Name: Protocolo Rápido para Preparação de electrocompetentes Escherichia coli E Vibrio cholerae (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-10-08T18:30:00.000+00:00
Duration: 7 min 10 s
Description: Aprenda a preparar células eletrocompetentes de Escherichia coli e Vibrio cholerae rapidamente em 5-6 horas. Este método simplificado permite transformações eficientes sem equipamentos complexos.

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Os autores agradecem aos colegas e funcionários de laboratórios presentes e passadas que têm apoiado o desenvolvimento desta técnica. Laboratório de SP é apoiado pelo Instituto Canadense de Pesquisa em Saúde Grant operacional MOP-84473 e Alberta Soluções Inova-Saúde (financiados pela Fundação Alberta Heritage para Fundo de Doações de Pesquisa Médica). DP de foi apoiado pelo National Institutes of Health concede MD001091-01 e GM068855-02.

1. Preparação de culturas bacterianas, Ferramentas e Reagentes (dia 1, Tarde) <ol><li> No final da tarde, inocular 1-5 ml de caldo LB autoclavado em estéril (por exemplo, 100 x 13 mm) tubos de ensaio de vidro de borosilicato com uma pequena alíquota de bactérias (E. coli ou V. cholerae). </li><li> Defina os tubos de ensaio inoculados em um tambor rolo alojados a 37 ° C de temperatura (sala quente ou incubadora), ligue o tambor rolo em alta velocidade, e incubar O / N. </li><li> Preparar um espalhador de célula na forma de um &quot;stick de hóquei&quot; de uma vareta de vidro por aquecimento do meio da haste na chama de um bico de Bunsen, até o vidro amolece e, em seguida, dirigir a curva suavemente com uma pinça ou um alicate em um ângulo de 135 ° . Aquece-se a haste de, mais uma vez, no ponto médio entre a extremidade e a primeira curva e dobrá-lo em um ângulo de 45 ° para dentro (no sentido oposto ao da primeira curva). </li><li> Prepare LB-agar sem antibióticos e despeje em placas de Petri, em preparação daprotocolo electrocompetence, e LB-agar placas contendo o antibiótico apropriado (de acordo com o marcador de resistência no vector a ser electroporada), e armazenar a 4 ° C. </li><li> Preparar um filtro esterilizado de CaCl 2 a 2 mM para a solução de V. cholerae, ou autoclave DDH 2 O para E. coli, e armazenar a 4 ° C. </li></ol> 2. Crescimento de electrocompetentes Bactérias (DIA 2, Manhã) <ol><li> Entregar 100 ul da cultura bacteriana S / N em cada placa de agar LB, os estoques de glicerol congelados podem também ser utilizados e entregue directamente sobre a placa. </li><li> Mergulhe o hóquei em forma de bastão espalhador de celular em 100% EtOH, escorra rapidamente e queimar o restante EtOH para esterilizar antes do uso e disseminação. Espalhe a cultura bacteriana 100 l O / N uniformemente com o espalhador célula de vidro estéril tomando cuidado para não perturbar (break) a superfície do ágar. </li><li> Incubar a placa a 37 ° C durante 4-6 horas, ou até que um relvado fina de crescimento bacteriano servem distinguíveis. As células são mais competente quando crescendo ativamente. </li></ol> 3. Preparação de electrocompetentes bacterianas Cells (dia 2, à tarde) <ol><li> Colha as bactérias com uma ansa de inoculação estéril tomando cuidado para não furar ou quebrar a superfície do ágar. Uma massa bacteriana 2 mm de diâmetro é suficiente para uma única transformação. Tipicamente, isto requer a raspagem da superfície da relva fina com a ansa de inoculação de duas ou três vezes. Várias amostras (normalmente entre 4-6) podem ser recolhidos a partir do mesmo prato. </li><li> Ressuspender a massa bacteriana em 1 ml de gelado 2 mM de CaCl2 (para V. cholerae) ou estéril ddH2O (para E. coli) e misture bem até que não são visíveis aglomerados, manter em gelo. </li><li> Centrifugar cada suspensão bacteriana durante 5 min a 5000 x g numa microcentrífuga refrigerado ajustado para 4 ° C, ou em uma microcentrífuga armazenada num quarto frio para definir a 4 ° C. </li><li> Desprezar o sobrenadante, resuspterminar o sedimento bacteriano no mesmo volume de 2 mM de CaCl 2 gelada ou ddH2O estéril, e repetir a etapa de centrifugação, tal como feito antes de mais duas vezes para um total de três lavagens. </li><li> Remover o sobrenadante, ressuspender, e em seguida soltar a pelota bacteriana completamente em 40 mL de gelo frio de 2 mM de CaCl2 ou estéril ddH2O e manter em gelo. </li></ol> 4. Transformação de electrocompetentes Bactérias (dia 2, à tarde) <ol><li> Adicione-se a 1 ug de DNA de plasmídeo (até 1 uL de água ou solução tampão de Tris-EDTA) a suspensão bacteriana e transferir 40 ul desta mistura num pré-gelada, estéril cuvete 0,2 centímetros lacuna. A concentração de sal na amostra de DNA deve ser acessível a, uma vez que irá contribuir para a formação de arco do pulso no passo seguinte. </li><li> Coloque a célula para a câmara de eletroporação do módulo de controle de pulso, e electroporate em 1,8 kV, 25 mF. A constante de tempo deve ser ~ 5.0 ms, e nenhum arco deve ocorrer. </li><li> Recuperar rapidamente a suspensão de células por ressuspensão em 1 ml de caldo LB e transferir para previamente autoclavada tubo de vidro de borosilicato. </li><li> Permitir que as células para recuperar por incubação sob condições de crescimento gaseificadas (num tambor de rolos), a 37 ° C durante 30 min sem selecção de antibiótico. </li><li> Placa as bactérias em placas de agar LB previamente preparadas na presença do agente selectivo apropriado (antibiótico), e incuba-se a 37 ° CO / N. Se as bactérias são transformadas com uma elevada concentração de vector purificado (0,1-1 ug de plasmídeo super-enrolado), volumes 10 mL de cultura bacteriana sobre a borda da placa de agar LB e com uma sequência de ansa de inoculação estéril para colónias isoladas usando o método de sequência de quadrante. Se uma mistura de ligação foi transformada, entregar 100 ml de cultura bacteriana em cada placa de ágar e espalhar uniformemente com o espalhador de célula de vidro esterilizado. </li></ol> a Se a constante de tempo é curto (serbaixo 3,5 ms), ou pulsação leva a formação de arco eléctrico, em seguida, re-precipitar o ADN da amostra, lava-se com EtOH a 70%, duas vezes para remover sais antes da secagem e ressuspensão em tampão TE.

<ol><li>Neumann, E., Schaefer-Ridder, M., Wang, Y., Hofschneider, P. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gene+transfer+into+mouse+lyoma+cells+by+electroporation+in+high+electric+fields%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+J%22%5BJournal%5D)">Gene transfer into mouse lyoma cells by electroporation in high electric fields.</a> EMBO J. 1 (7), 841-845 (1982).</li>
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<li>Dunny, G. M., Lee, L. N., LeBlanc, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Improved+electroporation+and+cloning+vector+system+for+gram-positive+bacteria%5BTitle%5D)+AND+%22Appl.+Environ.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Improved electroporation and cloning vector system for gram-positive bacteria.</a> Appl. Environ. Microbiol. 57 (4), 1194-1201 (1991).</li>
<li>Micheletti, P. A., Sment, K. A., Konisky, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+of+a+coenzyme+M-auxotrophic+mutant+and+transformation+by+electroporation+in+Methanococcus+voltae%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Bacteriol%22%5BJournal%5D)">Isolation of a coenzyme M-auxotrophic mutant and transformation by electroporation in Methanococcus voltae.</a> J. Bacteriol. 173 (11), 3414-3418 (1991).</li>
<li>Schleper, C., Kubo, K., Zillig, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+particle+SSV1+from+the+extremely+thermophilic+archaeon+Sulfolobus+is+a+virus%3A+demonstration+of+infectivity+and+of+transfection+with+viral+DNA%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">The particle SSV1 from the extremely thermophilic archaeon Sulfolobus is a virus: demonstration of infectivity and of transfection with viral DNA.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 89 (16), 7645-7649 (1992).</li>
<li>Aune, T. E., Aachmann, F. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Methodologies+to+increase+the+transformation+efficiencies+and+the+range+of+bacteria+that+can+be+transformed%5BTitle%5D)+AND+%22Appl.+Microbiol.+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Methodologies to increase the transformation efficiencies and the range of bacteria that can be transformed.</a> Appl. Microbiol. Biotechnol. 85 (5), 1301-1313 (2010).</li>
<li>Hanahan, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Studies+on+transformation+of+Escherichia+coli+with+plasmids%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">Studies on transformation of Escherichia coli with plasmids.</a> J. Mol. Biol. 166, 557(1983).</li>
<li>Unterweger, D., Kitaoka, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Constitutive+Type+VI+Secretion+System+Expression+Gives+Vibrio+cholerae+Intra-+and+Interspecific+Competitive+Advantages%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Constitutive Type VI Secretion System Expression Gives Vibrio cholerae Intra- and Interspecific Competitive Advantages.</a> PLoS One. 7 (10), e48320(2012).</li>
</ol>

Não há divulgações são aplicáveis.

A eficiência de transformação é sujeito a uma variedade de fatores, independentemente do método utilizado para preparar as células competentes. Variáveis ​​análogas são aplicáveis ​​a este método, um grande cuidado deve ser tomado para que uma vez que as células são colhidas a partir da placa de agar tal que eles são mantidos a baixa temperatura constante (não superior a 4 ° C). A camada de bactérias deve ser activamente crescente no momento da recolha, as células devem estar em fase semi-logarítmica de crescimento. Qualidade do ADN (isto é, a contaminação de sais) influencia a eficiência de transformação. Especificamente, quando se emprega este método, o ágar não deve ser quebrado como fragmentos de agar na cuvete irá causar faíscas do pulso. A maioria dos problemas encontrados com esta técnica está associada com dois problemas, recolhendo as bactérias durante a janela de tempo apropriada da placa de agar, quando eles estão em crescimento activo. Coletá-los muito em breve trará o número de células insuficientes e irá processar araspando a placa de agar LB frustrante porque o &quot;pellicule&quot; formam é difícil de levantar para fora da superfície da placa. Bactérias Coleta tarde vai diminuir drasticamente a sua competência. A janela de tempo irá variar, naturalmente, dependendo da densidade de inoculo semeado em placas de agar LB. O segundo passo essencial é a de manter as bactérias frio (4 ° C) a partir do momento em que eles são levantados para fora da placa de ágar e ressuspensas em CaCl 2 ou ddH2O até serem semeadas em agar LB transformação seguinte. Os tubos de microcentrífuga contendo as bactérias, cuvetes e tampão deve ser pré-arrefecido e mantido em gelo para todas as vezes até que as bactérias são plaqueadas. No entanto, problemas adicionais podem surgir quando a estéril ddH2O ou CaCl2 conter precipitado ou contaminados. Por este motivo, recomendamos a elaboração deste novo reagente. Solução de problemas de transformação é facilitada pela inclusão de controles ao transformar bacteria prestados competente por qualquer método. Um controle negativo constituído por um grupo de bactérias competentes não transformadas semeadas em uma placa de ágar LB contendo o marcador selectivo irá ajudar rapidamente determinar se o antibiótico na placa é eficaz. A transformação do controlo positivo com uma preparação plasmídeo conhecido de boa qualidade e quantidade abrigar o mesmo marcador seletivo como a amostra experimental será útil para determinar se as bactérias são competentes, mas também se o DNA experimental transformada foi suficiente em quantidade ou qualidade. As vantagens desta técnica são múltiplos, o método pode ser realizado no mesmo dia em que a transformação é planejado. Nós descobrimos que o estoque de glicerol bacteriana congelado pode ser banhado diretamente sobre o agar LB sem qualquer perda na electrocompetence, temos feito isso em situações de &quot;emergência&quot; (depois de esquecer de iniciar a cultura durante a noite do dia anterior). Embora não pudemos testar emuito estirpe conhecida, qualquer E. coli ou V. cholerae tensão que pode ser transformado por eletroporação tem sido favorável a este protocolo em nossas mãos. A técnica é rápida, eficaz e produz eficiências de transformação comparáveis ​​aos obtidos desde a preparação bactérias electrocompetentes empregam métodos tradicionais. O método elimina a necessidade de centrífuga de alta velocidade e de rotores associados, num agitador orbital incubadora e baldes de centrífuga estéreis (recipientes), e grandes volumes de tampão autoclavado. Embora a tabela de reagentes específicos e Equipamentos é bastante abrangente, a maioria dos laboratórios que realizam eletroporação terá a maioria, se não todos, estes materiais já disponíveis. Talvez o mais importante, a técnica pode ser facilmente aplicado para gerar estirpes electrocompetentes específicos do laboratório com fundos mutantes rapidamente. Não temos conhecimento de quaisquer limitações desta técnica, uma vez que substituiu o método tradicional de preparação de electrocompetent bactérias nos nossos laboratórios. Os resultados de nossas experiências mostradas aqui foram realizados com células electrocompetentes frescos produzidos com o método tradicional, que tinha sido armazenado a -80 ° C durante não mais de 1 semana. No entanto, os estoques de células congeladas electrocompetentes de perder competência e viabilidade ou durante longos períodos de armazenamento. O protocolo simplificado permite a preparação de células electrocompetentes fresco no mesmo dia da transformação está prevista, sem preocupações com a idade do material, que podem resultar em rendimento transformante diminuiu. Não tentamos armazenar células electrocompetentes produzidos usando o método rápido para uso em outro dia, pois isso não foi necessário. Embora não seja mostrado aqui, a eficiência das células electrocompetentes preparadas utilizando o nosso método rápido é suficiente para misturas de ligação. As transformações relatados para não-O1 V. cholerae em um recente artigo de Unterweger et al.17 foram realizados com bactérias electrocompetentes preparadas pelo método descrito aqui (exceto as realizadas por conjugação). Esta técnica permite aos pesquisadores transformar cepas mutantes com fundos rápida e eficazmente sem ter que preparar grandes quantidades de células. Este método de preparação rápida de bactérias electrocompetentes pode ser adaptado para outros procariotas que foram mostrados para ser passível de electroporação, como o princípio da preparação e as definições de eletroporação vão ser as mesmas que as de protocolos tradicionais.

Desde a sua &#39;criação no início dos anos 1980 1, eletroporação tornou-se uma técnica de biologia molecular integral, provavelmente, o único método mais comum empregado para transformar / transfectar células vivas com ácidos nucléicos circulares ou lineares. Desenvolvida originalmente para a transfecção de células eucarióticas 1, electroporação foi subsequentemente adaptado para a transformação de E. coli 2, 3. Em bacteriologia, electroporação tornou-se o padrão de laboratório e foi modificado para transformar uma vasta gama de bactérias, incluindo bactérias Gram-negativas Pseudomonas 4, 5 Salmonella, Vibrios 6, Serratiae, e bacilos disentéricos 7; Clostridia Gram-positivos 8, Bacilos 9, 10 Lactobacilos e enterococos 11. Mesmo algumas arqueobactérias provaram susceptível à transformação por electroporação, incluindo Methanococci </em&gt; 12 e 13 Sulfolobus espécies. Para uma revisão abrangente consulte Aune e Aachmann 14. Eficiência de transformação por eletroporação é declaradamente 10-20 vezes maior do que a competência química ou choque térmico 2. No entanto, assim como a preparação de bactérias para a competência química como otimizado por Douglas Hanahan na década de 1980 15, as células também deve estar preparado para ser electrocompetentes. Eletroporação é um meio rápido e eficaz de transformação bacteriana, exigindo bactérias electrocompetentes, DNA purificado, um módulo de controle de pulso que fornece o impulso elétrico, e uma câmara que acomoda pequenas células descartáveis, que funcionam como um eletrodo. Resumidamente, as bactérias competentes frias, são misturados com o DNA de plasmídeo, submetido a um impulso de alta tensão numa cuvete, ressuspensas em meio de crescimento, incubadas a 30-37 ° C durante 30-45 min, e, em seguida plaqueadas em meio semi-sólido (agar nutriente placas), com a aproxopriate antibiótico seletiva. Em contraste com o passo de condicionamento, a preparação de electrocompetentes E. coli continua a ser um processo de várias partes que tradicionalmente é realizado em grandes volumes. Resumidamente, uma cultura durante a noite de bactérias é inoculado num balão de Erlenmeyer com 100 ml a 1 litro de Luria Broth (LB), crescidas até à fase semi-logarítmica de crescimento (DO600 de &lt;1,0), e sujeitos a lavagens em série com um não estéril iónico tampão ou água bidestilada (ddH2O), em uma redução dos volumes a 4 ° C. Grande cuidado deve ser tomado para manter as células frio durante todo o procedimento e evitar a contaminação. Isto requer a utilização de baldes centrifugação autoclavados e tampões não-iónicos ou ddH2O, uma incubadora agitador orbital, um volume grande de alta velocidade centrífuga refrigerada e um conjunto de rotores. As bactérias são finalmente ressuspensas num pequeno volume de tampão suplementado com 10% de glicerol e divididas em alíquotas para ~ 40 volumes ul, which são armazenadas a -80 ° C até à sua utilização. De armazenamento a baixa temperatura, muitas vezes resulta em eficiências de transformação diminuiu, devido à perda de viabilidade ao longo do tempo. Células bacterianas electrocompetentes estão também disponíveis a partir de uma variedade de fontes comerciais, mas apenas para um número limitado de (frequentemente recombinação deficiente) E. coli como hospedeiros vulgarmente utilizados para propagar uma vasta gama de plasmídeos. Como resultado os pesquisadores contam com métodos in-house para preparar as suas próprias linhagens / mutantes para a transformação. Um suplente, protocolo rápido e eficiente para a preparação de electrocompetentes E. coli tem sido usada por alguns laboratórios de bacteriologia molecular por algum tempo e agora foi estendido para as bactérias Gram-negativas adicionais, no nosso caso V. cholerae. O criador do protocolo não pode ser identificado, pois foi otimizado por outros pesquisadores ao longo do tempo. O método aqui apresentado foi usado no nosso laborats por quase duas décadas, e é nosso objetivo de compartilhar esse protocolo útil com nossos pares.

<table><tbody><tr><td>Módulo Pulsador de Genes</td><td>Bio-Rad</td><td>165-2668</td><td></td></tr><tr><td>Câmara de Cubeta Pulsador de Genes</td><td>Bio-Rad</td><td>165-2669</td><td></td></tr><tr><td>Eletrocuvetes (lacuna de 0,2 cm)</td><td>Bio-Rad</td><td>165-2082</td><td></td></tr><tr><td>Tubos de Cultura Sem Aro Pyrex de 13 x 100 mm </td><td>Corning</td><td>70820-13</td><td></td>Fechamentos de</tr><tr><td>Tubo de Cultura de 13 mm </td><td>Cole Parmer</td><td>EW-04500-00</td><td></td></tr><tr><td>6 x Placa</td> de Petri <td>Descartável Rod Lab Source</td><td>11381D</td><td></td>de 250 mm</tr><tr><td></td><td>Fisher Scientific</td><td>08-757-12</td><td></td></tr><tr><td>Conjunto de Motor de Tambor de Rolo</td><td>New Brunswick Scientific</td><td>M1053-4004</td><td></td></tr><tr><td>Tambor de Rolo para Tubos de Cultura de 13 x 100 mm</td><td>New Brunswick Scientific</td><td>M1053-0306</td><td></td></tr><tr><td>Cloreto de cálcio</td><td>Sigma Chemicals</td><td>C5670</td><td></td></tr><tr><td>Etanol, anidro / desnaturado</td><td>Sigma Chemicals</td><td>227649</td><td></td></tr><tr><td>Inoculating Loop</td><td>Decon Labs</td><td>MP182-5</td><td></td></tr><tr><td>Microcentrífuga refrigerada 5451 R</td><td>Eppendorf</td><td>22621425</td><td></td></tr><tr><td>Bunsen Burner</td><td>Fisher Scientific</td><td>03-917Q</td><td></td></tr><tr><td>LB Caldo MILLER</td><td>EMD</td><td>1.10285.0500</td><td></td></tr><tr><td>Bacteriological Agar</td><td>Fisher Científico</td><td>S25127</td><td></td></tr></tbody></table>

protocolo rápido para preparação de electrocompetentes<em&gt; escherichia coli</em&gt; e<em&gt; vibrio cholerae</em

Rapid Protocol for Preparation of Electrocompetent Escherichia coli and Vibrio cholerae

A electroporação tornou-se um método amplamente utilizado para rapidamente e eficientemente a introdução de ADN estranho em uma ampla variedade de células. Eletrotransformação tornou-se o método de eleição para a introdução de ADN em procariotas que não são naturalmente competente. A electroporação é um método de transformação rápida, eficiente, e simplificada, que, além de ADN purificado e bactérias competentes, requer disponível comercialmente controlador de impulsos de genes e tinas. Em contraste com o passo de condicionamento, a preparação de células electrocompetentes é moroso e de trabalho intenso que envolve ciclos repetidos de centrifugação e lavagens com uma redução dos volumes de água esterilizada, fria, ou tampões não-iónicos de grandes volumes de culturas cultivadas até à fase semi-logarítmica crescimento. Tempo e esforço podem ser salvas através da compra de células electrocompetentes de fontes comerciais, mas a seleção é limitada a comumente empregada E. estirpes laboratoriais coli. Estamos aqui divulgando uma rápida emétodo eficiente para preparar electrocompetentes E. coli, o que tem sido utilizado por laboratórios de bacteriologia por algum tempo, pode ser adaptado para V. cholerae e outros procariotas. Embora não possamos saber quem ao crédito para o desenvolvimento da técnica original, estamos aqui tornando-o disponível para a comunidade científica.

Foi realizado um conjunto de transformações com E. coli e V. cholerae para comparar a eficiência de transformação da nossa metodologia rápida com uma adaptação do método (tradicional) originalmente descrito por Dower et al. 2 para a preparação de bactérias electrocompetentes. Para levar a cabo a preparação tradicional de células competentes, 500 ml de LB num balão Erlenmeyer de 2 L-foram inoculados com 500 ul da cultura durante a noite de E. coli DH5a ou V. cholerae O395, incubadas num agitador orbital (215 rpm, a 37 ° C) e colhidas em OD 600 de entre 0,5-1,0. O frasco foi arrefecido em gelo e as culturas centrifugada num rotor pré-refrigerada a 4000 xg durante 10 min a 4 ° C. As pelotas de células foram cuidadosamente ressuspendidas em 500 ml de 2 mM de CaCl 2 gelada para V. cholerae e DDH 2 O para E. coli, e centrifugado novamente nas mesmas condições. Rodadas subsequentes de uma ressuspensãod centrifugação foram realizados em uma redução dos volumes de 200 e 100 ml volumes certificando-se a cultura permaneceu refrigeradas a 4 ° C. Finalmente, uma ressuspensão e centrifugação num volume de 10 ml foi efectuada com 10% de glicerol. O sedimento final foi ressuspenso em 2 ml de glicerol a 10% e 40 mL alíquotas foram congeladas a -80 ° C e não armazenado do que uma semana antes da electroporação. Condições de eletroporação incluindo as configurações de tamanho de pulso e tina foram idênticos para as duas espécies de bactérias em todas as electroporations independentemente do método de preparação das células competentes. A única diferença foi que realizou as lavagens em DDH 2 O frio para E. coli e frio mM CaCl 2 2 para V. cholerae. Tabela 1 mostra os resultados de bactérias transformadas por electroporação de forma idêntica, mas tornadas competentes ou com o protocolo rápido ou com o método tradicional. Nós empregamos O395 tensão e DH5ct tão comumutilizados ly, estirpes representativas de V. cholerae e E. coli, respectivamente, com resultados semelhantes podem ser obtidos com outras estirpes da mesma espécie (embora não a cada estirpe foi testado) e susceptível adaptado para outras bactérias gram-negativas e, provavelmente, mais além. Para garantir que os números de células iguais estavam presentes em cada lote pulsada, bactérias electrocompetentes gerados utilizando o método rápido foram reunidas após a recolha, misturada, mantida de forma homogénea em suspensão, e aliquotado em 40 volumes ul imediatamente antes da electroporação. Bactérias electrocompetentes gerados utilizando o método tradicional foram tratados da mesma forma antes de congelar em 40 mL alíquotas. Após a entrega do impulso, de cada lote de 40 uL de bactérias electroporadas foi suspensa em 400 ul de LB e diluída em série 1:10. Cem microlitros de cada diluição em placas em agar de LB na presença de 100 ug / ml de ampicilina e espalhar usando um espalhador de vidro estéril de célulase incubou-se a 37 ° C durante a noite. Para quantificar o número total de bactérias empregues em cada transformação, 40 volumes ul de bactérias electrocompetentes de cada lote preparado foram diluídas em série e plaqueadas em agar LB sem antibióticos de forma idêntica em paralelo. Uma alíquota de bactérias igualmente tratados, de cada lote foi electroporada com 1 ul de Tris-EDTA (TE) de tampão, mas sem DNA (transformação simulada), diluídos em série e plaqueados em agar LB sem antibióticos para estimar o número de células perdidas pela entrega do pulso elétrico. Por último, uma variação adicional de que o experimento foi realizado para determinar se as incubações 30 min a 37 ° C em 1 ml de LB após a electroporação, mas antes do plaqueamento em placas de LB-agar que afectam a recuperação de células transformadas. unidades formadoras de colônia (CFUs) foram enumerados no dia seguinte. Para esta experiência utilizou-pUC18, um plasmídeo de laboratório comuns, e os lotes de bactérias competentes consistindo de umpproximately 10 8 CFU para células preparadas utilizando o método tradicional e 10 7 CFU para células preparadas utilizando o protocolo rápido. Eletroporação sozinho (sem DNA) reduziu UFC viáveis ​​por 10-100 vezes, independentemente do método utilizado para preparar as células electrocompetentes. Como mostrado na Tabela 1, o rendimento era transformante na 10 6 -10 7 CFU / ug de ADN gama de três experiências em replicado (desvios padrão entre parêntesis) para E. coli (DH5a) e V. cholerae (O395), respectivamente, utilizando o método tradicional, mais longas para a preparação de células electrocompetentes. Rendimento transformante apareceu diminuiu de 10 vezes a 10 5 a 10 6 UFC / mg de DNA em três experimentos replicados (desvio padrão entre parênteses) para E. coli e V. cholerae, respectivamente, usando o método rápido. Por essa razão, determinou a percentagem de bactérias transformadas pela divisão UFC transformadospelo número de UFCs recuperado de &quot;transformações&quot; simulados (sem plasmídeo) de lotes idênticos de células competentes. A percentagem de bactérias transformadas foi dentro de um log (2,5-9,4%), independentemente do método de preparação e as espécies transformadas (Tabela 1 Os números entre parênteses). Estes resultados sugerem que a eficiência do método rápido é comparável ao do processo tradicional de preparação demorado células competentes e que as estirpes representativas de Vibrio cholerae e Escherichia coli são igualmente receptivo ao processo rápido. Descobrimos que a eficácia de transformação, para os plasmídeos tais como pUC18 abrigando cassetes β-lactamase, não é afectada pelo tempo de recuperação de 30 minutos em meio líquido LB. O mesmo número de transformantes foi recuperada se as células em placas de agar LB na presença de ampicilina directamente, após a electroporação, ou se podiam um tempo de recuperação de 30-45 minem caldo LB a 37 ° C antes de plaqueamento. Nossos resultados que ampicilina-resistência não exige conseqüência sob condições não-seletivos sugere que a expressão β-lactamase ocorre suficientemente rápido sobre transformação. No entanto, deve notar-se que foram realizadas diluições em série de bactérias pulsados ​​em caldo LB, o que pode ter contribuído para a recuperação do choque eléctrico e iniciar a expressão do gene. <img alt="Figura 1" src="/files/ftp_upload/50684/50684fig1.jpg" /> Figura 1. Representação gráfica da metodologia para a preparação rápida de bactérias electrocompetentes. Após 4-6 horas (dependendo da densidade do inóculo) um número suficiente de bactérias pode ser recolhido para levar a cabo as transformações 4-6 a partir de uma única placa de agar LB. Para segurar um número igual de células competentes para cada volume final a ser electroporado, bactérias recolhidas a partir da placa de agar LB foram inicialmente recolhidos e lavados juntos então aiiquoted em 40 volumes ul, dependendo do tamanho da pastilha (peletes maiores foram diluídos em volumes maiores divisível por 40 ul). <table border="1"><tbody><tr><td colspan="3"> Número de ADN transformantes / ug resistente à ampicilina (transformantes resistentes à ampicilina recuperada [%]) </td></tr><tr><td> Tensão </td><td> Método tradicional </td><td> Método rápido </td></tr><tr><td> E. coli (DH5a) </td><td> 2,3 x 10 6 (± 7,3 x 10 5) [9,4%] </td><td> 3 x 10 6 (± 7,1 x 10 5) [2,5%] </td></tr><tr><td> V. cholerae (O395) </td><td> 4 x 10 7 (± 1,7 x 10 7) [5%] </td><td> 6,7 x 10 5 (± 2,1 x 10 5) [3,3%] </td></tr></tbody></table> Tabela 1. A eficiência de transformação por micrograma de ADN (pUC18) de electrocompetentes bacteria preparado pelo método tradicional em comparação com o método rápido. Todas as transformações foram realizadas com 500 ng de pUC18 DNA (~ 80% do ADN super-enrolado, como visualizado através de electroforese em gel de agarose a 1%) e as células electroporadas foram diluídas em série de 10 vezes em caldo LB antes do plaqueamento para CFU em LB-ágar com antibióticos. Controles de bactérias não-eletroporados e de bactérias eletroporados sem plasmídeo, diluído em série e semeadas em agar LB sem antibióticos foram realizados para cada conjunto de transformações para determinar o número total de bactérias viáveis ​​antes e depois de pulsar. Os controles eletroporados representou a linha de base para a porcentagem de bactérias viáveis ​​transformados com sucesso.

A electroporação é um método vulgarmente utilizado para a introdução de ADN em bactérias, num processo conhecido como transformação. Protocolos tradicionais para a preparação de células electrocompetentes são demorados e trabalhosos. Este artigo descreve uma alternativa, rápida e eficiente método para a preparação de células electrocompetentes atualmente empregadas por alguns laboratórios.

Protocolo Rápido para Preparação de electrocompetentes<em&gt; Escherichia coli</em&gt; E<em&gt; Vibrio cholerae</em

Electroporation has become a widely used method for rapidly and efficiently introducing foreign DNA into a wide range of cells. Electrotransformation has ...

O objetivo geral deste procedimento é gerar bactérias competentes de forma rápida e conveniente no mesmo dia. Elas são necessárias para a transformação. Isso é realizado primeiramente plaqueando as bactérias em ágar LB e incubando-as por quatro a seis horas.Em seguida, a camada bacteriana é cuidadosamente colhida da superfície do ágar, e o pellet é ressuspenso em água fria estéril ou tampão. Então, o pellet bacteriano é lavado três vezes a quatro graus Celsius e ressuspenso em 40 microlitros. Por fim, as células competentes são eletroporadas na presença de DNA.No final, podem ser obtidos resultados que demonstram níveis de transformação bacteriana comparáveis aos obtidos pelo método tradicional, que exige equipamentos consideráveis, grandes volumes de culturas bacterianas e tampões estéreis. A principal vantagem desta técnica em relação aos métodos existentes é que bactérias competentes frescas podem ser preparadas praticamente a partir de qualquer linhagem de laboratório no mesmo dia em que a transformação está planejada, sem necessidade de centrífugas grandes, rotores ou grandes quantidades de tampões e culturas estéreis. Geralmente, indivíduos novos nesta técnica não terão muita dificuldade, pois esta é apenas uma variação simplificada de técnicas comumente empregadas em laboratórios de bacteriologia. O idealizador deste protocolo não pode ser identificado, pois ele tem sido usado e otimizado por inúmeros pesquisadores ao longo do tempo.O método apresentado aqui tem sido utilizado em nossos laboratórios por quase duas décadas, e nosso objetivo é compartilhar este protocolo útil com nossos colegas. A demonstração visual deste método é importante para uma etapa em particular: especificamente, a coleta de bactérias do gramado na hélice, pois é necessário um olhar experiente para avaliar o crescimento na placa.E isso é melhor visualizado. Demonstrando o procedimento está a Sra. Theresa Brooks, assistente de pesquisa do laboratório da Dra. Te Koski na Universidade de Alberta, em Edmonton, Canadá. Para iniciar a preparação do cultivo bacteriano no final da tarde, utilize uma pequena quantidade de e coli ou v coray para inocular de um a cinco mililitros de caldo LB autoclavado em tubos de ensaio estéreis de vidro de borossilicato.Coloque os tubos de ensaio inoculados em um agitador rotativo e incube durante a noite a 37 graus Celsius e alta velocidade. Prepare um espalhador celular em formato de taco de hóquei a partir de uma haste de vidro aquecendo o centro da haste na chama de um bico de Bunsen até que o vidro amacie. Em seguida, use pinças ou alicate para suavemente moldar a curvatura em um ângulo de 135 graus.Aqueça a haste mais uma vez no ponto médio entre a extremidade e a primeira dobra e dobre-a em um ângulo de 45 graus para dentro. Prepare lb agitado com e sem antibióticos e armazene a quatro graus Celsius. Na manhã seguinte.Plaque 100 microlitros de cultura de crescimento prolongado em cada placa de ágar LB. Usando o espalhador celular, incube a placa a 37 graus Celsius por quatro a seis horas ou até que uma fina camada uniforme de crescimento bacteriano fique visível. Usando um alça de inoculação, retire uma massa bacteriana com cerca de dois milímetros de diâmetro da placa e ressuspenda-a em um mililitro de água gelada.Cloreto de cálcio 2 milimolar. Se estiver usando água destilada duplamente estéril para E. coli, em uma centrífuga refrigerada ajustada a quatro graus Celsius, centrifugue a suspensão por cinco minutos a 5.000 ×g. Descarte o sobrenadante e repita a lavagem mais duas vezes. Após a remoção do último sobrenadante, ressuspenda o pellet em 40 microlitros de cloreto de cálcio ou água destilada duplamente e mantenha no gelo.Para realizar uma transformação, adicione até um micrograma de DNA plasmidial à suspensão bacteriana de 40 microlitros e transfira a mistura para uma câmara estéril pré-resfriada de 0,2 centímetros de afastamento. Em seguida, insira a cubeta na câmara de eletroporação do módulo de controle de pulsos e aplique um choque elétrico de 1,8 quilovolts e 25 microfarads. A constante de tempo deve ser de aproximadamente 5,0 milissegundos e não deve ocorrer arco elétrico.Re-suspenda rapidamente as células em um mililitro de caldo LB e transfira para um tubo de ensaio de vidro previamente autoclavado. Deixe as células recuperarem mediante incubação em condições de crescimento aerado a 37 graus Celsius por 30 minutos, sem seleção com antibiótico. Plaque as bactérias em placas de ágar LB com antibiótico e incube a 37 graus Celsius durante a noite.Como mostrado aqui, realizamos um conjunto de transformações com E. coli e V. corray para comparar a eficiência de transformação de nossa metodologia rápida com uma adaptação do método tradicional originalmente descrito por Doer et al. para o preparo de bactérias eletrocompetentes. O rendimento de transformantes esteve na faixa de 10 à sexta até 10 à sétima UFCs por micrograma de DNA em três experimentos replicados para E. coli e V. corray, utilizando o método tradicional para eletrocompetência.Na preparação das células, o rendimento de transformantes apresentou uma diminuição dez vezes maior, de 10 à quinta, a 10 à sexta UFCs por micrograma de DNA em três experimentos replicados para E. coli e V. coralyticus utilizando o método rápido. Por esse motivo, determinamos a porcentagem de bactérias transformadas dividindo as UFCs transformadas pelo número de UFCs recuperadas a partir de transformações simuladas (mock) provenientes de lotes de células competentes de modo idêntico. A porcentagem de bactérias transformadas esteve dentro de uma ordem de grandeza.Independentemente do método de preparação e da espécie transformada. Esses resultados sugerem que a eficiência do método rápido é comparável à do procedimento tradicional mais demorado de preparação de células competentes, e que as cepas representativas de ieo, coray e esia coli são igualmente suscetíveis ao procedimento rápido. Uma vez dominada, esta técnica pode ser realizada em cinco a seis horas, quando executada corretamente.Ao realizar este procedimento, é importante lembrar de colher as bactérias durante a fase logarítmica de crescimento, lavá-las em solução estéril de água tamponada, recém-preparada e previamente resfriada, e mantê-las frias até o re-suspendimento em LB após a eletroporação. Após assistir a este vídeo, você deverá ter uma boa compreensão de como gerar rapidamente células eletrocompetentes específicas de cepas bacterianas em seu laboratório, cultivando-as em gramado inicial, coletando-as durante a fase logarítmica de crescimento e, em seguida, lavando-as em tampão frio em preparação para a eletroporação.

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Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

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Preparação de células de enxame de Vibrio parahaemolyticus para imagem

Fonte: Kuo, C., et al. Detecção de colonização entero-hemorrágica por Escherichia coli em hospedeiro murino por sistema de bioluminescência in vivo não invasivo. J. Vis. Exp. (2018)Este vídeo demonstra a preparação de uma suspensão de Escherichia coli entero-hemorrágica que expressa luciferase a partir de estoque congelado para uso como inóculo oral em modelos animais. Isso permite o rastreamento bioluminescente em tempo real da colonização intestinal durante estudos de infecção in vivo.

Preparação de inóculo de Escherichia coli enterohemorrágica bioluminescente

Fonte: Figueroa, D. M., et.al. Produção e visualização de esferoplastos e protoplastos bacterianos para caracterizar a localização de peptídeos antimicrobianos. J. Vis. Exp. (2018)Este vídeo demonstra a produção de esferoplastos de Escherichia coli inibindo primeiro a divisão celular para induzir a filamentação, seguida pela digestão enzimática da parede celular. O processo inclui a adição controlada de um agente quelante, DNase, e um estabilizador osmótico para garantir a formação e...

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