é capaz de fazer mRNA e, em seguida, proteína a partir dele. O citoplasma é o local de ação para o pequeno RNA interferindo, ou siRNA, onde reduz a produção de proteína interferindo em uma parte do maquinário produtor de proteínas da célula.
DNA transfectado pode existir de forma estável ou transitória. Transfecções estáveis ocorrem quando o DNA transfectado é introduzido no genoma e, portanto, persiste à medida que a célula se divide. Transfecções transitórias ocorrem onde o DNA não é incorporado ao genoma e a expressão da proteína codificada é perdida durante um período de cerca de 24-96 horas.
A eficiência da transfecção de DNA é tipicamente medida através de sistemas de repórteres que estão amarrados ao gene inserido. São sistemas que podem ser facilmente detectados, seja observando diretamente a própria proteína repórter, como no caso da proteína fluorescente verde, seja por sua medição de sua atividade enzimática usando um ensaio colorimétrico, como no caso de um repórter enzimático de luciferase. A transfecção estável do DNA é melhor medida por análise genômica, como o RT-PCR.
Para medir o sucesso do silenciamento do siRNA, os níveis de proteína direcionados em cada amostra podem ser determinados pelo Immunoblot. A transfecção bem-sucedida do siRNA deve diminuir a expressão da proteína alvo dentro das células, enquanto os níveis do gene de limpeza, GAPDH, permanecem estáveis.
Para maximizar a eficiência da transfecção, as células devem ser mantidas no crescimento da fase de registro e estar entre 40 e 80% confluentes, no momento da transfecção. Para conseguir isso, as células da cultura devem ser colhidas no dia anterior... Contado... e semeada em uma placa multi-poço em uma concentração que produzirá o nível correto de confluência no momento da transfecção.
Em seguida, os reagentes químicos e ácidos nucleicos são misturados e dado tempo para formar os complexos nucleicos ácido-reagente. Para cada sistema de entrega química, as concentrações específicas de cada componente devem ser otimizadas.
Os complexos nucleicos ácido-reagente são então adicionados às células banhadas e incubados muitas vezes durante a noite para dar tempo de sobra para os complexos se conectarem às células e mediarem a transfecção. Após 24 horas, a mídia deve ser removida e substituída por novas mídias culturais.
Existem muitas variações e aplicações de transfecção. A co-transfecção pode permitir que um pesquisador estude o efeito de mutações missenses na função das proteínas celulares. Aqui, o RNAi foi transfectado em células HeLa, a fim de diminuir a proteína brca1 endógena, o que causa uma redução no número de células positivas de GFP. Ao mesmo tempo, uma proteína MUTANTe BRCA1 também foi transfeinada e produzida pela célula. Se a proteína mutada estava totalmente funcional, causou uma recuperação no número de células positivas de GFP, mas se a mutação afetou negativamente a função, então o número de células positivas de GFP permaneceu baixo.
Como alternativa aos métodos de transfecção química, um pesquisador, mostrado aqui, usa uma arma genética para disparar partículas de ouro atadas com DNA em células na cultura. Células que acabam com as pequenas balas revestidas de DNA dentro de seu citoplasma têm uma boa chance de se tornarem transfeccionadas.
Outro método alternativo para transfecção é a eletroporação. A eletroporação é o uso de corrente elétrica para danificar a membrana da célula permitindo que o DNA ou RNA entrem na célula por um curto período de tempo antes que as células tenham tempo para reparar. Aqui, eletrodos de pinça são colocados em torno de um cérebro de rato e pulsos curtos de eletricidade são passados através do cérebro para iniciar a transfecção ex-vivo das moléculas RNAi injetadas dentro da solução azul. Observa-se então os efeitos do silenciamento genético na estrutura do córtex em desenvolvimento.
Você acabou de ver o vídeo do JoVE sobre transfecção. Como sempre, obrigado por assistir!
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Transfecção é o processo de inserção de material genético, como DNA e RNA duplo encalhado, em células de mamíferos. A inserção do DNA permite a expressão, ou produção, de proteínas usando as próprias máquinas das células. Considerando que a inserção de RNA de duplar encalha é usada para interromper a produção de uma proteína específica, interrompendo a tradução. Esta poderosa ferramenta permitiu aos pesquisadores estudar melhor a função genética e a expressão, a função proteica e as mutações genéticas.
Nenhum reagente ou método de transfecção única funciona para todos os tipos de células. Felizmente, muitos métodos e reagentes foram desenvolvidos nas últimas décadas para facilitar a transfecção de uma grande variedade de células. Esses métodos podem ser separados em dois grupos principais: transfecções químicas e físicas.
Neste vídeo, vamos focar nos diferentes sistemas de entrega química, pois eles se tornaram cada vez mais comuns nos últimos anos. Esses métodos incluem abordagens baseadas em lipídios, transfecção mediada por fosfato de cálcio e o uso de polímeros cônicos para citar alguns.
O princípio subjacente de todos os métodos de transfecção química são semelhantes. Todos eles fazem uso de moléculas portadoras carregadas positivamente que se complexam com ácidos nucleicos para empacotá-los para entrega celular. Essas moléculas portadoras superam a carga negativa da barreira celular-membrana que lhes permite passar pela membrana para entregar seu conteúdo.
Na transfecção lipídica, lipídios cáticos formam um lipossomo que se combina com ácidos nucleicos para formar um "complexo de transfecção". Enquanto fosfato de cálcio simplesmente condensa o DNA e dá-lhe uma carga positiva líquida. Além disso, polímeros cônicos como a polielegina condensam o DNA em partículas positivamente carregadas.
O próximo passo na transfecção mediada química é a fixação dos complexos carregados positivamente à membrana celular carregada negativamente através de simples atração eletrostática.
Em seguida, o complexo entra na célula através da endocitose - um processo pelo qual as moléculas entram na célula através de vesículas ligadas à membrana chamadas endosários.
Uma vez dentro da célula, os ácidos nucleicos devem escapar do endossomo por um processo que ainda é desconhecido. Uma vez fora do endosomismo, os ácidos nucleicos se encontrarão no citoplasma da célula e, finalmente, no núcleo, onde o maquinário da célula é capaz de fazer mRNA e, em seguida, proteína a partir dele. O citoplasma é o local de ação para o pequeno RNA interferindo, ou siRNA, onde reduz a produção de proteína interferindo em uma parte do maquinário produtor de proteínas da célula.
DNA transfectado pode existir de forma estável ou transitória. Transfecções estáveis ocorrem quando o DNA transfectado é introduzido no genoma e, portanto, persiste à medida que a célula se divide. Transfecções transitórias ocorrem onde o DNA não é incorporado ao genoma e a expressão da proteína codificada é perdida durante um período de cerca de 24-96 horas.
A eficiência da transfecção de DNA é tipicamente medida através de sistemas de repórteres que estão amarrados ao gene inserido. São sistemas que podem ser facilmente detectados, seja observando diretamente a própria proteína repórter, como no caso da proteína fluorescente verde, seja por sua medição de sua atividade enzimática usando um ensaio colorimétrico, como no caso de um repórter enzimático de luciferase. A transfecção estável do DNA é melhor medida por análise genômica, como o RT-PCR.
Para medir o sucesso do silenciamento do siRNA, os níveis de proteína direcionados em cada amostra podem ser determinados pelo Immunoblot. A transfecção bem-sucedida do siRNA deve diminuir a expressão da proteína alvo dentro das células, enquanto os níveis do gene de limpeza, GAPDH, permanecem estáveis.
Para maximizar a eficiência da transfecção, as células devem ser mantidas no crescimento da fase de registro e estar entre 40 e 80% confluentes, no momento da transfecção. Para conseguir isso, as células da cultura devem ser colhidas no dia anterior... Contado... e semeada em uma placa multi-poço em uma concentração que produzirá o nível correto de confluência no momento da transfecção.
Em seguida, os reagentes químicos e ácidos nucleicos são misturados e dado tempo para formar os complexos nucleicos ácido-reagente. Para cada sistema de entrega química, as concentrações específicas de cada componente devem ser otimizadas.
Os complexos nucleicos ácido-reagente são então adicionados às células banhadas e incubados muitas vezes durante a noite para dar tempo de sobra para os complexos se conectarem às células e mediarem a transfecção. Após 24 horas, a mídia deve ser removida e substituída por novas mídias culturais.
Existem muitas variações e aplicações de transfecção. A co-transfecção pode permitir que um pesquisador estude o efeito de mutações missenses na função das proteínas celulares. Aqui, o RNAi foi transfectado em células HeLa, a fim de diminuir a proteína brca1 endógena, o que causa uma redução no número de células positivas de GFP. Ao mesmo tempo, uma proteína MUTANTe BRCA1 também foi transfeinada e produzida pela célula. Se a proteína mutada estava totalmente funcional, causou uma recuperação no número de células positivas de GFP, mas se a mutação afetou negativamente a função, então o número de células positivas de GFP permaneceu baixo.
Como alternativa aos métodos de transfecção química, um pesquisador, mostrado aqui, usa uma arma genética para disparar partículas de ouro atadas com DNA em células na cultura. Células que acabam com as pequenas balas revestidas de DNA dentro de seu citoplasma têm uma boa chance de se tornarem transfeccionadas.
Outro método alternativo para transfecção é a eletroporação. A eletroporação é o uso de corrente elétrica para danificar a membrana da célula permitindo que o DNA ou RNA entrem na célula por um curto período de tempo antes que as células tenham tempo para reparar. Aqui, eletrodos de pinça são colocados em torno de um cérebro de rato e pulsos curtos de eletricidade são passados através do cérebro para iniciar a transfecção ex-vivo das moléculas RNAi injetadas dentro da solução azul. Observa-se então os efeitos do silenciamento genético na estrutura do córtex em desenvolvimento.
Você acabou de ver o vídeo do JoVE sobre transfecção. Como sempre, obrigado por assistir!
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Q1: What is the difference between transfecting DNA and RNA into cells?
DNA transfection enables protein expression using the cell's machinery, while RNA transfection, particularly double-stranded RNA or siRNA, shuts down specific protein production by stopping translation. DNA must reach the nucleus for effective expression, whereas RNA acts in the cytoplasm. DNA can be stably incorporated into the genome or transiently expressed, while RNA effects are temporary.
Q2: How do chemical transfection methods deliver genetic material into cells?
Chemical transfection uses positively charged carrier molecules—such as cationic lipids, calcium phosphate, or polymers—that complex with negatively charged nucleic acids. These complexes attach to the negatively charged cell membrane through electrostatic attraction, then enter via endocytosis in membrane-bound vesicles called endosomes. The nucleic acids escape the endosome and reach their destination in the cytoplasm or nucleus.
Q3: What cell conditions optimize transfection efficiency?
Cells should be in log phase growth and between 40 and 80% confluent at transfection time. Prepare cells by harvesting them the day before, counting them, and seeding at appropriate concentration. After adding nucleic acid-reagent complexes, incubate overnight to allow attachment and transfection. Replace media with fresh culture after 24 hours to support cell recovery and gene expression.
Q4: How is transfection efficiency measured in cells?
Reporter systems tethered to inserted genes measure DNA transfection efficiency. Green fluorescent protein can be directly observed, while luciferase enzyme activity is measured using colorimetric assays. Stable transfection is verified by genomic analysis such as RT-PCR. For siRNA silencing success, immunoblot analysis determines target protein levels; successful transfection decreases target protein while housekeeping genes like GAPDH remain stable.
Q5: What is the difference between stable and transient transfection?
Stable transfection occurs when transfected DNA integrates into the genome and persists through cell division, creating permanent genetic changes. Transient transfection involves DNA that remains outside the genome, resulting in temporary protein expression lasting 24 to 96 hours before being lost. Stable transfection is measured by genomic analysis, while transient effects are detected through reporter systems.
Q6: What are alternative physical methods for transfecting cells?
Electroporation uses electrical current to temporarily damage the cell membrane, allowing DNA or RNA entry before cells repair. A gene gun fires gold particles coated with DNA directly into cells; particles reaching the cytoplasm enable transfection. These physical methods complement chemical approaches and are useful for cell types resistant to chemical reagents or for in vivo applications like brain tissue transfection.
Q7: How can co-transfection be used to study protein mutations?
Co-transfection simultaneously introduces interfering RNA and mutant DNA into the same cell. RNAi down-regulates the endogenous protein while the transfected mutant version is produced. Comparing functional outcomes—such as recovery of fluorescent reporter signals—reveals whether the mutation preserves or impairs protein function. This approach enables direct assessment of mutation effects on cellular processes.