Protocolo Rápido para Preparação de electrocompetentes Escherichia coli E Vibrio cholerae

O objetivo geral deste procedimento é gerar bactérias competentes de forma rápida e conveniente no mesmo dia. Eles são necessários para a transformação. Isso é feito primeiro colocando as bactérias em ágar LB e incubando-as por quatro a seis horas.

Em seguida, o gramado bacteriano é cuidadosamente colhido da superfície do ágar e o pellet é ressuspenso em água fria estéril ou tampão. Em seguida, o pellet bacteriano é lavado três vezes a quatro graus Celsius e ressuspenso em 40 microlitros. Finalmente, as células competentes são eletroporadas na presença de DNA.

Em última análise, podem ser obtidos resultados que mostram níveis de transformação bacteriana comparáveis aos obtidos pelo método tradicional que requer equipamentos consideráveis, grandes volumes de culturas bacterianas e tampões estéreis. A principal vantagem dessa técnica sobre os métodos existentes é que bactérias frescas e competentes podem ser preparadas virtualmente a partir de qualquer cepa de laboratório no mesmo dia em que a transformação é planejada, sem a necessidade de grandes centrífugas, rotores ou líderes de tampões e culturas estéreis. Geralmente, os indivíduos novos neste método não terão muita dificuldade porque esta é apenas uma variação de atalho das técnicas comumente empregadas em laboratórios de bacteriologia. O criador deste protocolo não pode ser identificado, pois foi usado e otimizado por vários pesquisadores ao longo do tempo.

O método aqui apresentado tem sido usado em nossos laboratórios por quase duas décadas, e é nosso objetivo compartilhar esse protocolo útil com nossos pares. A demonstração visual desse método é importante para uma etapa. Em particular, a coleta de bactérias do gramado na broca porque é preciso um olho experiente para avaliar o crescimento na placa.

E isso é melhor visualizado. Demonstrando o procedimento está a Sra. Theresa Brooks, assistente de pesquisa do laboratório do Dr. Te Koski na Universidade de Alberta em Edmonton, Canadá. Para iniciar a preparação da cultura bacteriana no final da tarde, use uma pequena quantidade de e coli ou v coray para inocular de um a cinco mililitros de caldo LB em tubos de ensaio de vidro de silicato bo estéreis.

Coloque os tubos de ensaio inoculados em um tambor de rolos e incube durante a noite a 37 graus Celsius e alta velocidade. Prepare um espalhador de células na forma de um taco de hóquei a partir de uma haste de vidro, aquecendo o meio da haste na chama de um bico de bunsen até que o vidro amoleça. Em seguida, use uma pinça ou alicate para direcionar suavemente a curva em um ângulo de 135 graus.

Aqueça a haste mais uma vez no ponto médio entre a extremidade e a primeira dobra e dobre-a em um ângulo de 45 graus para dentro. Prepare lb arejado com e sem antibióticos e armazene a quatro graus Celsius. Na manhã seguinte.

Coloque 100 microlitros de cultura durante a noite em cada placa de ágar LB. Usando o espalhador de células, incube a placa a 37 graus Celsius por quatro a seis horas ou até que um gramado fino de crescimento bacteriano se torne visível. Usando uma alça de inoculação, colha uma massa bacteriana de cerca de dois milímetros de diâmetro da placa e suspenda-a em um mililitro de gelo frio.

Cloreto de cálcio de dois milimolares. Se estiver usando v coray ou água estéril duplamente destilada para e coli usando uma centrífuga refrigerada regulada para quatro graus Celsius, gire a suspensão por cinco minutos a 5.000 Gs. Descarte o sobrenadante e repita a lavagem mais duas vezes. Depois de remover o resus sobrenadante final, suspenda o pellet em 40 microlitros de cloreto de cálcio ou água duplamente destilada e mantenha no gelo.

Para realizar uma transformação, adicione até um micrograma de DNA plasmático à suspensão bacteriana de 40 microlitros e transfira a mistura para uma lacuna estéril pré-resfriada de 0,2 centímetro. Vete, insira o vete na câmara de eletroporação do módulo de controle de pulso e coma a 1.8 quilovolts e 25 micro phs. A constante de tempo deve ser de cerca de 5,0 milissegundos e nenhum arco deve ocorrer.

Ressuspenda rapidamente as células em um mililitro de caldo LB e transfira para um tubo de ensaio de vidro grelhado previamente autoclave. Permita que as células se recuperem incubando sob condições de crescimento aerado a 37 graus Celsius por 30 minutos sem seleção de antibióticos. Coloque as bactérias em placas LB ager com antibiótico e incube a 37 graus Celsius durante a noite.

Como mostrado aqui, realizamos um conjunto de transformações com e coli e V co array para comparar a eficiência de transformação de nossa metodologia rápida com uma adaptação do método tradicional originalmente descrito por Doer et al para a preparação de bactérias eletrocompetentes. O rendimento transformante estava entre 10 do sexto a 10 do sétimo UFC por micrograma de DNA em três experimentos replicados para e coli e v coray. Usando o método tradicional de eletrocompetência.

Na preparação celular, o rendimento transformante pareceu diminuir dez vezes para 10, para o quinto, para 10 para o sexto UFC por micrograma de DNA em três experimentos repetidos para e coli e v coray usando o método rápido. Por esse motivo, determinamos a porcentagem de bactérias transformadas dividindo as UFC transformadas pelo número de UFC recuperadas de transformações simuladas de lotes idênticos de células competentes. A porcentagem de bactérias transformadas estava dentro de um log.

Independentemente do método de preparação e das espécies transformadas. Esses resultados sugerem que a eficiência do método rápido é comparável à do procedimento tradicional mais demorado de preparação de células competentes, e que as cepas representativas de ieo, coray e esia coli são igualmente passíveis do procedimento rápido. Uma vez dominada, essa técnica pode ser feita dentro de cinco a seis horas, executada corretamente.

Ao tentar este procedimento, é importante lembrar de colher as bactérias durante sua fase logarítmica de crescimento, lavá-las em solução de água tampão estéril, recém-preparada e pré-resfriada e mantê-las frias até ressuspenderem em LB após a eletroporação. Depois de assistir a este vídeo, você deve ter um bom entendimento sobre como gerar rapidamente células específicas de cepas bacterianas eletrocompetentes em seu laboratório, cultivando-as no gramado inaugural, coletando-as durante a fase logarítmica de crescimento e, em seguida, lavando-as em tampão frio em preparação para eletroporação.