Usando um sistema automatizado de rastreamento 3D para registrar indivíduos e cardumes de peixes-zebra adultos

O objetivo geral deste procedimento é estudar os padrões de movimento tridimensionais de peixes-zebra ou outros animais aquáticos e analisar suas características cinemáticas, espaciais e sociais. Isso permite a detecção de comportamentos alterados devido a mutações genéticas ou fatores químicos e ambientais. Isso é realizado primeiramente calibrando o sistema, o que também corrige a distorção significativa da imagem gerada pela refração.

O segundo passo consiste em gravar quadros de vídeo com resolução temporal relativamente alta a partir de pelo menos dois ângulos diferentes simultaneamente. Em seguida, o software reconstrói as trajetórias dos peixes. Algoritmos avançados são aplicados para reduzir o efeito de ruído e inferir a posição de um peixe quando ocorrem oclusões ou agrupamentos.

O passo final consiste em analisar os dados e realizar a análise estatística da aceleração da velocidade, do ângulo de mudança de direção, da distribuição horizontal e vertical no recipiente de observação, das distâncias interindividuais e de outros parâmetros de interesse. Em última análise, o rastreamento 3D calibrado em alta velocidade é útil para estudar os déficits comportamentais em zebrafish mutantes e os efeitos de fármacos sobre uma variedade de sistemas comportamentais. Para fins de descoberta de fármacos, uma vantagem do sistema é que ele permite o estudo do comportamento dos peixes em 3D.

Isso é importante porque os peixes se movem naturalmente nas três dimensões, e ao registrar múltiplos peixes simultaneamente, o registro em 2D pode ser muito enganoso ao investigar as configurações espaciais do grupo. Outra vantagem do sistema é que ele corrige a refração da luz, que, se não for corrigida, pode resultar em erros significativos de medição em sua configuração atual. O recipiente de observação que contém os peixes-zebra está posicionado na câmara de observação.

A câmara também contém uma câmera, um espelho, que é suspenso a aproximadamente 45 graus acima do recipiente, e barras de luz LED. Antes da gravação, calibre o sistema para determinar as posições das paredes do recipiente e da superfície da água, bem como o fator de escala dos quadros gravados, ajustando também o erro gerado pela refração da luz ao passar da água para o ar. Após a conclusão da calibração, deve-se realizar um teste com um peixe simulado.

A recalibração deve ser realizada se as posições do espelho ou da câmera estiverem incorretas ou se houver problemas com o rastreamento. Para iniciar uma sessão de gravação, coloque o recipiente de observação preenchido até as marcas com água na câmara de observação. Os pés do recipiente devem ser inseridos nos orifícios de alinhamento.

Oriente os recipientes de modo que as paredes semitransparentes ou opacas fiquem voltadas para o lado distante e para a direita, conforme visto a partir da câmera. Em seguida, ligue as luzes do compartimento, coloque os peixes no recipiente e feche as cortinas. Abra o módulo de gravação e a imagem das vistas frontal e superior do recipiente aparecerá na tela.

Inicialmente, a imagem adquirida pode não ser ideal e, portanto, pode precisar de alguns ajustes para obter contraste suficiente entre o peixe e o fundo. Para ajustar a imagem, selecione o controle da câmera e, em seguida, na janela de configurações gerais que se abre, desmarque as caixas mostradas aqui e ajuste o obturador e o ganho de modo que a imagem não fique superexposta. Em seguida, no lado esquerdo da janela de controle da câmera, selecione equilíbrio de branco de cor e, na nova janela, desmarque a caixa de auto e ajuste os valores de vermelho e azul para obter o melhor contraste de cor nas vistas frontal e superior.

Pode ser necessário realizar vários ajustes após a conclusão dos ajustes. No menu principal do módulo de gravação, selecione o local dos dados para criar ou escolher uma pasta. Cada gravação deve ter sua própria pasta, que deve ser uma subpasta da pasta do experimento.

Agora pressione iniciar gravação e insira um número inteiro para a duração da gravação em minutos, depois pressione ok e a sessão de gravação experimental será iniciada. Após a conclusão das gravações, copie e cole os dados do recipiente do animal e as subpastas de dados de correspondência da pasta de calibração para as pastas criadas anteriormente. Para iniciar a reconstrução do percurso, abra o módulo de trajetória do software. Em seguida, pressione localização dos dados para selecionar a pasta que foi criada com o módulo de gravação.

Em seguida, pressione o botão de configuração do sistema para abrir primeiro a janela de parâmetros, ajuste os limiares de cor da vista superior e inferior. Um bom valor inicial é 1000. Em seguida, selecione os limiares dimensionais da vista superior e inferior.

Um bom tamanho inicial para um peixe-zebra de porte médio é 10, ou use 20 para um peixe grande e cinco para um peixe pequeno. Quanto maiores forem esses limiares, menor será a probabilidade de o software captar ruídos. No entanto, com um valor muito alto, pode ser que ele não consiga detectar o peixe.

Pode ser necessário reajustar esses limiares posteriormente durante o experimento. Para o limiar superior de tamanho, um valor de 3000 geralmente é suficiente. E para o comprimento específico, mantenha o valor predefinido de 220.

O número de peixes refere-se à quantidade de peixes no tanque de observação. Número máximo de pontos refere-se ao número total de quadros; registre ou anote este número e pressione OK. Em seguida, selecione adquirir fundo.

A próxima janela solicitará o preenchimento dos campos "de" e "para". Após carregar o plano de fundo, ajuste as três caixas vermelhas usando o mouse; essas caixas marcam as áreas nas quais o software está procurando o peixe. Minimize a caixa à esquerda.

Como a vista lateral é usada apenas para calibração, agora pressione o botão iniciar a geração de trajetórias e a reconstrução do caminho começará. Idealmente, a marcação deve ser colocada sobre a imagem do peixe; se for frequentemente colocada incorretamente, abra a janela de informações. Aqui vemos um caso ideal em que apenas os contornos do peixe são visíveis.

No caso de ruído excessivo, pressione parar no menu principal e escolha novos limiares de cor e tamanho. Além disso, verifique se as caixas vermelhas podem ser ligeiramente reduzidas. Por exemplo, na parte superior, para excluir o ruído gerado pelos movimentos da água, observe a trajetória na tela 3D.

Clicando com o botão direito do mouse, o pesquisador pode selecionar entre rotação e translações da configuração 3D. Para iniciar o processamento de dados, abra o módulo de processamento de dados, selecione o projeto na barra de ferramentas e, em seguida, no menu suspenso, selecione novo e insira um nome para o experimento. Em seguida, selecione editar projeto.

Em seguida, adicione ao projeto, seguido por novo grupo, e preencha um nome para o grupo experimental. Agora selecione o grupo experimental na janela à direita. Observe que a barra de ferramentas será alterada.

Selecione o grupo de edição, depois adicione ao grupo e, em seguida, novas medições. Isso abrirá uma janela do navegador. Em seguida, abra a pasta criada durante a gravação e selecione a subpasta trajetórias e depois o arquivo de pontos suavizados.

No exemplo apresentado aqui para o grupo A, seis arquivos foram carregados e para o grupo B, quatro arquivos. Para iniciar a análise, selecione o arquivo suavizado por ponto na janela da direita. Em seguida, selecione processamento de dados e parâmetros de valor único no menu suspenso.

Como exemplo, selecione a congelação por duração. Uma janela será aberta para especificar a congelação em termos de limite de velocidade e limite de duração, a fim de familiarizar-se com o programa. Experimente outros exemplos, como distribuição da profundidade da distância percorrida, que permite determinar o número de níveis de profundidade e a frequência de rajadas.

Ao selecionar a opção, o processamento em lote usando um limiar padrão de cerca de 200 pontos finais será calculado neste contexto. Padrão significa que os delimitadores foram definidos. Por exemplo, atualmente a distribuição de profundidade é calculada para três níveis de profundidade e a distribuição angular é calculada para quatro seções.

Após gerar os parâmetros, uma nova janela será aberta solicitando o local e o nome do arquivo a ser criado. Eles serão salvos no formato CSV e poderão ser importados para outros softwares. Aqui, a figura A mostra um quadro típico de exemplo para controle.

Peixes-zebra, enquanto a figura B mostra um quadro típico de exemplo para peixes-zebra tratados com MK 801, ambos registrados durante uma sessão matutina. Observe que os peixes-zebra controle estavam próximos ao fundo e agrupados. Em contraste, os peixes-zebra tratados com MK 801 estavam próximos ao topo e nadavam a uma distância considerável uns dos outros.

Aqui, duas trajetórias representativas de peixes-zebra controlados e peixes-zebra tratados com 10 micromolar de MK 801 são apresentadas para uma sessão matinal e para uma sessão vespertina. Nesta figura, as distâncias sociais médias para os controles e para os peixes tratados com 10 micromolar de MK 801 são apresentadas para ambas as sessões, e aqui as linhas do tempo das distâncias médias entre indivíduos são apresentadas para ambos os grupos.

Aqui na figura A, observamos a distribuição dos peixes-zebra em 10 níveis iguais de profundidade para a sessão matutina, e em B, a distribuição para a sessão vespertina. A distribuição temporal ao longo das quatro zonas radiais dos grupos experimentais é mostrada aqui. O inseto mostra as localizações dessas zonas do centro para a periferia, e aqui observamos a distribuição temporal ao longo dos quatro quadrantes dos grupos experimentais.

O detalhe mostra a localização dos quadrantes. Linhas duplas representam paredes brancas, linhas simples representam paredes transparentes. A câmera está localizada à esquerda do detalhe IE, mais próxima dos quadrantes um e quatro.

Os asteriscos pretos indicam comparações entre os grupos das sessões matutinas e os asteriscos cinzas indicam aquelas das sessões vespertinas. Por fim, são apresentadas aqui as componentes X, Y e Z da distância percorrida pelos peixes-zebra durante as sessões matutinas e vespertinas. São apresentadas a média e o erro padrão da média.

Ao trabalhar com o sistema, lembre-se de que os dados são tão bons quanto a gravação; portanto, certifique-se de que o sistema esteja bem calibrado e de que as configurações da câmera sejam ideais. O restante é fácil e consiste apenas em se familiarizar com os diferentes passos.