Name: Usando um sistema automatizado de rastreamento 3D para registrar indivíduos e cardumes de peixes-zebra adultos (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-12-05T16:00:00.000+00:00
Duration: 14 min 3 s
Description: Aprenda a usar um sistema automatizado de rastreamento 3D para registrar movimentos de peixes-zebra adultos e analisar padrões cinemáticos, espaciais e sociais. Este método permite detectar alterações comportamentais causadas por fatores genéticos ou ambientais.

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Os autores não têm agradecimentos.

<ol><li>Brennan, C. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Zebrafish+behavioural+assays+of+translational+relevance+for+the+study+of+psychiatric+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Rev.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Zebrafish behavioural assays of translational relevance for the study of psychiatric disease.</a> Rev. Neurosci. 22, 37-48 (2011).</li>
<li>Kabashi, E., Brustein, E., Champagne, N., Drapeau, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Zebrafish+models+for+the+functional+genomics+of+neurogenetic+disorders%5BTitle%5D)+AND+%22Biochim.+Biophys.+Acta%22%5BJournal%5D)">Zebrafish models for the functional genomics of neurogenetic disorders.</a> Biochim. Biophys. Acta. 1812, 335-345 (2011).</li>
<li>McCollum, C. W., Ducharme, N. A., Bondesson, M., Gustafsson, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Developmental+toxicity+screening+in+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Birth.+Defects.+Res.+C.+Embryo+Today%22%5BJournal%5D)">Developmental toxicity screening in zebrafish.</a> Birth. Defects. Res. C. Embryo Today. 93, 67-114 (2011).</li>
<li>Kurta, A., Palestis, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+ethanol+on+the+shoaling+behavior+of+zebrafish+%28Danio+rerio%29%5BTitle%5D)+AND+%22Dose-Response%22%5BJournal%5D)">Effects of ethanol on the shoaling behavior of zebrafish (Danio rerio).</a> Dose-Response. 8, 527-533 (2010).</li>
<li>Sison, M., Gerlai, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Behavioral+performance+altering+effects+of+MK-801+in+zebrafish+%28Danio+rerio%29%5BTitle%5D)+AND+%22Behav.+Brain+Res%22%5BJournal%5D)">Behavioral performance altering effects of MK-801 in zebrafish (Danio rerio).</a> Behav. Brain Res. 220, 331-337 (2011).</li>
<li>Delcourt, J., Denoël, M., Ylieff, M., Poncin, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Video+multitracking+of+fish+behaviour%3A+a+synthesis+and+future+perspectives%5BTitle%5D)+AND+%22Fish+Fish%22%5BJournal%5D)">Video multitracking of fish behaviour: a synthesis and future perspectives.</a> Fish Fish. 14, 186-204 (2013).</li>
<li>Zhu, L., Weng, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Catadioptric+stereo-vision+system+for+the+real-time+monitoring+of+3D+behavior+in+aquatic+animals%5BTitle%5D)+AND+%22Physiol.+Behav%22%5BJournal%5D)">Catadioptric stereo-vision system for the real-time monitoring of 3D behavior in aquatic animals.</a> Physiol. Behav. 91, 106-119 (2007).</li>
<li>System for 3D monitoring and analysis of motion behavior of targets. US patent. , 8306260 (2012).</li>
<li>Cachat, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Three-dimensional+neurophenotyping+of+adult+zebrafish+behavior%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+ONE%22%5BJournal%5D)">Three-dimensional neurophenotyping of adult zebrafish behavior.</a> PLoS ONE. 6, e17597(2011).</li>
<li>Maaswinkel, H., Zhu, L., Weng, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+immediate+and+the+delayed+effects+of+buspirone+on+zebrafish+%28Danio+rerio%29+in+an+open+field+test%3A+a+3-D+approach%5BTitle%5D)+AND+%22Behav.+Brain+Res%22%5BJournal%5D)">The immediate and the delayed effects of buspirone on zebrafish (Danio rerio) in an open field test: a 3-D approach.</a> Behav. Brain Res. 234, 365-374 (2012).</li>
<li>Maaswinkel, H., Le, X., He, L., Zhu, L., Weng, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dissociating+the+effects+of+habituation%2C+black+walls%2C+buspirone+and+ethanol+on+anxiety-like+behavioral+responses+in+shoaling+zebrafish.+A+3D+approach+to+social+behavior%5BTitle%5D)+AND+%22Pharmacol.+Biochem.+Behav%22%5BJournal%5D)">Dissociating the effects of habituation, black walls, buspirone and ethanol on anxiety-like behavioral responses in shoaling zebrafish. A 3D approach to social behavior.</a> Pharmacol. Biochem. Behav. 108, 16-27 (2013).</li>
<li>Maaswinkel, H., Zhu, L., Weng, W. The advantages of a 3D-automatic recording system for the study of shoaling behavior in zebrafish. 10th International Conference Zebrafish Development and Genetics, Madison, , (2012).</li>
<li>Maaswinkel, H., Zhu, L., Weng, W. An automatic recording system to quantify antagonistic interactions between zebrafish. Abstract. 10th International Conference Zebrafish Development and Genetics, Madison, , (2012).</li>
<li>Spence, R., Gerlach, G., Lawrence, C., Smith, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+behaviour+and+ecology+of+the+zebrafish%2C+Danio+rerio%5BTitle%5D)+AND+%22Biol.+Rev.+Camb.+Phil.+Soc%22%5BJournal%5D)">The behaviour and ecology of the zebrafish, Danio rerio.</a> Biol. Rev. Camb. Phil. Soc. 83, 13-34 (2008).</li>
<li>Krause, J., Hartmann, N., Pritchard, V. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+influence+of+nutritional+state+on+shoal+choice+in+zebrafish%2C+Danio+rerio%5BTitle%5D)+AND+%22Anim.+Behav%22%5BJournal%5D)">The influence of nutritional state on shoal choice in zebrafish, Danio rerio.</a> Anim. Behav. 57, 771-775 (1999).</li>
<li>Speedie, N., Gerlai, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Alarm+substance+induced+behavioral+responses+in+zebrafish+%28Danio+rerio%29%5BTitle%5D)+AND+%22Behav.+Brain+Res%22%5BJournal%5D)">Alarm substance induced behavioral responses in zebrafish (Danio rerio).</a> Behav. Brain Res. 188, 168-177 (2008).</li>
<li>Gebauer, D. L., Pagnussat, N., Piato, A. L., Schaeffer, I. C., Bonan, C. D., Lara, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+anxiolytics+in+zebrafish%3A+similarities+and+differences+between+benzodiazepines%2C+buspirone+and%5BTitle%5D)+AND+%22%22%5BJournal%5D)">Effects of anxiolytics in zebrafish: similarities and differences between benzodiazepines, buspirone and.</a> 99, 480-486 (2011).</li>
<li>Paull, G. C., Filby, A. L., Giddins, H. G., Coe, T. S., Hamilton, P. B., Tyler, C. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dominance+hierarchies+in+zebrafish+%28Danio+rerio%29+and+their+relationship+with+reproductive+success%5BTitle%5D)+AND+%22Zebrafish%22%5BJournal%5D)">Dominance hierarchies in zebrafish (Danio rerio) and their relationship with reproductive success.</a> Zebrafish. 7, 109-117 (2010).</li>
<li>Engeszer, R. E., Ryan, M. J., Parichy, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Learned+social+preference+in+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Biol%22%5BJournal%5D)">Learned social preference in zebrafish.</a> Curr. Biol. 14, 881-884 (2004).</li>
<li>Mathur, P., Guo, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Use+of+zebrafish+as+a+model+to+understand+mechanisms+of+addiction+and+complex+neurobehavioral+phenotypes%5BTitle%5D)+AND+%22Neurobiol.+Dis%22%5BJournal%5D)">Use of zebrafish as a model to understand mechanisms of addiction and complex neurobehavioral phenotypes.</a> Neurobiol. Dis. 40, 66-72 (2010).</li>
<li>Tropepe, V., Sive, H. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Can+zebrafish+be+used+as+a+model+to+study+the+neurodevelopmental+causes+of+autism%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+Brain+Behav%22%5BJournal%5D)">Can zebrafish be used as a model to study the neurodevelopmental causes of autism.</a> Genes Brain Behav. 2, 268-281 (2003).</li>
<li>Echevarria, D. J., Hammack, C. M., Pratt, D. W., Hosemann, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+behavioral+test+battery+to+assess+global+drug+effects+using+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Int.+J.+Comp.+Psychol%22%5BJournal%5D)">A novel behavioral test battery to assess global drug effects using zebrafish.</a> Int. J. Comp. Psychol. 21, 19-34 (2008).</li>
<li>Seibt, K. J., Piato, A. L., Luz Oliveira, da, Capiotti, R., Vianna, K. M., R, M., Bonan, C. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Antipsychotic+drugs+reverse+MK-801+induced+cognitive+and+social+interaction+deficits+in+zebrafish+%28Danio+rerio%29%5BTitle%5D)+AND+%22Behav.+Brain.+Res%22%5BJournal%5D)">Antipsychotic drugs reverse MK-801 induced cognitive and social interaction deficits in zebrafish (Danio rerio).</a> Behav. Brain. Res. 224, 135-139 (2011).</li>
<li>Zou, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Low+dose+MK-801+reduces+social+investigation+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Pharmacol.+Biochem.+Behav%22%5BJournal%5D)">Low dose MK-801 reduces social investigation in mice.</a> Pharmacol. Biochem. Behav. 90, 753-757 (2008).</li>
<li>Ng, M. C., Hsu, C. P., Wu, Y. J., Wu, S. Y., Yang, Y. L., Lu, K. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effect+of+MK-801-induced+impairment+of+inhibitory+avoidance+learning+in+zebrafish+via+inactivation+of+extracellular+signal-regulated+kinase+%28ERK%29+in+telencephalon%5BTitle%5D)+AND+%22Fish+Physiol.+Biochem%22%5BJournal%5D)">Effect of MK-801-induced impairment of inhibitory avoidance learning in zebrafish via inactivation of extracellular signal-regulated kinase (ERK) in telencephalon.</a> Fish Physiol. Biochem. 38, 1099-1106 (2012).</li>
<li>Sison, M., Gerlai, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Associative+learning+performance+is+impaired+in+zebrafish+%28Danio+rerio%29+by+the+NMDA-R+antagonist+MK-801%5BTitle%5D)+AND+%22Neurobiol.+Learn.+Mem%22%5BJournal%5D)">Associative learning performance is impaired in zebrafish (Danio rerio) by the NMDA-R antagonist MK-801.</a> Neurobiol. Learn. Mem. 96, 230-237 (2011).</li>
<li>Swain, H. A., Sigstad, C., Scalzo, F. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+dizocilpine+%28MK-801%29+on+circling+behavior%2C+swimming+activity%2C+and+place+preference+in+zebrafish+%28Danio+rerio%29%5BTitle%5D)+AND+%22Neurotox.+Teratol%22%5BJournal%5D)">Effects of dizocilpine (MK-801) on circling behavior, swimming activity, and place preference in zebrafish (Danio rerio).</a> Neurotox. Teratol. 26, 725-729 (2004).</li>
<li>Vezzani, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Kinetics+of+MK-801+and+its+effect+on+quinolinic+acid-induced+seizures+and+neurotoxicity+in+rats%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Pharmacol.+Exp.+Ther%22%5BJournal%5D)">Kinetics of MK-801 and its effect on quinolinic acid-induced seizures and neurotoxicity in rats.</a> J. Pharmacol. Exp. Ther. 249, 278-283 (1989).</li>
<li>Green, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Automated+high-throughput+neurophenotyping+of+zebrafish+social+behavior%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci.+Methods%22%5BJournal%5D)">Automated high-throughput neurophenotyping of zebrafish social behavior.</a> J. Neurosci. Methods. 210, 266-271 (2012).</li>
<li>Rung, J. P., Carlsson, A., Rydén Markinhuhta, K., Carlsson, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((+%28%2B%29-MK-801+induced+social+withdrawal+in+rats%3B+a+model+for+negative+symptoms+of+schizophrenia%5BTitle%5D)+AND+%22Prog.+Neuro-psychopharmacol.+Biol.+Psych%22%5BJournal%5D)"> (+)-MK-801 induced social withdrawal in rats; a model for negative symptoms of schizophrenia.</a> Prog. Neuro-psychopharmacol. Biol. Psych. 29, 827-832 (2005).</li>
<li>Gururajan, A., Taylor, D. A., Malone, D. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cannabidiol+and+clozapine+reverse+MK-801-induced+deficits+in+social+interaction+and+hyperactivity+in+Sprague-Dawley+rats%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Psychopharmacol%22%5BJournal%5D)">Cannabidiol and clozapine reverse MK-801-induced deficits in social interaction and hyperactivity in Sprague-Dawley rats.</a> J. Psychopharmacol. 226, 1317-1332 (2012).</li>
<li>Burket, J. A., Cannon, W. R., Jacome, L. F., Deutsch, S. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MK-801%2C+a+noncompetitive+NMDA+receptor+antagonist%2C+elicits+circling+behavior+in+the+genetically+inbred+Balb%2Fc+mouse+strain%5BTitle%5D)+AND+%22Brain+Res.+Bull%22%5BJournal%5D)">MK-801, a noncompetitive NMDA receptor antagonist, elicits circling behavior in the genetically inbred Balb/c mouse strain.</a> Brain Res. Bull. 83, 337-339 (2010).</li>
<li>Saunders, J. A., Gandal, M. J., Roberts, T. P., Siegel, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((NMDA+antagonist+MK801+recreates+auditory+electrophysiology+disruption+present+in+autism+and+other+neurodevelopmental+disorders%5BTitle%5D)+AND+%22Behav.+Brain+Res%22%5BJournal%5D)">NMDA antagonist MK801 recreates auditory electrophysiology disruption present in autism and other neurodevelopmental disorders.</a> Behav. Brain Res. 234, 233-237 (2012).</li>
<li>Brosda, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pharmacological+and+parametrical+investigation+of+prepulse+inhibition+of+startle+and+prepulse+elicited+reactions+in+Wistar+rats%5BTitle%5D)+AND+%22Pharmacol.+Biochem.+Behav%22%5BJournal%5D)">Pharmacological and parametrical investigation of prepulse inhibition of startle and prepulse elicited reactions in Wistar rats.</a> Pharmacol. Biochem. Behav. 99, 22-28 (2011).</li>
<li>Wong, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analyzing+habituation+responses+to+novelty+in+zebrafish+%28Danio+rerio%29%5BTitle%5D)+AND+%22Behav.+Brain+Res%22%5BJournal%5D)">Analyzing habituation responses to novelty in zebrafish (Danio rerio).</a> Behav. Brain Res. 208, 450-457 (2010).</li>
<li>Maximino, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Parametric+analyses+of+anxiety+in+zebrafish+scototaxis%5BTitle%5D)+AND+%22Behav.+Brain+Res%22%5BJournal%5D)">Parametric analyses of anxiety in zebrafish scototaxis.</a> Behav. Brain Res. 210, 1-7 (2010).</li>
<li>Blaser, R. E., Rosemberg, D. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Measures+of+anxiety+in+zebrafish+%28Danio+rerio%29%3A+dissociation+of+black%2Fwhite+preference+and+novel+tank+test%5BTitle%5D)+AND+%22PloS+One%22%5BJournal%5D)">Measures of anxiety in zebrafish (Danio rerio): dissociation of black/white preference and novel tank test.</a> PloS One. 7, e36931(2012).</li>
</ol>

Hans Maaswinkel, Liqun Zhu e Wei Weng são funcionários da xyZfish, Ronkonkoma NY, que produz o sistema de rastreamento usado neste artigo.

O procedimento experimental aqui apresentado permite registar peixes-zebra individuais, pares de peixes-zebra (por exemplo, para estudar o acasalamento ou a agressão) e cardumes de peixe-zebra (como mostrado no exemplo representativo). O sistema é especialmente adequado para obter simultaneamente informações sobre distribuição 3D (vertical e horizontal), características cinemáticas (por exemplo, velocidade, aceleração, ângulo de giro) e parâmetros sociais (por exemplo , coesão social). A seguir, listamos algumas questões importantes a serem consideradas ao planejar experimentos.
Dependendo do procedimento experimental, diferentes sistemas comportamentais podem ser estudados. Por exemplo, para explorar a neofobia (ou seja, medo de novos ambientes), a gravação deve ser iniciada imediatamente após a introdução do peixe-zebra no tanque de observação (depois de esperar apenas alguns segundos para que a água se acalme para diminuir o ruído), sem habituação prévia11,17,37. Por outro lado, alguns tópicos de pesquisa podem exigir que o peixe-zebra esteja bem habituado, por exemplo, ao estudar os efeitos dos feromônios de alarme16. Ao estudar grupos de peixes-zebra, o experimentador deve estar ciente de que, embora o software minimize a troca de tags, neste momento não é possível acompanhar o peixe-zebra individual por toda parte. Isso também não é importante para estudos de cardume onde a ênfase está na coesão social, mas seria crucial ao explorar a agressão ou o acasalamento. A reatribuição manual de tags é uma opção, mas pode ser muito demorada.
A cor das paredes do contêiner de observação e da câmara de observação pode ter grande influência no comportamento do peixe-zebra. Por exemplo, paredes brancas foram descritas para induzir respostas de aversão36, 37. Ao experimentar cores diferentes, lembre-se de duas coisas: 1) é importante que a parede frontal (ou seja, a parede mais próxima da câmera) permaneça transparente e que uma tampa (se for usada) também seja transparente; 2) Ao selecionar uma cor nunca usada antes, primeiro determine se o contraste entre o peixe-zebra e o fundo é apropriado para gravação. Faça um teste. Alterar as configurações da câmera para gravação (Ganho, Obturador, Vermelho e Azul, conforme explicado nas etapas 2.5 e 2.6) e as configurações para reconstrução de trajetória (por exemplo, limites de cor e tamanho, conforme explicado nas etapas 3.3, 3.5, 3.11 e 3.12) pode fazer uma grande diferença. Novamente, a experiência com o sistema ajudará muito a decidir o que é possível.
Dependendo do objetivo do experimento, uma fonte de luz com características diferentes (por exemplo, espectro, intensidade) pode ser desejável. As barras de LED podem ser facilmente substituídas. Certifique-se de que a luz atinge todas as partes do recipiente.
Se o experimento exigir que o peixe-zebra permaneça no recipiente de observação por várias horas, certifique-se de fornecer aeração. Um tubo de ar pode ser conectado ao canto direito traseiro usando um clipe. Verifique na tela do computador se o clipe não interfere na gravação, ou seja, que o peixe-zebra nunca está escondido da vista. Nas Figuras 2A e 2B , o clipe preto pode ser visto na vista superior. Idealmente, a aeração deve ser fornecida antes ou entre as gravações, mas não durante a gravação para evitar ruídos. Observe também que ligar ou desligar a aeração forte pode assustar o peixe-zebra.
Se o experimento exigir manter o peixe-zebra no recipiente durante a noite, é útil cobrir a câmara de observação com uma tampa transparente para evitar que o peixe-zebra salte (o que é uma ocorrência muito comum). Se a tampa não for removida antes da gravação (para não perturbar o peixe-zebra), considere os dois pontos a seguir: 1) certifique-se de que as imagens espelhadas das fontes de luz não obstruam a gravação (por exemplo, deslocando as fontes de luz ou escolhendo uma tampa que reflita a luz apenas minimamente); 2) considerar que a tampa pode ficar embaçada quando usada durante a noite, especialmente porque, neste caso, a aeração também deve ser fornecida; Uma maneira de reduzir isso é escolher uma tampa com pequenos orifícios.
Para alguns experimentos, pode ser essencial determinar o comportamento básico do peixe-zebra antes de administrar um medicamento. Nesse caso, o medicamento pode ser adicionado entre as sessões por meio de um tubo (semelhante ao tubo de aeração discutido acima).
Embora o foco aqui tenha sido o registro do peixe-zebra (Danio rerio), outras espécies de peixes também podem, é claro, ser registradas com o sistema. Tem sido usado para estudar comportamentos em peixes dourados (juvenis) (Carassius auratus), farpa de tigre (Barbus tetrazona) e espada verde (Xiphophorus helleri).
Finalmente, deve-se notar que outras dimensões dos tanques de observação são principalmente possíveis. No entanto, seria necessário reconfigurar o sistema e encontrar um bom equilíbrio entre resolução espacial e temporal ao usar contêineres de observação muito maiores. Além disso, a forma do recipiente deve ser cubóide. O número de peixes-zebra ou outros sujeitos experimentais é teoricamente ilimitado; no entanto, a troca de tags aumenta com o número de assuntos.

O peixe-zebra tornou-se um modelo importante para a pesquisa biológica e farmacológica1-3. O rastreamento dos padrões de movimento e distribuição espacial de peixes-zebra individuais e de cardumes de peixes-zebra é inestimável. Estudos mais antigos aplicam quantificação manual com base em imagens gravadas4. Agora, os sistemas automáticos de rastreamento de vídeo 2D são comumente usados5. No entanto, como o peixe-zebra e muitos outros animais aquáticos e não aquáticos se movem em um espaço tridimensional, o interesse em sistemas 3D está crescendo6. O sistema 3D descrito foi publicado pela primeira vez em 20077. Para detalhes técnicos e comparações com outros sistemas, consulte8. A vantagem básica deste sistema em comparação com outros sistemas é que ele adquire duas (opcionalmente três) visualizações síncronas e independentes usando um sistema de espelhamento e que usa um protocolo de calibração em duas etapas. Na primeira etapa, a geometria 3D do sistema estéreo (formado pela câmera e pelos espelhos) é calibrada. Na segunda etapa, os erros não lineares introduzidos pela refração da luz são corrigidos. Ao estudar animais aquáticos, o impacto da refração da luz pode ser considerável quando não corrigido. Outros sistemas publicados até agora (mesmo desenvolvimentos mais recentes9) omitem o procedimento de calibração em duas etapas. Para detalhes técnicos sobre identificação de objetos, oclusão com rastreamento de vários objetos, ruído de jigging, etc. o leitor é encaminhado para as publicações originais8,9. O sistema foi validado para o estudo de respostas comportamentais semelhantes à ansiedade10,11, cardumes8,11,12 e, em estudo preliminar, para comportamento antagônico em peixe-zebra13. Também foi testado para outras espécies de peixes (peixinho dourado8, espada, farpa de tigre) e para camundongos9.
A seguir, os protocolos de calibração e uso do sistema são descritos e os resultados de um experimento que testa os efeitos do antagonista não competitivo do receptor NMDA MK-801 no cardume de peixe-zebra são apresentados como um exemplo representativo para demonstrar o tipo de dados que podem ser obtidos com o sistema.
Tanto no ambiente natural quanto em aquários, o peixe-zebra geralmente nada em cardumes14. As preferências de cardume parecem depender de vários fatores, como criação, sexo e disponibilidade de alimentos14,15. Curiosamente, a distância entre o peixe-zebra individual em um cardume torna-se menor quando sinais de perigo potencial estão presentes, como feromônios de alarme16 ou novidade11. O paradigma do cardume também está sendo usado para testar drogas ansiolíticas17. As hierarquias de dominância18 e a aprendizagem social19 são aspectos fascinantes do comportamento do peixe-zebra. Devido ao seu caráter comportamental social altamente desenvolvido, o peixe-zebra também se tornou de interesse para a pesquisa do autismo20,21.
MK-801 foi relatado para alterar o comportamento social em peixe-zebra5,22,23, o que é uma reminiscência de seus efeitos em mamíferos24. No entanto, o MK-801 também tem muitos outros efeitos em outros comportamentos (como comportamento de natação, evitação inibitória e preferênciade lugar 25-27). Portanto, é crucial, em experimentos iniciais, obter o máximo de informações possível a partir de observações básicas. Isso fornecerá a base para a concepção de experimentos mais direcionados.
Levantamento do aparelho de registo e do software
Em sua configuração atual, o contêiner de observação (25 cm x 25 cm x 18 cm, C x L x A), contendo o peixe-zebra, é posicionado na câmara de observação (91 cm x 46 cm x 56 cm, C x L x A). A câmara também contém uma câmera, um espelho suspenso em um ângulo de aproximadamente >45° acima do recipiente e barras de luz LED. A Figura 1 mostra um diagrama simplificado. A câmera registra a vista frontal e a vista superior (espelho) para construir as trajetórias 3D do peixe-zebra, determinando suas coordenadas x, y e z. Para fins de orientação, os vetores de coordenadas são apresentados no canto frontal esquerdo do contêiner de observação (posição em relação à câmera), que corresponde aos vetores apresentados nas visualizações 3D (por exemplo, Figura 15) geradas pelo Módulo de Reconstrução de Caminho (veja mais abaixo). A taxa de amostragem depende da câmera e do computador. Em nossos experimentos, é de aproximadamente 40 quadros / s (fps). A resolução espacial dos quadros gravados é de 640 x 480 pixels (essa configuração foi escolhida como equilíbrio ideal entre resolução espacial e temporal). É necessário o Windows XP ou superior.
Antes da primeira gravação, o sistema deve ser calibrado para determinar a localização das paredes do recipiente e da superfície da água, para determinar o fator de escala dos quadros gravados e para ajustar o erro considerável gerado pela refração da luz ao passar da água para o ar. Em princípio, a calibração só deve ser realizada durante a instalação inicial e depois que partes da configuração, como câmera ou espelho, forem movidas ou substituídas. No entanto, é uma boa prática verificar periodicamente se a calibração ainda está correta e recalibrar, se necessário.
O software consiste em três módulos. O Módulo de Gravações registra os quadros (dois quadros de exemplo são mostrados na Figura 2). O Módulo de Trajetória reconstrói os caminhos de cada peixe-zebra. O Módulo de Processamento de Dados calcula uma gama de parâmetros cinemáticos e espaciais padrão. Para fins de análise posterior, os dados podem ser importados para planilhas ou software estatístico.

<table><tbody><tr><td>AABT-3D Tracking Hardware</td><td>xyZfish</td><td>AABT II</td><td>Inclui câmera, placa de vídeo, compartimento de observação com espelho e iluminação</td></tr><tr><td>Equipamento de calibração AABT-3D</td><td>xyZfish</td><td></td><td>calib Contém painel de calibração e espelho lateral</td></tr><tr><td>AABT-3D Recipientes</td><td>de observação xyZfish</td><td>cubos</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>AABT-3D software de rastreamento</td><td>xyZfish</td><td>v.1.0</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td></td><td>Computador opcional</td><td>N/A</td><td>Windows XP ou superior</td></tr> <tr><td>(+) -MK-801 maleato de hidrogênio</td><td>Sigma</td><td>M107</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Bomba de ar</td><td>Fusion</td><td>500</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Tubulação de linha de ar 3/16"</td><td>Lee' s Produtos para Aquários e Animais de Estimação</td><td>14508</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Grampos de fichário médios</td><td>OfficeDepot</td><td>561339</td><td>Para anexar a linha aérea ao contêiner de observação</td></tr></tbody></table>

usando um sistema automatizado de rastreamento 3d para registrar indivíduos e cardumes de peixes-zebra adultos

Using an Automated 3D-tracking System to Record Individual and Shoals of Adult Zebrafish

Como muitos animais aquáticos, o peixe-zebra (Danio rerio) se move em um espaço 3D. Portanto, é preferível usar um sistema de gravação 3D para estudar seu comportamento. O sistema de rastreamento automático de vídeo apresentado consegue isso usando um sistema de espelho e um procedimento de calibração que corrige o erro considerável introduzido pela transição da luz da água para o ar. Com este sistema é possível gravar tanto um único quanto grupos de peixes-zebra adultos. Antes de usar, o sistema deve ser calibrado. O sistema consiste em três módulos: Gravação, Reconstrução de Caminho e Processamento de Dados. São apresentados os protocolos passo a passo para calibração e utilização dos três módulos. Dependendo da configuração experimental, o sistema pode ser usado para testar neofobia, aversão branca, coesão social, deficiências motoras, exploração de novos objetos, etc. É especialmente promissor como uma ferramenta de primeiro passo para estudar os efeitos de drogas ou mutações em padrões comportamentais básicos. O sistema fornece informações sobre a distribuição vertical e horizontal do peixe-zebra, sobre os componentes xyz dos parâmetros cinemáticos (como locomoção, velocidade, aceleração e ângulo de giro) e fornece os dados necessários para calcular os parâmetros de coesão social ao testar cardumes.

O uso de um sistema de vídeo automático 3D que pode rastrear indivíduos e grupos de peixes-zebra é descrito. Como exemplo de aplicação, exploramos os efeitos do antagonista do receptor NMDA MK-801 em cardumes de peixe-zebra.

Usando um sistema automatizado de rastreamento 3D para registrar indivíduos e cardumes de peixes-zebra adultos

Like many aquatic animals, zebrafish (Danio rerio) moves in a 3D space. It is thus preferable to use a 3D recording system to study its behavior. The ...

O objetivo geral deste procedimento é estudar os padrões de movimento tridimensionais de peixes-zebra ou outros animais aquáticos e analisar suas características cinemáticas, espaciais e sociais. Isso permite a detecção de comportamentos alterados devido a mutações genéticas ou fatores químicos e ambientais. Isso é realizado primeiramente calibrando o sistema, o que também corrige a distorção significativa da imagem gerada pela refração.O segundo passo consiste em gravar quadros de vídeo com resolução temporal relativamente alta a partir de pelo menos dois ângulos diferentes simultaneamente. Em seguida, o software reconstrói as trajetórias dos peixes. Algoritmos avançados são aplicados para reduzir o efeito de ruído e inferir a posição de um peixe quando ocorrem oclusões ou agrupamentos.O passo final consiste em analisar os dados e realizar a análise estatística da aceleração da velocidade, do ângulo de mudança de direção, da distribuição horizontal e vertical no recipiente de observação, das distâncias interindividuais e de outros parâmetros de interesse. Em última análise, o rastreamento 3D calibrado em alta velocidade é útil para estudar os déficits comportamentais em zebrafish mutantes e os efeitos de fármacos sobre uma variedade de sistemas comportamentais. Para fins de descoberta de fármacos, uma vantagem do sistema é que ele permite o estudo do comportamento dos peixes em 3D.Isso é importante porque os peixes se movem naturalmente nas três dimensões, e ao registrar múltiplos peixes simultaneamente, o registro em 2D pode ser muito enganoso ao investigar as configurações espaciais do grupo. Outra vantagem do sistema é que ele corrige a refração da luz, que, se não for corrigida, pode resultar em erros significativos de medição em sua configuração atual. O recipiente de observação que contém os peixes-zebra está posicionado na câmara de observação.A câmara também contém uma câmera, um espelho, que é suspenso a aproximadamente 45 graus acima do recipiente, e barras de luz LED. Antes da gravação, calibre o sistema para determinar as posições das paredes do recipiente e da superfície da água, bem como o fator de escala dos quadros gravados, ajustando também o erro gerado pela refração da luz ao passar da água para o ar. Após a conclusão da calibração, deve-se realizar um teste com um peixe simulado.A recalibração deve ser realizada se as posições do espelho ou da câmera estiverem incorretas ou se houver problemas com o rastreamento. Para iniciar uma sessão de gravação, coloque o recipiente de observação preenchido até as marcas com água na câmara de observação. Os pés do recipiente devem ser inseridos nos orifícios de alinhamento.Oriente os recipientes de modo que as paredes semitransparentes ou opacas fiquem voltadas para o lado distante e para a direita, conforme visto a partir da câmera. Em seguida, ligue as luzes do compartimento, coloque os peixes no recipiente e feche as cortinas. Abra o módulo de gravação e a imagem das vistas frontal e superior do recipiente aparecerá na tela.Inicialmente, a imagem adquirida pode não ser ideal e, portanto, pode precisar de alguns ajustes para obter contraste suficiente entre o peixe e o fundo. Para ajustar a imagem, selecione o controle da câmera e, em seguida, na janela de configurações gerais que se abre, desmarque as caixas mostradas aqui e ajuste o obturador e o ganho de modo que a imagem não fique superexposta. Em seguida, no lado esquerdo da janela de controle da câmera, selecione equilíbrio de branco de cor e, na nova janela, desmarque a caixa de auto e ajuste os valores de vermelho e azul para obter o melhor contraste de cor nas vistas frontal e superior.Pode ser necessário realizar vários ajustes após a conclusão dos ajustes. No menu principal do módulo de gravação, selecione o local dos dados para criar ou escolher uma pasta. Cada gravação deve ter sua própria pasta, que deve ser uma subpasta da pasta do experimento.Agora pressione iniciar gravação e insira um número inteiro para a duração da gravação em minutos, depois pressione ok e a sessão de gravação experimental será iniciada. Após a conclusão das gravações, copie e cole os dados do recipiente do animal e as subpastas de dados de correspondência da pasta de calibração para as pastas criadas anteriormente. Para iniciar a reconstrução do percurso, abra o módulo de trajetória do software. Em seguida, pressione localização dos dados para selecionar a pasta que foi criada com o módulo de gravação.Em seguida, pressione o botão de configuração do sistema para abrir primeiro a janela de parâmetros, ajuste os limiares de cor da vista superior e inferior. Um bom valor inicial é 1000. Em seguida, selecione os limiares dimensionais da vista superior e inferior.Um bom tamanho inicial para um peixe-zebra de porte médio é 10, ou use 20 para um peixe grande e cinco para um peixe pequeno. Quanto maiores forem esses limiares, menor será a probabilidade de o software captar ruídos. No entanto, com um valor muito alto, pode ser que ele não consiga detectar o peixe.Pode ser necessário reajustar esses limiares posteriormente durante o experimento. Para o limiar superior de tamanho, um valor de 3000 geralmente é suficiente. E para o comprimento específico, mantenha o valor predefinido de 220.O número de peixes refere-se à quantidade de peixes no tanque de observação. Número máximo de pontos refere-se ao número total de quadros; registre ou anote este número e pressione OK. Em seguida, selecione adquirir fundo.A próxima janela solicitará o preenchimento dos campos "de" e "para". Após carregar o plano de fundo, ajuste as três caixas vermelhas usando o mouse; essas caixas marcam as áreas nas quais o software está procurando o peixe. Minimize a caixa à esquerda.Como a vista lateral é usada apenas para calibração, agora pressione o botão iniciar a geração de trajetórias e a reconstrução do caminho começará. Idealmente, a marcação deve ser colocada sobre a imagem do peixe; se for frequentemente colocada incorretamente, abra a janela de informações. Aqui vemos um caso ideal em que apenas os contornos do peixe são visíveis.No caso de ruído excessivo, pressione parar no menu principal e escolha novos limiares de cor e tamanho. Além disso, verifique se as caixas vermelhas podem ser ligeiramente reduzidas. Por exemplo, na parte superior, para excluir o ruído gerado pelos movimentos da água, observe a trajetória na tela 3D.Clicando com o botão direito do mouse, o pesquisador pode selecionar entre rotação e translações da configuração 3D. Para iniciar o processamento de dados, abra o módulo de processamento de dados, selecione o projeto na barra de ferramentas e, em seguida, no menu suspenso, selecione novo e insira um nome para o experimento. Em seguida, selecione editar projeto.Em seguida, adicione ao projeto, seguido por novo grupo, e preencha um nome para o grupo experimental. Agora selecione o grupo experimental na janela à direita. Observe que a barra de ferramentas será alterada.Selecione o grupo de edição, depois adicione ao grupo e, em seguida, novas medições. Isso abrirá uma janela do navegador. Em seguida, abra a pasta criada durante a gravação e selecione a subpasta trajetórias e depois o arquivo de pontos suavizados.No exemplo apresentado aqui para o grupo A, seis arquivos foram carregados e para o grupo B, quatro arquivos. Para iniciar a análise, selecione o arquivo suavizado por ponto na janela da direita. Em seguida, selecione processamento de dados e parâmetros de valor único no menu suspenso.Como exemplo, selecione a congelação por duração. Uma janela será aberta para especificar a congelação em termos de limite de velocidade e limite de duração, a fim de familiarizar-se com o programa. Experimente outros exemplos, como distribuição da profundidade da distância percorrida, que permite determinar o número de níveis de profundidade e a frequência de rajadas.Ao selecionar a opção, o processamento em lote usando um limiar padrão de cerca de 200 pontos finais será calculado neste contexto. Padrão significa que os delimitadores foram definidos. Por exemplo, atualmente a distribuição de profundidade é calculada para três níveis de profundidade e a distribuição angular é calculada para quatro seções.Após gerar os parâmetros, uma nova janela será aberta solicitando o local e o nome do arquivo a ser criado. Eles serão salvos no formato CSV e poderão ser importados para outros softwares. Aqui, a figura A mostra um quadro típico de exemplo para controle.Peixes-zebra, enquanto a figura B mostra um quadro típico de exemplo para peixes-zebra tratados com MK 801, ambos registrados durante uma sessão matutina. Observe que os peixes-zebra controle estavam próximos ao fundo e agrupados. Em contraste, os peixes-zebra tratados com MK 801 estavam próximos ao topo e nadavam a uma distância considerável uns dos outros.Aqui, duas trajetórias representativas de peixes-zebra controlados e peixes-zebra tratados com 10 micromolar de MK 801 são apresentadas para uma sessão matinal e para uma sessão vespertina. Nesta figura, as distâncias sociais médias para os controles e para os peixes tratados com 10 micromolar de MK 801 são apresentadas para ambas as sessões, e aqui as linhas do tempo das distâncias médias entre indivíduos são apresentadas para ambos os grupos.Aqui na figura A, observamos a distribuição dos peixes-zebra em 10 níveis iguais de profundidade para a sessão matutina, e em B, a distribuição para a sessão vespertina. A distribuição temporal ao longo das quatro zonas radiais dos grupos experimentais é mostrada aqui. O inseto mostra as localizações dessas zonas do centro para a periferia, e aqui observamos a distribuição temporal ao longo dos quatro quadrantes dos grupos experimentais.O detalhe mostra a localização dos quadrantes. Linhas duplas representam paredes brancas, linhas simples representam paredes transparentes. A câmera está localizada à esquerda do detalhe IE, mais próxima dos quadrantes um e quatro.Os asteriscos pretos indicam comparações entre os grupos das sessões matutinas e os asteriscos cinzas indicam aquelas das sessões vespertinas. Por fim, são apresentadas aqui as componentes X, Y e Z da distância percorrida pelos peixes-zebra durante as sessões matutinas e vespertinas. São apresentadas a média e o erro padrão da média.Ao trabalhar com o sistema, lembre-se de que os dados são tão bons quanto a gravação; portanto, certifique-se de que o sistema esteja bem calibrado e de que as configurações da câmera sejam ideais. O restante é fácil e consiste apenas em se familiarizar com os diferentes passos.

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Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Usando um Sistema de Rastreamento 3D Automatizado para Registrar Indivíduos e Cardumes de Peixes-Zebra Adultos

O VisioTracker é um sistema automatizado para a análise quantitativa do desempenho visual de peixes adultos e larvas pequeno baseado no registro dos movimentos oculares. Ele possui total controle sobre propriedades de estímulo visual e análise em tempo real, permitindo alto rendimento de pesquisa em campos como o desenvolvimento do sistema visual e função, farmacologia, estudos de circuitos neurais e integração sensório-motora.

VisioTracker, uma abordagem inovadora Automatizada de Análise Oculomotor

O vídeo descreve o ensaio de evitação e tigmotaxia de larvas de peixe-zebra. O vídeo examina o comportamento das larvas de peixe-zebra em resposta ao estímulo visual aversivo.

Ensaio de evitação e timotaxia do peixe-zebra: um método de alto rendimento para examinar o comportamento larval em resposta a estímulos visuais aversivos

O nosso laboratório desenvolveu um novo sistema de imagem automatizado de alto débito, que é útil para a detecção de vários comportamentos diferentes em larvas de peixe-zebra de 7 dias de idade. O sistema pode ser utilizado para detectar alterações subtis no comportamento após as larvas foram expostas a agentes tóxicos ambientais ou de produtos farmacêuticos.

Automatizados análises comportamentais de alto rendimento em larvas do peixe

O peixe-zebra é um excelente modelo para estudar a função muscular e doenças. Durante o início da embriogênese, o peixe-zebra inicia contrações musculares regulares, produzindo um comportamento rítmico de natação, que é alterado quando o músculo é interrompido. Aqui descrevemos um ensaio de resposta evocada por toque e locomoção para examinar o desempenho da natação como uma medida da função muscular.

Usando resposta ao toque evocadas e locomoção Os ensaios para avaliar o desempenho muscular e funcional de Zebrafish

Aqui, apresentamos um protocolo para projetar e fabricar um embrião de zebrafish põr modelo, seguido por um procedimento detalhado sobre a utilização de tal modelo para alto throughput zebrafish embrião põr em uma placa de 96 poços.

Um 3-dimensional (3D)-impresso modelo alto Throughput Zebrafish embrião põr

Aqui, apresentamos métodos para estudo da elevado-produção de uma série do mexicano cavefish comportamentos e coloração vital de um sistema de mechanosensory. Esses métodos usam scripts de software livre e sob medidos, fornecendo um método prático e econômico para os estudos de comportamentos.

Acompanhamento comportamental e Neuromast imagem de Cavefish mexicano

Descreveremos um protocolo comportamental destinado a avaliar como personalidades do zebrafish influenciam sua resposta à água correntes e campos magnéticos fracos. Peixes com as mesmas personalidades são separados com base no seu comportamento exploratório. Em seguida, observa-se seu comportamento de orientação rheotactic em um túnel de natação com uma baixa taxa de fluxo e sob diferentes condições magnéticas.

Avaliar a influência da personalidade na sensibilidade a campos magnéticos no Zebrafish

Capaz de recuperação funcional após lesão medular, o zebrafish adulto é um sistema modelo de elucidar mecanismos inatas de regeneração neural. Aqui, descrevemos a resistência à natação e os ensaios de comportamento de natação como leituras funcionais da regeneração da medula espinhal.

Avaliação da resistência ao natação e comportamento de natação em zebrafish adulto

Este protocolo utiliza imagens de lâminas de luz para investigar a função contrátil cardíaca em larvas de peixe-zebra e obter informações sobre mecânica cardíaca por meio de rastreamento celular e análise interativa.

Imagem de folha de luz 4D da contração cardíaca do peixe-zebra

Tarefas de preferência social multi-câmara foram adaptadas de roedores para peixe-zebra, facilitando o estudo do comportamento social em organismos modelo. Esse protocolo valida uma tarefa de baixo custo de 3 câmaras em tanque aberto, usando webcams e software de código aberto para medir a preferência social dos peixes-zebra, tornando-a acessível para pesquisa e ensino de graduação.

Alternativa de baixo custo para examinar preferência social em peixe-zebra (Danio rerio) usando a tarefa de 3 câmaras em aquário aberto e natação livre

Aprenda a usar um sistema automatizado de rastreamento 3D para registrar movimentos de peixes-zebra adultos e analisar padrões cinemáticos, espaciais e sociais. Este método permite detectar alterações comportamentais causadas por fatores genéticos ou ambientais.

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